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Methodenartikel

Neuropharmakologische Manipulation von Verhaltene und Free-Fliegen-Honig-Bienen,

9.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/54695

⸱

26. November 2016

 ,  ,  , 
1Department of Science and Mathematics, Volda University College, 2Department of Biology, Washington University in St. Louis, 3Department of Biological Sciences, Macquarie University, 4Department of Biology, University of Konstanz, 5Research Center on Animal Cognition, CNRS, Universite de Toulouse

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt mehrere Protokolle für pharmakologische Mittel zur Verabreichung von Honigbienen, einschließlich einfacher nicht-invasive Methoden zur freifliegenden Bienen, sowie mehr invasive Varianten, die eine präzise lokalisierte Behandlung von zurückhaltender Bienen ermöglichen.

Zusammenfassung

Honigbienen zeigen erstaunliche Lernfähigkeiten und fortschrittliche Sozialverhalten und Kommunikation. Außerdem ihr Gehirn ist klein, leicht zu visualisieren und zu untersuchen. Aus diesem Grund haben die Bienen schon lange ein beliebtes Modell unter Neurobiologie und Neuroethologen für die neuronalen Grundlagen der sozialen und natürlichen Verhalten zu studieren. Es ist jedoch wichtig, dass die experimentellen Techniken Bienen zu studieren interferieren nicht mit dem Verhalten untersucht. Aus diesem Grund war es notwendig, eine Reihe von Techniken für die pharmakologische Manipulation von Honigbienen zu entwickeln. In diesem Beitrag zeigen wir Methoden zur Behandlung von zurückhaltender oder frei fliegenden Honigbienen mit einem breiten Spektrum von pharmakologischen Wirkstoffen. Dazu gehören sowohl nicht-invasive Methoden wie orale und topische Behandlungen, sowie mehr invasive Methoden, die entweder systemisch oder lokalisierte Art und Weise für präzise Medikamentenabgabe zu ermöglichen. Schließlich diskutieren wir die Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden und beschreibengemeinsame Hürden und wie man sie am besten überwinden. Wir schließen mit einer Diskussion über die Bedeutung der experimentellen Methode auf die biologischen Fragen der Anpassung und nicht umgekehrt.

Einleitung

Seit Karl von Frisch ihre Tanzsprache aufgeklärt 1, Honigbienen sind eine populäre Studie Arten für die Forscher das Verhalten der Tiere und der Neurobiologie geblieben. In den letzten Jahren an der Schnittstelle zwischen diesen beiden Bereichen und mehreren anderen Disziplinen (zB Molekularbiologie, Genomik und Informatik) haben neben ihnen entstanden entstanden eine Vielzahl von neuen Disziplinen. Dies hat zu einer raschen Entwicklung neuer Theorien und Modelle für das Verständnis, wie das Verhalten von Aktivität führt innerhalb des Nervensystems. Aufgrund der einzigartigen Lebensstil, reiche Verhaltensrepertoire und Leichtigkeit der experimentellen und pharmakologische Manipulation, Bienen haben an der Spitze dieser Revolution blieb.

Honigbienen werden verwendet neurobiologischen Grund Fragen zu untersuchen, wie die zugrunde liegenden Lernen und Gedächtnis 2,3, Entscheidung 4 zu machen, Riech 5 oder visuelle Verarbeitung 6. In den letzten Jahren die hon11, schlafen 12, Alterung 13 oder die zugrunde liegenden Mechanismen der Anästhesie 14 - ey Biene hat für die medizinische Forschung, wie die Auswirkungen von Suchtmitteln im Allgemeinen reserviert sogar bereits 7 für das Studium Themen als Modell verwendet.

Im Gegensatz zu den klassischen genetischen Modellorganismen (zB D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), gibt es nur sehr wenige genetische Werkzeuge zur Verfügung , für die Manipulation von neuronalen Funktionen in Honigbienen, obwohl dies derzeit 15 ändern. Stattdessen haben Studien Honigbiene in erster Linie auf pharmakologische Manipulationen verlassen. Dies war sehr erfolgreich; jedoch ist die Vielfalt der Bienenforschung, so dass eine Reihe von Methoden für die pharmakologische Verabreichung benötigt werden. Forschung mit Honigbienen befasst sich sehr unterschiedliche Fragen, wird von Forschern aus verschiedenen Disziplinen und Hintergründe untersucht und verwendet eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen. Viele ReseBogen Fragen erfordern Bienen entweder frei fliegenden sein, frei in ihrer Kolonie interagieren, oder beides. Dies kann es den Überblick über einzelne Versuchstiere machen schwer zu halten und macht Zurückhaltung oder Kanülierung nicht machbar.

Um die Vielfalt von Bienenforschung aufzunehmen, eine Vielzahl von Drug-Delivery-Methoden benötigt werden, so dass für eine robuste und flexible Verwaltung, während sichergestellt wird, dass die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Profile, Invasivität des Verfahrens und seine Zuverlässigkeit, das Paradigma in Frage entsprechen. Aufgrund dieser unterschiedlichen Bedürfnisse haben die meisten Forschungsgruppen ihre eigenen einzigartigen Wirkstoffverabreichung Methoden entwickelt. Bisher hat dies eine Stärke der Bienenforschungsgemeinschaft gewesen; für die Verabreichung desselben Arzneimittels in verschiedenen Umständen es ermöglicht die Entwicklung von Anordnungen von Methoden geführt. Unser Ziel ist es nicht ein einziges standardisiertes Verfahren für die pharmakologische Manipulationen von Bienen zu entwickeln, sondern Methoden zu betonen, dasshaben sich als besonders erfolgreich zu sein, und helfen den Forschern übernehmen diese. Wir diskutieren die grundlegenden Prinzipien, wie sie arbeiten, sowie ihre Vor- und Nachteile.

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Protokoll

1. Drug Administration für Harnessed Bees

  1. orale Behandlung
    1. Bereiten 1,5 M Sucrose-Lösung durch Mischen von 257 g Saccharose mit 500 ml Wasser (es ist leichter, diese Menge an Sucrose aufzulösen in siedendem Wasser). Speichern von Saccharoselösung bei 4 ° C bis zur Verwendung.
      HINWEIS: Saccharose-Lösung bietet eine sehr gastfreundliche Umgebung für bestimmte Mikroorganismen und somit wird leicht kontaminiert und ungenießbar für Bienen. Bulk Saccharoselösung kann bei -20 ° C bis zur Verwendung in Aliquots aufgeteilt und gespeichert werden.
    2. Entscheiden Sie sich für eine angemessene Medikamentendosis (wie es zu erreichen, in der Diskussion Abschnitt weiter unten gerichtet ist), und bereiten eine Lösung , so dass die bevorzugte Arzneimitteldosis in 20 & mgr; l Saccharose - Lösung aufgelöst wird (zB zu liefern 20 ug, verdünnte Arzneimittel bei einem Verhältnis von 1 mg / ml). Harness Bienen nach Felsenberg et al. (2011) 16. Führen Sie diesen Schritt mindestens 12 Stunden vor der medikamentösen Behandlung, um sicherzustellen, dass die Bienen nicht mehr gestresst out aus nutzbar zu machen, wenn die Arzneimittellösung präsentiert wird.
      HINWEIS: Weitere konsistente Ergebnisse, ist es am besten Bienen verhungern (von spannte Bienen bei 34 ° C in einem Inkubator platziert und 70% Luftfeuchtigkeit) O / N.
    3. Mit Hilfe einer Mikropipette, berühren Sie einen Tropfen 1,5 M Saccharose Wasser auf die Antenne eines spannte Biene. Wenn der Rüssel verlängert wird, berühren Sie einen 20 & mgr; l Tröpfchen von 1,5 M Saccharose das Medikament direkt an den Rüssel der Biene enthält. Stellen Sie sicher, dass die Biene alles verbraucht. Als Kontrolle Fahrzeug 1,5 M Saccharose-Lösung ohne Zusatz von Drogen.
      HINWEIS: Die Menge an Saccharose-Lösung müssen möglicherweise basierend auf experimentellen Pläne angepasst werden. Wenn appetitive Anlage bestimmt ist, werden die Bienen Fütterung kurz vor dem Training mit Bienen Ansprechbarkeit stören.
    4. Entsorgen oder beiseite Bienen, die nicht alle der Saccharose verbrauchen.
      HINWEIS: Wenn eine große Anzahl von Bienen nicht die Saccharoselösung zu trinken, kann die Fütterung Zeitplan angepasst werden müssen.
  2. Injektion in den Thorax
    1. Bereiten Sie Droge in Honigbiene 17 Ringer wie folgt:
      1. Mischen und Autoklaven 7,45 g NaCl, 0,448 g KCl, 0,812 g MgCl 2, 0,735 g CaCl 2, 54,72 g Saccharose, 4,95 g D-Glucose und 2,48 g HEPES in 1000 ml Wasser. Seien Sie vorsichtig, wenn Ringer Lagerung, da es leicht kontaminiert ist. Aliquotieren und lagern Ringer bei -20 ° C bis zur Verwendung.
      2. Man löst den Wirkstoff in Ringer-Lösung und dann verdünnt, so daß die gewünschte Menge in 5 & mgr; l vorhanden ist. Als ein Beispiel, wenn Bienen mit 5 ug eines Arzneimittels behandelt werden sollen, 1 g kann zunächst in 1 ml in Ringer gelöst werden, bevor 1 verdünnt wird: für eine endgültige Lösung von 1 ug / ul 1,000 in Ringer.
        HINWEIS: Alternativ können kommerziell erhältliche PBS (Phosphat-gepufferte Salin) kann anstelle von Ringer-Lösung verwendet werden.
    2. Machen Sie eine microscalpel durch die Ecke eines zweischneidigen Rasierklinge abbrach miteinen Klingenhalter. Bringen Sie das Messer Fragment an einem Messerhalter so, dass es eine schöne Klinge mit einem scharfen Endpunkt macht.
    3. knapp über dem Scutellum, neben dem hinteren Flügel Prozess eines Bienen Thorax unter einem Stereomikroskop, verwenden Sie sorgfältig die microscalpel ein Loch von 2 mm zu schneiden. Vermeiden Sie zu tief schneiden, da dies Flugmuskeln verletzen, und achten Sie darauf, die Flügel Scharniere zu vermeiden. Idealerweise schneiden nur drei Seiten, so dass die Klappe der Kutikula später gefaltet werden, um die Stelle der Verletzung zu schließen zurück.
    4. Mit Hilfe einer Mikropipette, Kaution 5 μlL Ringer (oder PBS), um das Medikament auf dem Loch im Brustkorb enthält. Sorgfältig unter dem Mikroskop überwachen die gesamte Tropfen in der Hämolymphe absorbiert wird, um sicherzustellen. Verwenden Ringer (oder PBS) als Fahrzeugsteuerung.
    5. Wenn möglich, bewegen Sie die Kutikula Klappe wieder über das Loch. Nach 5-10 Stunden wird wieder anbringen und abdichten.
      HINWEIS: Als Alternative zu dieser Technik injizieren 1 & mgr; l direkt in den Brustkorb mit einer Glasspritze, nach einem Öffnen small Loch in der Mitte der frenum (Querlinie im hinteren Bereich des Scutellum) mit einer Injektionsnadel (Durchmesser: 0,6 mm, G: 23). Dies umgeht die Notwendigkeit, zuerst den Thorax mit einem Skalpell und der Injektionsstelle geschnitten ist kleiner, aber dieses Verfahren wird verlassen ausgesetzt, um die Injektionsstelle.
  3. Ocellus Injektion
    Hinweis: Dies ist ein Verfahren, geeignet für Moleküle über die Kopfkapsel, in die Hämolymphe zu liefern.
    1. Vorbereitung Medikamente wie in 1.2.1, aber justieren Arzneimittelkonzentrationen so dass die gewünschte Dosis wird in 1 ul Ringer oder PBS enthalten sein (weniger Volumen kann durch die ocellus Loch absorbiert werden, als durch den Thorax).
    2. Bereiten Sie eine microscalpel wie in 1.2.2. Unter einem Stereomikroskop, sperren Sie den Kopf eines spannte Biene an Ort und Stelle durch den Hals Spalt mit Wachs gefüllt wird. Verwenden Sie bei niedriger Temperatur schmelzendes Wachs (zB Dentalwachs), um schädliche antennal Geruchsrezeptoren oder andere Zellen zu vermeiden , dass ich sein kannmportant Verhalten für die Bewertung (zB olfaktorischen Lernen). Dann vorsichtig die Linse des Median ocellus entfernen, indem die Spitze des microscalpel unter der Linse einsetzen und vorsichtig die Linse frei von der Kopfkapsel brechen.
      HINWEIS: Es ist auch möglich, Wachs vorsichtig über die Antennen zu platzieren Bewegung zu verhindern.
    3. Sorgfältig pipettieren Droge auf die ocellus Loch. Warten Sie, bis alle in die Kopfkapsel genommen wird. Entfernen Zahn Wachs von den Antennen und lassen Sie die Biene für eine Weile ruhen, bevor Sie das experimentelle Verfahren fortgesetzt wird. Verwenden Ringer (oder PBS) als Fahrzeugsteuerung.
  4. Die Injektion in den ocellar - Darm - Trakt
    HINWEIS: Die ocellar - Darm - Trakt große Fasern enthält, zu den meisten Regionen des zentralen Gehirns verbindet 18. Diese Behandlungsmethode ermöglicht nur Verbindungen an das Gehirn Anwendung, aber nicht spezifische Teilbereiche des Gehirns Targeting.
    1. Bereiten Sie Biene wie in 1.3.2. und entfernen Sie die Linse des Median ocellus mit dem tip eines microscalpel wie in 1.3.3.
      ANMERKUNG: Dies kann bis zu 2 Stunden vor der Injektion durchgeführt werden. Basierend auf unserer Erfahrung sind gefüttert Bienen besser in der Lage mit dieser Operation als verhungert Bienen zu bewältigen
    2. Füllen Sie eine 10 & mgr; l - Glasspritze mit einem kleinen Messgerät ausgestattet (zB 33, Durchmesser: 210 & mgr; m) Nadel mit Wirkstofflösung wie in 1.3.1 bereit.
    3. Mit Hilfe eines manuellen Mikromanipulator, legen Sie die Spritzenspitze durch die ocellar Retina in die Kopfkapsel bis zu einer Tiefe von 50 & mgr; m und 250 nl der Lösung zu injizieren.
    4. Nach dem Gebrauch der Spritze spülen 3 mal mit destilliertem Wasser, dann 3-mal mit 75% Ethanol.
  5. Mikroinjektion in bestimmten Gehirnstrukturen
    HINWEIS: Zusätzlich zu den systematischen Behandlungen oben erwähnt, ist es möglich, Mikroinjektionen in bestimmten Hirnstrukturen durchzuführen. Dies ermöglicht eine pharmakologische Manipulation von einem oder mehreren Hirnregionen, während andere unbeeinflußt bleibt. Das funktioniertam besten mit Hirnregionen, die leicht von der vorderen Hirnoberfläche zu erkennen (zB Antennalloben, Pilzkörper Kelche oder vertikale Lappen oder den optischen Loben), aber auch andere Regionen gezielt worden. Bitte beachten Sie, dass die Orientierung (anterior / posterior, dorsal / ventral) bezieht sich auf die Körperachse, sondern als auf die neuraxis 19.
    1. Bereiten Sie die Droge in Ringer oder PBS in der gleichen Weise wie in 1.2.1, Zugabe eines fluoreszierend (beispielsweise 0,5 mg / ml Dextran, Alexa 546 oder 568 fluor) oder nichtfluoreszierenden Farbstoff (beispielsweise 1 mM Methylenblau).
      HINWEIS: Die Zugabe eines Fluoreszenzfarbstoffs Überprüfung der Injektionsstelle ermöglichen wird, nachdem das Experiment vorbei ist (konfokale Mikroskopie, nach Gehirnsezierung), während nicht-fluoreszierende Farbstoffe während des Experiments die direkte Überwachung ermöglichen.
    2. Um Glaspipetten zur Injektion machen, Glas Kapillaren des richtigen Durchmesser in den Halter Klammern einer Elektrode Abzieher (1,0 mm für die Standard-Halteeinsatzer eingeschlossen für die Mikroinjektors in der Materialliste erwähnt). Stellen Sie Zug- und Heizstufen eine ca. 0,5 cm lange Spitze, um (Einstellungen werden für jeden Abzieher unterschiedlich sein, auch wenn das gleiche Modell verwendet wird).
      HINWEIS: Im Idealfall sind die beiden Pipetten gezogen von einem Glas sollte die gleiche Länge und Form aufweisen, so dass beide verwendet werden können.
    3. Unter einem Stereomikroskop, brechen die Spitzen einen Außendurchmesser von etwa 10 bis 15 & mgr; m, basierend auf der visuellen Abschätzung zu erhalten, unter Verwendung einer Skala auf einem Raster in das Okular eingefügt. Die Schritte auf der Skala werden vom Hersteller festgelegt und kann für das verwendete Vergrßerung korrigiert werden.
    4. Dann füllen die Glaspipetten mit der Lösung zu injizieren. Wenn Glaskapillaren mit Fäden verwendet werden, füllen Sie die Pipette durch die Rückseite in die Wirkstofflösung platzieren, sonst Spitze Micro Tipps mit zu füllen.
    5. Legen Sie die gefüllte Glaspipette in die Kapillare Inhaber eines Mikroinjektors, die durch eine manuelle oder elektronische mi gesteuert wirdcromanipulator.
    6. Kalibrieren Sie den Mikroinjektors das gewünschte Volumen zu injizieren (0,5-2 nl, abhängig von der Größe der Struktur des Gehirns gezielt). Hierzu injizieren direkt in eine kleine Petrischale Mineralöl enthält, und den Durchmesser des Tröpfchens mit dem graticule messen. Ändern Sie Einstellungen, bis die gewünschte Lautstärke erreicht ist.
    7. Befestigen Sie den Kopf eines spannte Biene mit weichen Dentalwachs wie in 1.3.2, bevor eine Öffnung in den vorderen Teil der Kopfkapsel eingeschnitten, sondern microscalpel verwenden, mit drei Schnitte: ein knapp unter dem Median ocellus (ventralen), eine an die Grenze des rechten oder linken Auge und eine über der Antenne stammt (dorsale). Verwenden Sie ein Stück Dentalwachs die geöffnete Klappe in Position zu halten.
    8. (Sehr dünne Membran um das Gehirn) über die gezielte Gehirnstruktur vorsichtig schieben Drüsen und der Trachea auf der Oberseite des Gehirns liegen beiseite feinen Pinzette, dann einen kleinen Bruch in die Neurilemm machen.
      HINWEIS: Wenn viele Bienen auf einmal behandelt werden, dieses Verfahrenkann früher durchgeführt werden; aber darauf achten, nicht die Bienen in diesem Zustand zu lange verlassen (nicht mehr als 30 min), als ihr Gehirn desiccate könnten.
    9. Legen Sie die Spitze in die Hirnregion gewünscht wird , und passen Tiefe senkrecht zur Hirnoberfläche (zB 60 & mgr; m für die Pilzkörper Kelche). Injizieren Sie die voreingestellte Lautstärke. Zur seitlichen Gehirnregionen, injizieren bilateral (dh tun eine Injektion zu jeder Hemisphäre). Wenn ein nicht-fluoreszierenden Farbstoff verwendet wird, stellen die aufgetreten Injektion im rechten Bereich auf Beobachtung, während die Injektion. Wenn ein fluoreszierender Farbstoff verwendet wird, das gleiche tun unter Fluoreszenzlicht ein Stereomikroskop mit einem Fluoreszenz-Beobachtungssystem verwendet wird.
    10. Danach legen Sie die offene Klappe wieder über den Kopf des Biene. Schmelzen eines Kristalls aus Eicosan, die etwa 1 mm im Durchmesser ist, einen dünnen Draht um die Spitze einer Mikro Lötkolben gewickelt unter Verwendung von (Schmelztemperatur ist 35-37 ° C) und die Schnitte abzudichten. Dies wird erheblich Sterblichkeit verringern.
    11. Befreit dasBiene aus dem Gurtzeug für Verhaltensanalyse (aber Diskussion sehen), oder für Experimente an zurückhaltender Bienen im Gurtzeug halten - zB Rüssel - Streckreflex (PER) Prüfung 20.
    12. Wenn ein fluoreszierender Farbstoff verwendet wurde, sicherzustellen , dass die Injektion den Bereich von Interesse getroffen , nachdem das Experiment vorbei ist ein konfokales Laser - Scanning - Mikroskop (Abbildung. 1).
      Hinweis: Dies ist besonders nützlich, wenn tiefere Hirnarealen Targeting (wo es schwierig wäre, nicht fluoreszierenden Farbstoff während der Injektionsphase zu sehen).

2. Drug Administration Methoden frei fliegende Bienen

  1. orale Behandlung
    1. Vorbereitung Medikament in der gleichen Weise wie in den Schritten 1.1.1-1.1.2. In Arzneimittellösung zu einem Zubringer und in den Kühlschrank für die Lagerung.
      Hinweis: Jeder Feeder tun wird, wie ein auf dem Kopf nach unten Flaschendeckel oder einem Glas auf Tissue-Papier invertiert.
    2. Zug Bienen zu einer Schwerkraftzuführung, die 1 M oder 0,5M Saccharoselösung durch eine Zuführung der Nähe des Bienenstocks platzieren. Sobald Sie anfangen Bienen am Anleger Nahrungssuche, sie nach und nach weiter weg bewegen, bis sie in einem komfortablen Abstand ist (mindestens 5 m), die gestochen zu vermeiden.
    3. Lackzeichen Bienen, um den Überblick einzelner Honigbienen zu halten. Machen Sie eine Liste aller Farbkombinationen, die verwendet werden. Wenn eine Biene landet am Anleger, markieren Sie sorgfältig seinen Bauch mit zwei Farben und eine Note auf der Liste zu machen, dass die Kombination genommen wird.
    4. Tauschen Sie die Schwerkraftzuführung für einen Zubringer mit dem Arzneimittel / Saccharose-Lösung. Beachten Sie die gekennzeichneten Bienen, die den Einzug besuchen. Fangen Sie nicht markierte Biene Besuch der Feeder als Bienen produktivsten Werber sind, und die Zahl der Bienen die unter Drogen Feeder besuchen kann schnell außer Kontrolle geraten. Dies ist besonders problematisch, wenn das gleiche Experiment an aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt werden, wie naive Bienen nicht mehr naiv sein könnten.
      HINWEIS: Als Alternative zur Ausbildung von einzelnen Bienen zu einem Zubringer, frühere Autor23 - s erfolgreich Arzneimittel-geschnürt Saccharose Wasser auf einen ganzen Bienenstock 21 eingespeist.
  2. Die topische Behandlung
    HINWEIS: Das Ziel ist es, die Verbindung von Interesse in einem Lösungsmittel zu lösen, die die wächserne Insekt Kutikula eindringen kann. Verschiedene Lösungsmittel können für diesen Zweck verwendet werden. Die am häufigsten verwendet werden, umfassen Aceton, Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid (DMSO).
    1. Beurteilen Sie die Lösungsmittel am besten für die Verbindung zur Hand arbeitet. Wenn eine starke Phänotyp aus einer Überdosis zu erwarten ist (beispielsweise Lähmung oder Tod), treat Bienen (Schritt 2.2.2) mit einer hohen Dosis (beispielsweise 20 & mgr; g Kokain 7) in jeder der verschiedenen Lösungsmitteln gelöst und vorsichtig Zeit bis Paralyse überwachen oder Tod.
    2. Mit einem 1 ul Mikrokapillare (oder einer Mikro, die auf einem geeigneten Dispensers angebracht werden kann) und Mikrokapillare Halter, ziehe 1 ul der Wirkstofflösung (zB 381; g / & mgr; l Kokain) in die Kapillare. Vertreibt den Abfall, und es sorgfältig malen auf den Thorax eines markierten Biene. Decken so groß eines Bereichs a mit der Lösung möglich, anstatt eines festen Tropfen verlassen, da die Biene dann wahrscheinlich ist es, zu pflegen ab. Achten Sie darauf, nicht die Verbindung zu ermöglichen, die Flügel zu kontaktieren Scharniere, oder das sie aus den Flügeln des Thorax und entlang ziehen kann, wo sie ohne absorbiert in die Hämolymphe verdampfen.
      HINWEIS: Je nach Forschungsziel, dieses Verfahren auch verwendet werden können, Drogen Bauch auf die Biene zu verabreichen. Allerdings erreichen Drogen das ZNS schneller und in größeren Mengen , wenn auf den Thorax 24 .Diese Methode angewandt funktioniert genauso gut mit spannte wie mit frei fliegenden Bienen.
  3. verflüchtigten Behandlung
    1. Löse Drogen (früher diese Methode verwendet wurde Kokain zu Honigbienen 10 zu liefern) in 100% igem Ethanol. Um sicherzustellen, dass die Löslichkeit, nicht um ein Hydrochlorid oder andere Salzformen des Einsatzeswenn möglich Droge. Wenn eine Verdünnung macht es so vorbereiten, dass die Menge an einer Biene geliefert werden soll, in 100 & mgr; l vorhanden. Verwenden Sie reines Ethanol als Fahrzeugkontrolle.
    2. So erstellen Sie einen Faden, verwenden Sie das gleiche Verfahren wie McClung und Hirsh 25.
      1. Kurz erklärt: wind up Nichromdrahtes eng um einen Nagel und heften sich an zwei elektrischen Leitungen (eine an jedem Ende des Filaments). Entfernen Sie den Nagel. Die verbleibende Nichrom Spule wird als Filament bezeichnet.
      2. Fädeln der zwei Drähte durch sorgfältig Bohrungen im Deckel einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen, die zu der gewählten Temperatur beständig sein sollte. Kleben Sie die Drähte an Ort und Stelle mit flüssigem Silikon.
        HINWEIS: Dadurch wird das Rohr luftdicht zu machen. Dies ist wichtig, sekundäre Exposition gegenüber dem Experimentator zu vermeiden und sicherzustellen, dass die Bienen mit der entsprechenden Dosis behandelt werden.
    3. Befestigen Sie die Drähte an dem Faden an eine Stromquelle führt. die Temperatur mit einem Thermoelement zu messen,das Filament, experimentieren mit unterschiedlichen Spannungs- / Strom-Kombinationen, bis eine, die für das betreffende Medikament in einem geeigneten Temperaturprofil ergibt sich idealerweise eine, die für 10 Sekunden von Heizung oder weniger erlaubt. Dies ist sehr wichtig, siehe einschlägige Literatur ( zum Beispiel , um es zu verflüchtigen Kokain muss mindestens 200 ° C erhitzt werden, aber bei Temperaturen über 350 ° C wird aufgeteilt in Nebenverbindungen 26).
    4. Pipette vorsichtig 100 ul Arzneimittel Ethanol-Lösung auf das Filament. Verbreiten Sie die Flüssigkeit über so viel Faden Oberfläche wie möglich, da dies Verdampfungseffizienz erhöhen. Lassen Sie den Faden bei Raumtemperatur ausgesetzt, bis das gesamte Ethanol verdampft ist.
      HINWEIS: Wenn das Ethanol nicht ausreichend verdampft wird, werden Bienen sowohl mit dem Medikament der Wahl und Ethanol behandelt werden. Bienen sind extrem empfindlich gegenüber Ethanol, und einige Medikamente haben synergistische Interaktionen mit Ethanol, das wird Bias extellen Ergebnisse.
    5. Sobald das Ethanol vollständig verdampft ist (drug Niederschlag kann in der Regel auf dem trockenen Filaments unter einem Mikroskop zu sehen ist), fangen sie eine frei fliegende Biene in einem 50-ml-Tube. Schließen Sie vorsichtig den Deckel des Filaments enthält.
    6. Schalten Sie das Gerät für 10 Sekunden, schalten Sie das Gerät aus und warten Sie weitere 50 Sekunden (damit die verflüchtigte Verbindung zu kühlen und dadurch kondensieren oder Kaution). Lassen Sie die Biene.
      HINWEIS: Während diese Behandlungsmethode hervorragend für freifliegenden Bienen arbeitet, kann es genauso effektiv mit spannte Bienen verwendet werden. Bringen Sie einfach in einem 50-ml-Tube, die genutzt Biene. Laden Sie den Faden wie in 2.3.4 zwischen Bienen beschrieben. Für einen höheren Durchsatz können mehrere Filamente parallel verwendet werden.

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Ergebnisse

Eine Auswahl von repräsentativen Ergebnissen für die oben beschriebenen Verfahren gezeigt sind, in erster Linie zu zeigen, dass die Verfahren pharmakologische Mittel erlauben das Gehirn und beeinflussen honey bee Verhalten zu erreichen.

Spezifische Auswirkungen auf die Gehirnprozesse können leicht folgende Thorax Injektion erhalten werden.

Da pharmakologische Wirkstoff...

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Diskussion

Die Methoden oben skizzierten ermöglichen eine einfache, effektive und robuste Behandlung von entweder freifliegenden oder spannte Honigbienen. Diese Verfahren sind kompatibel mit vielen experimentellen Paradigmen und biologischen Fragen (Tabelle 1). Alle der freifliegenden Methoden leicht nutzbar Bienen angewendet werden kann. Das Gegenteil ist weniger erfolgreich, da jedoch vorübergehende Zurückhaltung und invasive Behandlungsmethoden oft Bienenflugfähigkeit beeinträchtigen können.

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde durch ARC Grant DP0986021 und NHMRC Grant 585442 finanziert. ABB wird durch ein ARC Future Fellowship (FT140100452) unterstützt. JAP wird durch ein iMQRES-Stipendium der Macquarie University und durch ein DAAD-Doktorandenstipendium des Deutschen Akademischen Austauschdienstes unterstützt. JMD wird vom CNRS und der Universität Paul Sabatier unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SaccharoseSigma-AldrichS8501Jeder Lieferant wird
tun NatriumchloridSigma-AldrichS7653
KaliumchloridSigma-AldrichP9333 
Magnesiumchlorid-HexahydratSigma-AldrichM2670
Calciumchlorid-DihydratSigma-AldrichC8106
Dextrose-MonohydratSigma-Aldrich49159
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)Sigma-AldrichP4417
SchutzwachsDentaurum124-305-00
HEPESSigma-AldrichH3375
DimethylformamidSigma-AldrichD4551
95% EthanolSigma-Aldrich493511
GlaskapillareWPI1B100F-3
23 G NanoFil NadelWPINF33BV-2
Sehr feine ForscepsDumont0208-55-PO
Elektrode AbzieherSRI2001
FemtoJet MikroinjektorEppendorf5247 000.01
EicosaneSigma-Aldrich219274
manueller MikromanipulatorBrinkmann InstrumentenbauMM-33
elektronischer MikromanipulatorLuigs & Neumann Feinmechanik + ElektortechnikJunior Gerät XYZ
StereomikroskopLeicaM80
LötkolbenWellerWESD51
Dextran, Alexa Fluor 546, 10.000 MWThermoFisher ScientificD-22911
Dextran, Alexa Fluor 568, 10.000 MWThermoFisher ScientificD-22912
kleine PetrischaleSigma-AldrichP5481
MineralölSigma-AldrichM5904
50 ml ZentrifugenröhrchenThermoFisher Scientific339652
PinzetteAustralian Entomological Supplies
Klingenhalter und -brecherAustralian Entomological SuppliesE130
Feder zweischneidige RasierklingeThermoFisher Scientific50-949-135
NichromdrahtJeder Lieferant wird tun
Elektrische DrähteJeder Lieferant wird tun
ModellfarbeTamiya USAAbhängig von der Farbe
RapportspenderHamilton FirmaPB-600-1
GlasspritzeWPINANOFIL
Fluoreszenz-BetrachtungssystemNightseaSFR-GR
GradnetzProSciTechS8014-24
Mikrokapillare mit HalterungDrummond1-000-0010
FlüssigsilikonJeder Lieferant macht
ThermoelementDigitechQM-1324
MikropipetteEppendorf

Referenzen

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