Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Summary

Protokolle zur Untersuchung der Dynamik von Chloroplastenstromuli, den stromagefüllten Tubuli, die sich von der Oberfläche der Chloroplasten erstrecken, werden beschrieben.

Abstract

Stromuli oder "stromagefüllte Tubuli" sind schmale, röhrenförmige Fortsätze von der Oberfläche des Chloroplasten, die universell in Pflanzenzellen beobachtet werden, deren Funktionen jedoch rätselhaft bleiben. Neben der wachsenden Aufmerksamkeit für die Rolle von Chloroplasten bei der Koordination von Pflanzenreaktionen auf Stress hat das Interesse an Stromulen und ihrer Beziehung zur Dynamik der Chloroplasten-Signalgebung in den letzten Jahren zugenommen, unterstützt durch Fortschritte in der Fluoreszenzmikroskopie und Proteinfluorophore, die eine schnelle und genaue Visualisierung der Stromulendynamik ermöglichen. Hier stellen wir detaillierte Protokolle zur Verfügung, um die Stromulenfrequenz in den epidermalen Chloroplasten von Nicotiana benthamiana zu testen, einem hervorragenden Modellsystem zur Untersuchung der Biologie von Chloroplastenstromula. Wir bieten auch Methoden zur Visualisierung von Chloroplastenstromulen in vitro an, indem wir Chloroplasten aus Blättern extrahieren. Schließlich skizzieren wir Stichprobenstrategien und statistische Ansätze, um Unterschiede in den Stromule-Frequenzen als Reaktion auf Stimuli wie Umweltstress, chemische Behandlungen oder Gen-Silencing zu analysieren. Forscher können diese Protokolle als Ausgangspunkt nutzen, um neue Methoden für innovative Experimente zu entwickeln, um zu erforschen, wie und warum Chloroplasten Stromulen bilden.

Introduction

Chloroplasten sind dynamische Organellen in Pflanzenzellen, die für die Photosynthese und eine Vielzahl anderer Stoffwechselprozesse verantwortlich sind. Die Signalwege des Chloroplasten haben ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf die Physiologie und Entwicklung der Pflanzen und koordinieren die Reaktionen der Pflanzen auf Umweltstress, Krankheitserreger und sogar die Blattform^1-6. In jüngster Zeit haben Biologen Interesse an einem wenig verstandenen Aspekt der Chloroplastenstruktur geweckt: Stromuli, sehr dünne, mit Stroma gefüllte Tubuli, die sich von der Oberfläche des Chloroplasten⁷ erstrecken.

Die biologische....

Protocol

HINWEIS: Für dieses Protokoll haben wir auf Testen Stromulus Frequenz in der Epidermis von N. fokussiert benthamiana verlässt. Mehrere stabile transgene Linien erzeugt worden , die für diesen Zweck verwendet werden können, einschließlich 35S _PRO: FNRtp: EGFP ¹³ und NRIP1: Cerulean ^6. Beide Linien zeigen robuste Expression von Fluorophoren in den Chloroplasten Stroma der Blätter unter einer Vielzahl von Bedingungen gewachsen. Alternativ Chloroplasten-bezogene Fluorophore transient in N. ausgedrückt werden kann benthamiana unter Verwendung von Agrobacterium - Transformatione....

Results

Dieses Protokoll wurde verwendet , Stromulus Frequenz am Tag sichtbar zu machen und in der Nacht in den Kotyledonen der jungen N. benthamiana Sämlinge. Scheiben von einem z- Stapel wurden in einem einzigen Bild (Abbildung 1A) verschmolzen. Zur visuellen Zwecken wurde das Bild dann entsättigt und invertiert , so daß Stroma erscheint schwarz (1B). Die Chloroplasten wurden beschriftet entweder als keine stromules mit (grüner Stern) oder mi.......

Discussion

Wenn stromules untersuchen, drei wichtige Faktoren müssen in allen in Betracht gezogen werden: (i) Manipulation des Pflanzengewebes muss auf ein absolutes Minimum beschränkt werden, (ii) das experimentelle System muss konsistent gehalten werden, und (iii) Probenahmestrategien sorgfältig geplant werden müssen, um sicherzustellen, robust, sind reproduzierbare Daten analysiert.

Stromules sind bemerkenswert dynamisch: sie, bevor ein Beobachter die Augen unter dem Mikroskop schnell ein- und ausfa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbit	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Carl Zeiss Inc	Modell: LSM710
Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethylsulfoxid (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring Mixer	Waring	Modell: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-Source-Software zur Analyse biologischer Bilder