Nachweis von Trypanosoma brucei Variante Oberflächen-Glykoprotein Switching von Magnetic Activated Cell Sorting und Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Afrikanische Trypanosomen, die in vitro gezüchtet werden, durchlaufen eine geringe antigene Variation, so dass die Populationen aus Parasiten bestehen, die eine dominante Variante des Oberflächenglykoproteins (VSG)-Typs exprimieren, und einer kleinen Population von "geschalteten" Varianten. Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Populationen.

Zusammenfassung

Trypanosoma brucei, ein Protozoen-Parasit, der sowohl menschliche als auch tierische afrikanische Trypanosomiasis (bekannt als Schlafkrankheit bzw. Nagana) verursacht, wechselt zwischen einem Tsetse-Vektor und einem Säugetierwirt. Es entzieht sich dem Immunsystem des Säugetierwirts, indem es periodisch das dichte, variante Oberflächenglykoprotein (VSG) umschaltet, das seine Oberfläche bedeckt. Der Nachweis der antigenen Variation bei Trypanosoma brucei kann sowohl umständlich als auch arbeitsintensiv sein. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Anzahl der Parasiten vor, die in einer bestimmten Population "umgeschaltet" haben, um ein neues VSG zu exprimieren. Die Parasiten werden zunächst mit einem Antikörper gegen das Ausgangs-VSG gefärbt und dann mit einem Sekundärantikörper, der an eine Magnetkugel gebunden ist. Parasiten, die das Ausgangs-VSG exprimieren, werden dann vom Rest der Population getrennt, indem die Parasiten über eine Säule laufen, die an einem Magneten befestigt ist. Parasiten, die das dominante, beginnende VSG exprimieren, werden auf der Säule zurückgehalten, während der Durchfluss Parasiten enthält, die ein neues VSG exprimieren, sowie einige Kontaminanten, die das ausgehende VSG exprimieren. Diese Durchflusspopulation wird erneut mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen das Ausgangs-VSG zur Markierung von Kontaminanten und Propidiumiodid (PI), das tote Zellen markiert, angefärbt. Eine bekannte Anzahl von absoluten Zählkügelchen, die durch Durchflusszytometrie sichtbar sind, werden der Durchflusspopulation hinzugefügt. Das Verhältnis der Kügelchen zur Anzahl der gesammelten Zellen kann dann verwendet werden, um die Anzahl der Zellen in der gesamten Probe zu extrapolieren. Die Durchflusszytometrie wird verwendet, um die Population der Wechsler zu quantifizieren, indem die Anzahl der PI-negativen Zellen gezählt wird, die sich nicht positiv für das beginnende, dominante VSG färben. Anhand der Daten der Durchflusszytometrie kann dann der Anteil der Wechsler in der Grundgesamtheit berechnet werden.

Einleitung

Der einzelliger Parasit, Trypanosoma brucei, ist ein Erreger von Krankheiten , die Menschen (über Trypanosoma brucei gambiense und Trypanosoma brucei rhodesiense) und Tiere (über Trypanosoma brucei brucei) in ganz Afrika südlich der Sahara beeinflussen. Es ist dem Säugetierwirt durch den Speichel der Tsetse-Fliege Vektor übertragen. Mensch und Tier afrikanischen Trypanosomiasis eine schwere wirtschaftliche Belastung in Endemiegebieten verursachen, und nur wenige Medikamente zur Verfügung stehen oder in der Entwicklung entweder Krankheit zu behandeln. Mechanismen der Immunumgehung zu verstehen, ist für die Entwicklung von Medikamenten für Trypanosomiasis kritisch. Antigenic Variation der dichten, Variant Oberflächen Glycoprotein (VSG) Mantel, der den Parasiten abdeckt , ist eine der wichtigsten Mittel , durch die T. brucei ausweicht die Säugetier-Antikörper - Reaktion. Ca. 2.000 Varianten des Gens VSG bestehen in Trypanosomen Genom, aber nur einer wird zu einem gegebenen Zeitpunkt transkribiert von einer ~ 15 Expression Websites. 'Switching' des exprimierten VSG kann entweder durch Kopieren eines VSG - Gens in den aktiven Expressionsstelle oder durch die Transkriptionsaktivierung eines zuvor stillen Expressionsstelle ( beschrieben in ¹⁾ auftreten.

Obwohl viel Arbeit zum Verständnis der Antigenvariation in T. gewidmet brucei, die Faktoren, die Frequenzeinfluss Schalt sind noch kaum verstanden. Bisherige Untersuchungen wurden durch die Tatsache erschwert , dass , während Schalt stochastisch in vitro auftritt, Schaltfrequenzen sehr niedrig sind, in der Größenordnung von 1 in etwa 10 ⁶ Zellen ^2. Dies macht es schwierig zu messen, ob ein gegebener Faktor erhöht oder Schaltfrequenz abnimmt, da Schalt hart ist in erster Linie zu detektieren. Vor 2009 Methoden für Switcher in einer bestimmten Population zu isolieren waren langwierig und arbeitsintensiv. Dazu gehörten Passagierung Trypanosomen durch immunisierten Mäuse gegen die herrschende VSG und dann erntet Zelleneinen Tag später ³ oder Hunderte von Zellen durch Immunofluoreszenz ^4,5 zu zählen. Eine andere Strategie stützt sich auf Auswahl für Medikamentenresistenz zu Switcher ⁶ isolieren. Da African in vitro gezüchtet Trypanosomen typischerweise aus einer großen Population gemacht werden eine wichtige Variante ausdrückt, und eine viel kleinere Population von Switcher ausdrücken alternative Varianten, verweisen wir auf die Hauptvariante in diesem Papier als dominant, beginnend VSG. Dabei wir in keiner Weise andeuten wollen, dass diese wichtige Variante mehr Fitness als andere Varianten in der Bevölkerung hat.

Hier beschreiben wir eine Methode, die die Anzahl der Trypanosomen Expression eines nicht-dominanten VSG in einer bestimmten Population in 3 zuverlässig messen kann - 4 Std. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, wenn man will, ob eine bestimmte genetische Manipulation oder medikamentöse Behandlung zu ermitteln, die Anzahl von geschalteten Zellen in einer Population erhöht. Anstatt die Population von Zellen zu befreien, die do ausdrückenminante, beginnend VSG durch Drogen oder durch immunologische Mittel werden diese Zellen durch diese zuerst mit magnetischen Kügelchen Beschichtung eliminiert gekoppelt Antikörper gegen das dominante VSG und dann auf einem Magnet Säule isoliert. Die geschaltete Population wird dann in der Durchströmungs gesammelt und wieder gefärbt mit einem Fluorophor anti-VSG markierten Antikörper Kontaminanten zu identifizieren. Die Quantifizierung erfolgt durch Zugabe einer definierten Anzahl von absolute Zählung beads zu jeder Probe erreicht , so daß das Verhältnis der Kügelchen zu den Zellen bestimmt und verwendet werden können , um die Anzahl von Umschaltern in der Population ⁷ zu quantifizieren.

Protokoll

ANMERKUNG: In dem Verfahren ist es notwendig, Zellen auf Eis zu halten. Kalte Medien sollten auch überall eingesetzt werden.

1. Probenernte

1. Wachsen Lister-Stamm 427 Blutstrom Trypanosomen zu einer Dichte von 0,5 bis 1.000.000 / ml. Es ist am besten Kulturen mit einer kleinen Anzahl von Parasiten zu starten. Spin down 50 x 10 ⁶ Zellen / Probe für 10 min bei 1500 x g. Achten Sie darauf , 1 x 10 ⁶ Zellen in Kultur zu verlassen , für später als positive und negative Antikörper - Steuerelemente verwenden.
   Hinweis: Dieses Protokoll kann auch auf aus Tierblut (siehe Diskussion für weitere Details) isoliert Trypanosomen verwendet werden.
2. Pipette oder schütten die meisten Überstand aus (lassen Sie etwa 750 & mgr; l). Transfer der Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Spin-Zellen bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg in einer Mikrozentrifuge und entfernen Überstand.

2. Magnetische Labeling

1. Die Zellen in 150 & mgr; l Kulturmedium (HMI-9 with Serum zum Beispiel) + primäre anti-VSG-Antikörper in der entsprechenden Verdünnung.
   HINWEIS: Die Anti-VSG-Antikörper wird im Haus hergestellt und bei einer Verdünnung von 1:50 verwendet. Es ist wichtig, eine primäre anti-VSG-Antikörper zu verwenden, die nicht mit einem Fluorophor markiert ist.
2. Vortex-Zellen einen Wirbel-Adapter-60 bei der Geschwindigkeit 6 unter Verwendung von - 10 min 8 in einem kalten Raum bei 4 ° C. Waschen mit 800 - 1000 ul kalten HMI-9 mit Serum.
3. Spin bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und den Überstand absaugen. Waschen mit 1 ml HMI-9 mit Serum und wie oben drehen. Den Überstand aspirieren. Pellet in 100 ul HMI-9 mit Serum.
4. Hinzufügen, 110 & mgr; l magnetischen aktivierte Zellsortierung (MSC) Mikrokügelchen. Verwenden Sie Anti-Maus, anti-Kaninchen oder Anti-Biotin-Perlen als geeignet für den primären anti-Antikörper VSG. Gut mischen. Vortex-Zellen in einem kalten Raum bei 4 ° C für 10 min.
5. Während Zellen werden verwirbelt, stellen eine Magnet-aktivierte Trennsäule / Probe auf einem Trennmagneten auf. Achten Sie darauf, eine erneute habenceptacle (wir verwenden, um eine 15 ml-Zentrifugenröhrchen) unter der Spalte, die den Durchfluss zu sammeln. Stellen Sie das Gerät in einem kalten Raum.
6. 2 ml HMI-9 mit Serum zu grundieren Spalte. Nach der Grundierung Ort ein 15 ml Zentrifugenröhrchen unter dem Säulendurchfluss von jeder Probe zu sammeln.
7. Nach der 10-minütigen Inkubation in Schritt 2.4, fügen 800-1000 ul kalten HMI-9 mit Serum. Spin bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und entfernen Überstand ungebundenen Antikörper zu entfernen. Waschen mit 1 ml HMI-9 mit Serum und repeat 100 ul des Überstands zu verlassen.
8. Flick das Zentrifugenröhrchen kräftig und visuell inspizieren das Rohr, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig suspendiert. 1 ml der HMI-9 mit Serum und Pipette auf und ab, um sicherzustellen, dass die Zellen sind gut suspendiert.

3. Magnetische Trennung

1. Stellen Sie sicher, dass die Spalten grundiert werden, wie oben beschrieben. Anwenden Zellen Spalte. Sammeln der Durchströmung mit Zellen, die die nicht-dominante VS exprimierenG. 1 ml Medium + Trypanosomen dauert in der Regel 6 bis 7 min durch die Säule zu fließen.
2. Wasch 2x mit 1 ml HMI-9 mit Serum und zu sammeln, wie in Schritt 3.1 in dem gleichen Rohrdurchströmung.
3. Divide Durchfluss (3 ml) in zwei 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Diese später kombiniert werden können , oder die Hälfte kann verwendet werden , um RNA zu isolieren, usw.
4. Entfernen Sie Spalte von Magneten. 3 ml HMI-9 mit Serum-Säule und tauchen Sie Säule in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen Zellen zu erhalten, die die Ausgangs, dominant VSG auszudrücken. Entfernen 300 ul eluierte Material für eine spätere Analyse. Bewahren Sie diese Zellen auf Eis.
5. Zur Verwendung als positive und negative Kontrolle nehmen etwa 1 Million Zellen aus der Ausgangskultur von Kontrollzellen bei 37 ° C wachsen und Pipetten sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (die nicht zu wechseln häufig erwartet).
   HINWEIS: Positive Kontrollzellen werden mit Fluorophor-markierten Antikörper in Schritt 4.1 gefärbt werden. Negative Kontrollzellen REMAin für den Rest des Protokolls ungefärbt.
6. Spin Durchflussproben und positive Kontrollprobe Antikörper bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg Überstand und zu entfernen.
   HINWEIS: Weitere 300 & mgr; l Aliquot von eluierten Zellen können als positive Kontrolle für die Anti-VSG-Färbung verwendet werden.

4. Die Färbung zu identifizieren Fremd- und Switcher

1. Resuspendieren Durchflussproben und positive Kontrollzellen in 100 ul HMI-9 mit Serum + primären, Fluorophor-markiertem, anti-VSG Antikörper bei der geeigneten Verdünnung.
   HINWEIS: Die markierten Anti-VSG-Antikörper wird im Haus hergestellt und bei einer Verdünnung von 1: 1000. Der Fluorophor-markierten, anti-VSG können aus der gleichen Quelle wie die unmarkierten Antikörper in der Trenn MACS step.There 3 ml Durchfluss Probe in zwei Mikrozentrifugenröhrchen folgenden Schritt 3.5 sein sollte.
2. Um alle Durchfluss mittels Durchflusszytometrie, vereinige die Pellets in den beiden Mikrozentrifugenröhrchen analysieren, während erneut susdie Proben in 100 ul anhängiger HMI-9 mit Serum + anti-VSG-Antikörper. Gut mischen.
3. Vortex-Zellen in einem kalten Raum bei 4 ° C für 10 min. In 800 - 1000 ul kalt HMI-9 mit Serum. Spin Proben bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg und entfernen Überstand ungebundenen Antikörper zu entfernen.
4. Wasche die Zellen mit 1 ml von HMI-9 mit Serum. Spin Proben bei 4 ° C für 4 min bei 5.200 xg Überstand und zu entfernen. Während dieser letzten Spin, drehen die eluierten-Proben aus Schritt 3.4 nach unten und der negativen Kontrollprobe.
5. Resuspendieren alle Flow-Through und eluierten Proben in: 148,5 ul HMI-9 mit Serum, 25 & mgr; l absolute Zählen Perlen und 1,5 ul Propidiumiodidfärbung Lösung (175 ul insgesamt). Resuspendieren positive und negative Antikörper Kontrollproben in 175 & mgr; l HMI-9 mit Serum. Achten Sie darauf, die Zahl der absoluten Zählen Perlen / 25 & mgr; l für die jeweilige Menge zur Aufzeichnung.
6. Führen Sie alle Proben durch einen Durchflusszytometer und sammeln Daten. Tote Zellen anfärben als PI ^{+. Verunreinigungen Fleck als PI - VSG +. Switcher Fleck als PI - VSG - 8.}
7. Berechnen Schaltfrequenzen mit Hilfe der Durchflusszytometrie Daten.
   HINWEIS: Für Anweisungen, wie Schaltfrequenzen zu berechnen, finden Sie in der Zusatzdatei Flow Cytometry Calculations.docx und Tabelle 1.

Ergebnisse

Die hier beschriebene Methode wurde verwendet , die Doppelstrangbrüche in der VSG Ausdruck Website zu demonstrieren stieg die Zahl der Switcher in einer Population ^8. Hier zeigen wir repräsentative Ergebnisse aus einer Population von Trypanosomen, die einen Doppelstrangbruch an der Expressionsstelle ähnlich induziert zu erzeugen wurden. Wir vergleichen diese Trypanosomen zu denen , die einen Doppelstrangbruch zu erzeugen , wurden nicht induziert. Abbildung 1 z...

Diskussion

In Bezug auf experimentelle Technik, die kritischste Komponente des Protokolls hält alle Proben kalt. Trypanosomen internalisieren sehr rasch Antikörper an ihre Oberfläche gebunden ^9, aber dieser Prozess ist Motilität abhängig und beeinflussen nicht den Test, solange die Zellen bei 4 ° C aufbewahrt werden. Alle Proben sollten immer auf Eis gehalten werden, und Pipettieren sollte schnell Exposition zu minimieren, um die 25 ° C Laborumgebung durchgeführt werden. Kalt HMI-9 mit Serum sollte zu Beginn des Experim...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
unmarkierter Anti-VSG-Antikörper	n/a	n/a	VSG-Antikörper wird im eigenen Haus hergestellt
Fluorophor-markierter Anti-VSG-Antikörper	n/a	n/a	VSG-Antikörper wird im eigenen Haus hergestellt
HMI-9 Medien	n/a	n/a	HMI-9 wird im eigenen Haus hergestellt
Propidiumiodid	BD Pharmingen	556463
CountBright absolute Zählperlen	Thermofisher	Scientific C36950
LD Säulen	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACS Magnet	Miltenyi Biotech	130-042-303
MACS Magnetabscheider	Miltenyi Biotech	130-042-302
Vortex Adapter-60	ThermoFisher Scientific	AM10014
Durchflusszytometer	Schar	n/a
Analysesoftware für Durchflusszytometer	FloJo	n/a