Analyse von Protein-Import in Chloroplasten von gestressten Pflanzen isoliert

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine neue Methode Proteinimport in isolierte Chloroplasten unter Stress zu studieren. Das Verfahren ist schnell und einfach, und kann die Folgen verschiedener Stressbedingungen für Chloroplasten Proteinimport, und die entsprechenden regulatorischen Mechanismen zu studieren, angewendet werden.

Zusammenfassung

Chloroplasten sind Organellen mit vielen lebenswichtige Rollen in Pflanzen, die nicht nur die Photosynthese sind aber zahlreiche andere Stoffwechsel- und Signalfunktionen. Darüber hinaus sind die Chloroplasten kritisch für Pflanzen Reaktionen auf verschiedene abiotischen Stress, wie beispielsweise Salzgehalt und osmotischem Stress. Ein Chloroplasten kann bis zu ~ 3.000 verschiedene Proteine ​​enthalten, von denen einige durch ihr eigenes Genom codiert sind. Jedoch sind die meisten Chloroplasten-Proteine ​​in den Zellkern codiert und in dem Cytosol synthetisiert werden, und diese Proteine ​​müssen in den Chloroplasten durch translocons an den Chloroplasten Hüllmembranen importiert werden. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Chloroplasten-Import-Protein kann aktiv durch Stress reguliert werden. Um biochemisch solche Regulierung der Proteinimport unter Stressbedingungen zu untersuchen, entwickelten wir das hier beschriebene Verfahren als eine schnelle und unkomplizierte Verfahren, das leicht in jedem Labor erreicht werden kann. In diesem Verfahren werden Pflanzen werden unter normalen conditio gewachsenns und dann ausgesetzt Bedingungen in flüssiger Kultur zu betonen. Pflanzenmaterial wird gesammelt und Chloroplasten werden dann durch Homogenisierung freigegeben. Das rohe Homogenat wird durch Dichtegradientenzentrifugation getrennt, so dass die Isolierung der intakten Chloroplasten. Chloroplasten-Ausbeute wird durch Zählen bewertet und Chloroplasten Intakt wird unter einem Mikroskop geprüft. Für die Proteinimport Assays werden gereinigte Chloroplasten mit ³⁵ S radioaktiv markiertem in vitro setzten Vorläuferproteine inkubiert, und der Zeitverlauf Experimente durchgeführt werden Vergleiche von Importraten zwischen Genotypen unter Stressbedingungen zu ermöglichen. Wir präsentieren Daten, die diese Methode erzeugt mit, die zeigen, dass die Rate der Proteinimport in Chloroplasten von einer regulatorischen Mutante speziell unter osmotischen Stressbedingungen verändert wird.

Einleitung

Chloroplasten sind sehr reichlich Organellen, die in den grünen Geweben von Pflanzen existieren. Sie sind bekannt für ihre kritische Rolle bei der Photosynthese, ein Prozess, der Lichtenergie nutzt Kohlendioxid zu Zucker umwandeln und unterstützen somit fast alles Leben auf der Erde ^1. Zusätzlich Chloroplasten (und die breitere Familie von verwandten Organellen genannt Plastiden) spielen viele andere wichtige Rollen in Pflanzen, einschließlich der Biosynthese von Aminosäuren, Lipiden, Pigmente und die Erfassung von Umgebungssignalen, wie Schwerkraft und pathogen Herausforderung. Photosynthese erzeugt reaktive Sauerstoffspezies (ROS) als Nebenprodukte, die unter bestimmten Umständen nützlich Rollen haben, aber wenn können schädlich oder sogar letale Wirkungen überproduzierte verursachen. Die Überproduktion von ROS wird vor allem durch widrige Umweltbedingungen gefördert und damit Chloroplasten sind eng mit Reaktionen auf abiotischen Stress, wie Salz- und osmotischen Stress ² verbunden.

CHloroplasts haben eine komplexe Struktur. Jede Chloroplast ist durch eine Doppelmembranaußenschicht genannt Hülle umgeben, die aus äußeren und inneren Membranen besteht. Intern gibt es ein weiteres Membransystem die Thylakoide genannt, wo die Lichtreaktionen der Photosynthese stattfinden. Zwischen den beiden Membransystemen gibt es ein wässriges Kompartiment Anruf das Stroma, die Kohlenstoff-Fixierung beteiligt ist. Ein Chloroplasten kann bis zu ~ 3.000 verschiedene Proteine enthalten, und die überwiegende Mehrheit dieser Proteine sind in dem Cytosol in Vorläuferform synthetisiert und müssen in das Organell durch spezielle Protein translocons in den Hüllmembranen ¹ importiert werden. Interessanterweise haben neuere Arbeiten darauf hin, dass Chloroplasten Proteinimport aktiv geregelt ist, und so in der Lage, eine wichtige Maß an Kontrolle über den Chloroplasten Proteom auszuüben. Zum Beispiel wurde es im Jahr 2015 berichtet, dass Proteinimport gegen abiotischen Stress durch die direkte Regulierung der Fülle von th reagieren kanne Translokon am äußeren Hüllmembran von Chloroplasten (TOC) durch das Ubiquitin-Proteasom - System ^3.

Verwendung von gereinigtem Chloroplasten und in vitro synthetisierten Vorläuferproteine, Proteinimport in vitro ^4,5 rekonstituiert werden. Somit können in vitro - Verfahren verwendet werden , um die Raten der Einfuhr in verschiedenen mutierten Pflanzen ^6, zu beurteilen , die eine kritische Ansatz für die Analyse von putativen Komponenten des Proteinimportmaschinerie war und für die Mechanismen entdeckt Proteinimport und ihrer Regulation zugrunde liegen. Außerdem Chloroplasten können mit weiteren Fraktionierung oder Protease Verdau folgenden in vitro Import verarbeitet werden, die Untersuchungen über die Unter organellären Lokalisierung und der Topologie von Chloroplasten - Proteine ^7,8 erleichtern kann.

Um die Regulierung der Proteinimport durch Stress studieren, haben wir unsere Routine Chloroplasten Isolationsmethode modifiziert, wie wir beschreibenHier. Wichtig waren, die Chloroplasten von Pflanzen isoliert, die auf Standard-Murashige und Skoog (MS) Agar-Medium für 8 Tage und dann übertragen in flüssigem MS-Medium, das mit Stressor gewachsen war, eine relativ kurze, kontrollierte Stress-Behandlung bietet. Die Ausbeute und die Kompetenz von Chloroplasten aus einer solchen Stress-behandelten Pflanzen isoliert sind kompatibel mit dem nachgeschalteten in vitro Proteinimport - Test ^3. Zusätzlich zu den Chloroplasten Isolierungsprotokoll zeigen wir das Routineverfahren für die in vitro Proteinimport, die robust erwiesen hat und weit ^3,9-12 verwendet wird.

Protokoll

1. Wachstum von Arabidopsis-Pflanzen und die Stress-Behandlung

1. Vorbereitung 1 l Murashige und Skoog (MS) Medium durch Zugabe von 4,3 g MS Basal Salzmischung, 10 g Sucrose, 0,5 g 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) zu entionisiertem Wasser bis zu 1 l und Einstellen der pH-Wert auf 5,7 mit Kaliumhydroxid (KOH). Hinzufügen 6 g Phytoagar und Autoklaven für 20 min bei 120 ° C.
   1. Vor der Verfestigung, gießen Sie das Medium in runde Petrischalen (Durchmesser 9 cm, Höhe 1,5 cm, mit 20 bis 25 ml MS-Medium pro Platte). Erlauben die Platten für ca. 1 h in einer laminaren Strömungshaube trocknen, bevor der Deckel geschlossen wird.
2. Platzieren Arabidopsis thaliana Samen in ein 1,5 ml Reagenzglas zur Oberflächensterilisation durch Zugabe von 1 ml 70% (v / v) Ethanol , enthaltend 0,02% (v / v) Triton X-100 und kontinuierlich für 5-10 min Schütteln. Für jeden Genotyp / Zustand, bereiten 10 Petrischalen mit jeweils tragenden ~ 100-150 Sämlinge.
3. Warten Sie etwa 10 Sekunden, bis die Samen auf die abrechnenBoden der Röhre, und dann den Überstand verwerfen durch Pipettieren. 1 ml 100% Ethanol, und schütteln Sie das Tube wieder für 10 min.
4. Bereiten Sie die Laminar-Flow-Haube, während die Samen Sterilisieren werden. Nehmen Sie ein Stück Filterpapier pro Probe, falten Sie es in der Hälfte der Aussaat zu erleichtern, und genießen Sie es in 100% Ethanol in der Haube. Warten Sie, bis es vollständig austrocknet. Man beachte, dass 100% Ethanol verwendet, da es schneller als 70% Ethanol verdampft.
5. Übertragen Sie die Samen auf das Filterpapier durch Pipettieren einer 1 ml Pipettenspitze Schnitt ~ 5 mm von dem feinen Ende verwendet wird. Trocknen lassen, was etwa 10 nehmen sollte - 15 min.
6. Sow ~ 100-150 sterilisierten Samen gleichmäßig auf jedem MS-Medium Petri-Platte und Dichtung jede Platte mit chirurgischen Band.
7. Lagern Sie die Platten den Kopf bei 4 ° C für 2 - 4 d zu fördern und zu synchronisieren Keimung. Alte Samen müssen möglicherweise länger bleiben (bis zu einer Woche) bei 4 ° C.
8. Übertragen Sie die Platten auf eine Pflanze Gewebekulturkammer und lassen sie den Kopf nach oben.Wachsen die Pflanzen für 8 d unter einem langfris - Tage - Zyklus (16 h 100 & mgr; mol · m ^{- 2} · s ^{- 1} Licht, 8 Stunden Dunkelheit) bei 20 ° C.
9. Für Stress - Behandlung, wenn die Pflanzen 8 d alt sind, in der Flow - Haube, übertragen sie aus dem Agar - Medium, indem sie sanft aus der Hand tragen Ethanol-sterilisierten Handschuhe, in eine sterilisierte Flasche flüssigem MS - Medium mit dem Stressor Schaben (zB , 200 mM Mannit). Vermeiden Sie über Agar-Medium trägt. Decken Sie den Kolben Mund mit sterilisiertem Folie ab und lassen die Pflanzen unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 1.8 für weitere 2 d auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln (~ 100 Umdrehungen pro Minute) zu wachsen.

2. Herstellung eines Precursor Protein durch in vitro - Transkription / Translation

Hinweis: Dieses Protokoll nimmt die Verwendung von Arabidopsis Photosystem I Untereinheit D-Vorläufer (pPsaD) als Templat / Präprotein, aber das Verfahren ist kompatibel mit anderen.

1. Klon der kodierenden Sequenz (CDS) von pPsaD in die multiple Klonierungsstelle (MCS) des pBluescript II SK - Vektor (oder irgendeinem anderen ähnlichen Vektor mit einem vorgeschalteten T7 - Promotor) ^13. Man reinige das Plasmid (pBSK-pPsaD) eine DNA-Isolation-Kit und die Sequenz durch DNA-Sequenzierung zu überprüfen.
   HINWEIS: Alle diese Schritte verwenden Standard molekulare Klonierungstechniken.
2. Bestimmen Sie die pBSK-pPsaD Plasmid-DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer eingestellt unter Verwendung von Absorption bei 260 nm zu messen. Verdünne das Plasmid auf eine Endkonzentration von 10 ng / & mgr; l.
3. Führen Sie einen 20 & mgr; l PCR (35 Zyklen), um das verdünnte Plasmid als Matrize. Bereiten Sie die Reaktion wie folgt: 2 & mgr; l 10 × Polymerase-Puffer, 2 & mgr; l 2 mM dNTPs, 1 & mgr; l 5 mM M13 Vorwärtsprimer (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 & mgr; l 5 mM M13 Umkehrprimer (5 '-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 ul pBSK-pPsaD Plasmid verdünnt, 1 U Taq-Polymerase und destilliertes Wasser, um das Gesamtreaktionsvolumen von bis zu20 & mgr; l. Verwenden Sie ein Standard-PCR-Programm wie folgt: 95 ° C, 5 min; 35 Zyklen von [95 ° C, 30 sec; 56 ° C, 30 sec; 72 ° C, 30 sec); und 72 ° C, 5 min.
4. Versuch 5 & mgr; l des PCR-Produkts auf einem 1% (w / v) Agarosegel in TAE-Puffer (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM Essigsäure, 1 mM EDTA) korrekten Amplifikation der cDNA zu verifizieren und zu quantifizieren, die relevante Band in Bezug auf Standards, um die Konzentration zu bestätigen. Lagern Sie den Rest des Produkts bei -20 ° C für weitere Anwendungen.
5. Bereiten einer 50 ul Reaktion eines Kaninchen - Retikulozyten - Lysat basierend zellfreien Transkriptions- / Translationssystem kompatibel mit PCR DNA unter Verwendung von wie folgt: 40 ul Reticulocytenlysat vom Transkriptions- / Translationssystem, 2,5 & mgr; l radioaktiv markiertem ^[35 S] Methionin, 11 uCi / ml (spezifische Aktivität:> 1000 Ci / mmol), 2,5 & mgr; l sterilem destilliertem Wasser und 5 ul pPsaD PCR-Produkt (100-800 ng).
   Achtung: Tragen Sie Handschuhe, Laborkleidung und Schutzglasses beim Umgang mit radioaktivem Material. Überwachen und die Arbeitsfläche und Geräte dekontaminieren. Entsorgen Sie alle radioaktiven Abfälle in einem zugelassenen Abfallbehälter.
6. Inkubieren der Reaktion für 90 min in einem 30 ° C Wasserbad. Die Reaktion durch die Probe auf Eis gestellt.
7. Entfernen, um 1 & mgr; l der Reaktion als Testprobe (das gleiche Volumen kann auch dazu dienen als Eingangssteuerung für Schritt 5.7) zur Überprüfung auf Standard Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), gefolgt von Autoradiographie, Fluorographie oder Phosphor-Bildgebung. Ein gutes Ergebnis wird durch die Beobachtung einer deutlichen und starke Bande entsprechend dem Molekulargewicht von pPsaD (~ 23 kD) angegeben. Lagern Sie den Rest der Reaktion bei -80 ° C für weitere Anwendungen.

3. Chloroplasten Isolation

1. Die folgenden Stammlösungen:
   1. Bereiten Chloroplast Isolierungspuffer (CIB, 2x): 0,6 M Sorbit, 10 mM Magnesiumchlorid(MgCl _2), 10 mM Ethylenglykol - tetraessigsäure (EGTA), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 20 mM Natriumbicarbonat (NaHCO _3), 40 mM 4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) ; auf pH 8,0 mit KOH eingestellt werden. Bereiten Sie 2 l 2x CIB, machen Aliquots und halten sie bei -20 ° C für die langfristige Lagerung oder bei 4 ° C für die kurzfristige Lagerung. Um 1x CIB machen verdünnen 2x CIB 1: 1 mit destilliertem Wasser; dies kann frisch am Tag der Chloroplasten-Isolierung Experiment hergestellt werden.
   2. Bereiten HEPES-Puffer MgSO ₄ -Sorbit (HMS, 1x): 50 mM HEPES, 3 mM Magnesiumsulfat (MgSO _4), 0,3 M Sorbitol; Einstellen auf pH 8,0 mit Natriumhydroxid (NaOH). Bereiten Sie 400 ml Puffer, machen Aliquots und halten sie bei -20 ° C für die langfristige Lagerung oder bei 4 ° C für die kurzfristige Lagerung.
2. Führen Sie alle folgenden Verfahren im Kühlraum oder auf Eis. Vorzukühlen alle Lösungen, Geräten, Ausrüstung und Rotoren vor starting.
3. Vorbereiten eines kontinuierlichen Dichtegradienten durch Mischen von 13 ml Percoll, 13 ml 2x CIB Puffer und 5 mg Glutathion in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren der Mischung bei 43.000 × g für 30 min (Brems off) bei 4 ° C. Nach dem Zentrifugieren behandeln das Rohr mit Sorgfalt die Steigung nicht zu stören und halten Sie sie auf Eis für die spätere Verwendung.
4. Übertragen Sie 100 ml 1x CIB pro Genotyp / Zustand in einen 1-Liter-Becher.
   1. Entfernen Sie die Sämlinge aus dem flüssigen Medium, indem sie in ein Sieb kippen und übertragen diese in einen anderen CIB enthaltenden Becher; dann spülen Sie das Gewebe mit dem CIB restliche flüssige Medium zu entfernen, bevor es mit 100 ml frischem CIB zu ersetzen.
5. Zur Homogenisierung mit insgesamt 100 ml 1x CIB pro Probe in fünf aufeinander folgenden Runden der Homogenisierung verwenden, jeder Runde unter Verwendung von 20 ml frischem CIB in einem Becherglas 50 ml gehalten.
   1. Für die erste Runde der Homogenisierung, übertragen das Pflanzengewebe, in das 50 ml-Becherglas von Hand, so dass dervorherigen Haltepuffer durch die Finger zu entleeren. Versuchen Sie den größten Teil des Gewebes in der ersten Runde zu verwenden, aber stellen Sie sicher, dass es mit Puffer eingetaucht ist; wenn dies nicht möglich ist, stellen die verbleibenden nicht verwendeten Gewebe in der zweiten Runde.
6. Legen Sonde des Gewebes Homogenisator in das Gewebe und homogenisieren mit zwei Impulsen von 1 bis 2 s je. Filtern des Homogenats durch zwei Schichten von Filtertuch in einen 250-ml-Zentrifugenröhrchen durch sanftes Quetschen. Bewahren Sie das Filtrat, und übertragen das Gewebe zurück in die 50-ml-Becher.
7. Legen Sie eine zweite 20 ml CIB aliquoten in den 50-ml-Becherglas, das Hinzufügen alle verbleibenden Gewebe nicht in der ersten Runde der Homogenisierung verwendet, und wiederholen Sie die Homogenisierung und Filtrationsschritte. Somit wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 , bis alle der 100 ml CIB verbraucht ist (dh 5 Aliquots von 20 ml), und die daraus resultierenden Filtrate kombinieren.
8. Zentrifugieren Sie die gepoolten Homogenats bei 1000 × g für 5 min (Bremse) bei 4 ° C und abgießender Überstand unmittelbar nach Beendigung der Zentrifugation, dabei nicht um das Pellet zu stören. Das Pellet im Restüberstand in der Röhre nach links, indem Sie vorsichtig das Rohr auf Eis gerührt wurde. Nicht heftig durch Pipettieren oder Vortexen resuspendieren.
9. übertragen Sie vorsichtig das Homogenisat auf der Oberseite der vorgefertigten Gradienten kontinuierliche Dichte, mit einer Pasteurpipette es über die Wand des Aufnahmerohr anzuwenden. Vermeiden Sie den Gradienten zu stören. Zentrifuge in einem Schwenkbecherrotor bei 7.800 × g für 10 min (Brems off) bei 4 ° C.
   HINWEIS: Zwei grüne Bänder in der Steigung nach dem Zentrifugieren gesehen werden kann: das untere Band intakt Chloroplasten enthält, und das obere Band gebrochene Chloroplasten enthält.
10. Entsorgen Sie die Top-Band durch Pipettieren und dann übertragen das untere Band mit einer Pasteur-Pipette in ein frisches 50 ml Zentrifugenröhrchen, ein Volumen von bis zu 8 ml pro Steigung zu halten.
11. In ~ 25 ml 1x HMS-Puffer in das Rohr und invertieren zweimal das Rohr to waschen Sie die Percoll aus den Chloroplasten. Das Röhrchen wird erneut in die Schwingeimerrotor und Zentrifuge bei 1000 × g für 5 min (Bremse) bei 4 ° C.
12. Gießen Sie den Überstand ab und lassen Sie das Chloroplasten-Pellet in den Rest HMS resuspendieren in der Röhre gelassen, indem Sie vorsichtig das Rohr auf Eis gerührt wurde. Fügen Sie eine weitere 100 bis 300 & mgr; l von HMS, falls erforderlich (basierend auf der Größe des Pellets und der Auszählung in Abschnitt 4), aber versuchen Sie nicht, um die Probe zu viel zu verdünnen.
    1. Halten Sie die Chloroplasten auf Eis. Jedes Mal, bevor die Chloroplasten für Downstream-Anwendungen verwendet werden, schütteln Sie das Röhrchen sie wieder zu suspendieren. Verwenden Sie immer einen Schnitt Pipettenspitze (mit einem vergrößerten Pore) die Chloroplasten zu übertragen.

4. Analyse der Ausbeute und Intakt von Chloroplasten

1. In 5 ul isoliert Chloroplasten bis 495 & mgr; l 1x HMS-Puffer in einem 1,5 ml-Röhrchen, und dann vorsichtig mischen, indem das Röhrchen Invertieren einer 1 zu erhalten: 100 Verdünnung.
2. Place ein Deckglas auf der Oberseite der Zählkammer des Haemocytometers. Langsam Pipette ~ 40 - 60 & mgr; l der verdünnten Chloroplasten-Suspension in den Spalt zwischen dem Deckglas und der Zählkammer. Mit Hilfe eines Phasenkontrast-Mikroskop mit 10-facher oder 20x-Objektiv, suchen intakte Chloroplasten rund und hell und von einem Lichtkreis umgeben.
   HINWEIS: Unter dem Mikroskop gibt es eine 1 mm ² Zählfläche mit 25 großen Quadraten, die jeweils 16 kleine Quadrate in der Mitte der Zählkammer.
3. Zählen Sie die Anzahl der Chloroplasten in 10 großen Plätzen. Die Zahl der Chloroplasten pro großen Platz sollte im Durchschnitt zwischen 10 und 30. Wenn zu wenige oder zu viele Chloroplasten vorhanden sind, den Verdünnungsfaktor (Schritt 4.1 oben) entsprechend anpassen, und wiederholen Sie den Vorgang.
4. Berechnen der Anzahl von Chloroplasten pro ml (Konzentration) wie folgt: n (die durchschnittliche Anzahl der pro Chloroplasten großen Platz berechnet in Schritt 4.3) × 25 (Gesamtzahl der großen Quadraten) × 100 (Verdünnungsfaktor) × 10 ⁴ (Skalierungsfaktordaten pro 1 mL auszudrücken, da das Volumen oberhalb der 25 Quadrate 0,1 mm ^3).
5. Berechnen Sie die tatsächliche Ausbeute von Chloroplasten durch die Konzentration durch das Volumen der Chloroplasten-Suspension in Schritt 3.12 erhalten multipliziert wird. Normalerweise können mehr als 50 × 10 ⁶ Chloroplasten erhalten werden.

5. Chloroplasten-Protein Import

1. Die folgenden Stammlösungen:
   1. Bereiten 10x HMS - Puffer: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO ₄ und 3,0 M Sorbitol; auf pH 8,0 mit NaOH einstellen. Bereiten Sie 50 ml dieses Puffers, aliquoten, und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung und bei 4 ° C für die kurzfristige Lagerung.
   2. Bereiten Import Anschlagpuffer: 50 mM EDTA, gelöst in 1x HMS-Puffer. Bereiten Sie 50 ml dieses Puffers, aliquoten, und bei -20 ° C.
   3. Bereiten 2x Protein-Ladepuffer: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) Glycerin, 2% (w/ V) SDS, 0,005% (w / v) Bromphenolblau. Machen Sie 50 ml, und lagern bei 4 ° C. Unmittelbar vor der Verwendung, 100 & mgr; l von 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT) bis 900 & mgr; l Puffer.
2. Um einen zeitlichen Verlauf mit drei Zeitpunkten ausgeführt werden, bereiten 3 Röhrchen jeweils ein 130-ul-Aliquot von Einfuhranschlagpuffer enthalten, und lassen Sie sie auf Eis. Bereiten Sie eine 450 & mgr; l Import Reaktion in einem 2-ml-Röhrchen (pro Genotyp / Zustand). Tauen Sie alle kurz vor Zutaten zu verwenden.
   1. Für eine Importreaktion verwenden in der Regel von 10 × 10 ⁶ Chloroplasten in A & mgr; l Volumen; Wenn beispielsweise die Chloroplasten - Konzentration 2,5 × 10 ⁸ / ml, 40 ul verwenden Chloroplasten Suspension. Drei Zeitpunkte müssen 3 × A & mgr; l (dh 120 & mgr; l in unserem Beispiel).
   2. Mischen Sie die Reaktionen Komponenten auf Eis in der folgenden Reihenfolge: destilliertes Wasser (bis das Gesamtvolumen 600 & mgr; l zu machen), B ul 10x HMS - Puffer (wobei B = [600-3 × A] / 10, dh 48 in unserem Beispiel), 12 ul1 M Gluconsäure (Kaliumsalz), 6 & mgr; l 1 M NaHCO _3, 6 & mgr; l 20% (w / v) BSA, 30 & mgr; l 100 mM Adenosin - 5'-Triphosphat - Magnesiumsalz (MgATP), 24 & mgr; l 250 mM Methionin (nicht radiomarkiert ) und 30 & mgr; l-Vorläuferprotein. Unmittelbar vor dem Import Reaktion starten, fügen Sie 3 × A & mgr; l von Chloroplasten und mischen, indem Sie vorsichtig den Schlauch tippen.
3. Inkubieren Sie die Reaktionsröhrchen bei 25 ° C in einem Wasserbad unter 100 & mgr; mol · m ^{- 2} · s ^{- 1} Licht. Gelegentlich Flick die Rohre Chloroplasten zu suspendieren.
4. Um einen Zeitverlauf führen, zurückziehen 130 & mgr; l-Aliquots aus der Reaktion bei den erforderlichen Zeitpunkten im linearen Bereich der Einfuhr, die für pPsaD bis zu ~ 12 min (4-, 8- und 12-min Zeitpunkten geeignet sind in diesem Fall). Der lineare Bereich Zeitraum kann für verschiedene Proteine ¹⁴ variieren. So wird vorgeschlagen, vor jeder einzelnen Präprotein zu testen t zu optimierener Zeitpunkten.
5. Unmittelbar nach dem Rückzug, übertragen jede 130-ul-Aliquot in ein Röhrchen eiskaltem Import Anschlagpuffer, mischen, indem Sie vorsichtig den Schlauch tippen, und alle Röhrchen auf Eis zu halten, bis die Zeit-Kurs abgeschlossen ist.
6. Zentrifugieren Sie alle Proben für 30 s bei 12.000 × g in einer Mikro, entsorgen Sie die Überstände durch Pipettieren und Resuspension Pellets in 15 ul 2x Protein-Ladepuffer durch Vortexen.
7. Analyse aller Proben sowie die pPsaD Eingangskontrolle (mit pPsaD äquivalent zu 10% der Menge zugegeben , die jedem Importreaktion aus Schritt 2.7) durch Standard - SDS-PAGE und Autoradiographie, Fluorographie oder Phosphor - Bild ^15. Verwenden Sie die Bildanalyse-Software zu quantifizieren und die Ergebnisse zu analysieren. Um eine Anzeige der Importeffizienz bieten, kann die Menge des importierten Proteins in verschiedenen Genotypen / Bedingungen durch Messung der Radioaktivität mit jedem reifen Band zugeordnet bewertet werden.

Ergebnisse

Ein Beispiel Chloroplasten - Import - Protein Experiment mit 3 Zeitpunkten ist in Abbildung 1 dargestellt. PSAD eine ~ 18 kD - Komponente des Photosystems I an das Stroma freigelegt, mit einer Vorläuferform von ~ 23 kD ^16. PSAD wurde hier für die in vitro Proteinimport - Test ausgewählt , weil seine Steady-State - Spiegel im sp1 Mutante erhöht sind, relativ zu WT, unter Stressbedingungen, was auf eine Änderung ihrer Einfuhr Effizienz in der Mutante ^3. Die sp1 Mutante trägt einen Defekt in einem wichtigen Regulator des Chloroplasten - Protein Importmaschinerie - das SP1 Protein ^3. Für die Chloroplasten von Pflanzen unter normalen Bedingungen isoliert gewachsen, gab es keinen offensichtlichen Unterschied in pSAD import zwischen sp1 und WT (Daten nicht gezeigt) ^3. Doch hier beschriebenen Verfahren unter Verwendung von PSAD Import in die Chloroplasten von osmotisch isoliert zu beurteilengestressten Pflanzen wurde ein deutlicher Unterschied festgestellt. Während wir die Ansammlung des reifen Proteins Form in einer zeitabhängigen Art und Weise mit den beiden Genotypen beobachtet, war die Rate der Import deutlich niedriger für WT Chloroplasten als für sp1 Chloroplasten (Abbildung 1), die mit unseren bisherigen Ergebnissen ³ konsistent ist, und zeigt , eine wichtige Rolle für die SP1-Protein in den Chloroplasten-Import von pSAD unter Stressbedingungen zu regulieren.

Abbildung 1. Ein Protein Import Assay Dirigiert Chloroplasten aus Pflanzen isoliert Grown unter osmotischer Stress Bedingungen. Chloroplasten von einer 10 Tage alten WT (Col-0) und eine sp1 mutierten Arabidopsis - Pflanzen isoliert wurden , unter Stressbedingungen (200 mM Mannit) gezüchtet 2 d. (A) Protein Import wurde unter Verwendung von durchgeführt ^[35 S] -Methionine-markiertem pPsaD und man ließ für 4, 8 und 12 min vor der Analyse durch SDS-PAGE und Phosphor-Bild fortzufahren. Parallel dazu umfasst die pPsaD 10% Steuereingang in vitro translatierte Protein (IVT) wurde analysiert. Der Vorläufer (pre) und reifen (mat) Formen der pPsaD angegeben, während zwischen zwei Bands, die wahrscheinlich entsprechen abgeschnitten oder proteolysiertes Translationsprodukte, weil ihre Intensität während des Zeitverlaufs (*) nicht ändern. (B) Um die Preise der Import in die Chloroplasten von WT und sp1 Pflanzen angebaut unter Stressbedingungen, die Intensität jedes Band vergleichen , um zu importiert reife Protein in A entspricht , wurde quantifiziert. Alle Daten werden als Prozentsatz der Menge der eingeführten Protein in den Chloroplasten von WT Pflanzen nach 12 min ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Wir haben kürzlich gezeigt , dass Chloroplasten - Import - Protein kann aktiv durch Stress reguliert werden, die für die Chloroplasten - Funktion und das Überleben der Pflanze ³ kritisch ist. In dieser Studie, eine solche Regelung zu überwachen, modifizierten wir unsere Chloroplasten Isolierung und in vitro Import Testverfahren , um Beurteilung der Importkapazität von Pflanzen unter Stressbedingungen gewachsen zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten eine wichtige Rolle für SP1 in Chloroplasten-Import-Regulationsprotein.

Herkömmliche in vitro Import - Assays verwenden Pflanzen auf Standard - MS - Agar - Medium ^6,17,18 gewachsen. Im Fall des hier beschriebenen sp1 mutant, solche herkömmlichen Assays ergaben keine Unterschiede in Proteinimport relativ zu dem WT ^3. Allerdings ist die Rolle von SP1 bei der Regulierung der Proteinimport deutlich zum Vorschein , wenn Proteinimport unter Stressbedingungen beurteilt wird unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren (Abbildung 1). Während es may nicht möglich sein, direkt Import von Daten aus dem Stressbedingungen Assay mit denen von herkömmlichen Assays erhalten vergleichen (wie die Methoden Pflanzen in Flüssigkultur und auf Agar-Medium beschäftigen, beziehungsweise), Vergleiche zwischen Stress und Nichtstressbedingungen sind denkbar vorausgesetzt, die Pflanzen alle im gleichen flüssigen Kulturmedium mit oder ohne Stressoren gezüchtet.

Im Vergleich mit dem Stress - Behandlung auf Agarmedium, ist Flüssigkultur bequemer für die Behandlung der großen Anzahl von Pflanzen , die für in vitro - Assays import. Darüber hinaus erleichtert es die einheitliche Anwendung der Stressor auf alle Pflanzen, die für Behandlungen kurzfristige Belastung besonders wichtig ist. Das hier vorgestellte Verfahren wurde der osmotische Druck unter Verwendung Mannit Behandlung zu untersuchen angewendet, aber leicht zu einer Vielzahl von anderen Belastungen angepasst werden könnte; kurzfristige Salzstress und oxidativer Stress, für die beispielsweise die entsprechenden Stressoren könnte be in ähnlicher Weise über flüssigem MS-Medium aufgebracht. Für andere Arten von Spannungen, schlagen wir den Grad der Belastung zuerst optimiert; übermäßig schwere Behandlungen haben negative Auswirkungen auf den Ertrag und / oder Import Kompetenz der isolierten Organellen können.

Es gibt mehrere wichtige Schritte innerhalb des Protokolls, auf die sollte man besonders darauf achten, wie nachfolgend beschrieben.

Die optimale Konzentration für die Agar MS-Medium kann differieren (0,6-0,9%, w / v) je nach Hersteller. Daher ist es empfohlen, die empirisch Agarkonzentration optimieren, bevor Experimente beginnen. Das Medium sollte nicht so weich sein, dass es bei der Ernteschritt (Schritt 1.9) an das Gewebe klebt, noch sollte es so schwer sein, dass sie Pflanzenwurzelentwicklung hemmt. Die Saccharosekonzentration kann auch nach den verwendeten Pflanzen eingestellt werden. Wenn bei besonders kranken Mutanten arbeitet, ergänzt MS-Medium mit 2 - 3% (w / v) Saccharose Pflanzen besser wachsen kann helfen. Wenn AppLiegen Stress - Behandlungen, ist es nicht gut , sehr alten Pflanzen zu dem flüssigen Medium zu übertragen (zB> 14 Tage). Dies liegt daran, die weiter entwickelten Wurzeln von älteren Pflanzen sind leichter während transferral beschädigt.

In Bezug auf die Transkriptions / Translations-System gibt es zwei Hauptsysteme: solche auf Basis von Weizenkeime, und solche auf Basis von Kaninchen-Retikulozyten. Diese Kits können verschiedene Vorlagen verwenden, wie linearisierte Plasmide, unlinearisiert Plasmide oder PCR-Produkte. Die Kits sind auch spezifisch für die T3, T7 und SP6-Promotoren. Beachten Sie, dass das Kit wir hier empfehlen für die Verwendung mit PCR-Produkten nur geeignet ist und der T7-Promotor. Doch aus unbekannten Gründen einige radiomarkierten Präproteinen mit diesem System gemacht möglicherweise nicht effizient in den Import-Test arbeiten; in solchen Fällen kann man erwägen einen Weizenkeimextrakt-System oder ein Retikulozytenlysat-System gemeint für Plasmidmatrizen versuchen. Man kann auch das Ergebnis der Transkription / Translation Wieder verbessernAktion durch die Reaktionsbedingungen modifiziert nach dem Handbuch des Herstellers.

Es ist wichtig, Chloroplasten Isolation früh am Morgen (oder früh am Lichtzyklus der Wachstumskammer), um zu vermeiden Ansammlung von Stärke in den Chloroplasten aufgrund der Photosynthese zu beginnen, die die Isolierung von intakten Organellen behindern können. Die Chloroplasten-Isolierungsverfahren muß schnell und ohne unnötige Verzögerungen durchgeführt werden, und die isolierten Chloroplasten müssen immer kalt gehalten werden. Dies ist gegen die Beobachtung zu mildern, die Chloroplasten isoliert werden nach und nach ihre Lebensfähigkeit verlieren, was nicht gut ist. Wenn neu aufgetaut CIB oder HMS-Puffer verwenden, müssen Sie vor der Anwendung die Puffer gut zu mischen, um eine homogene Lösung zu erhalten. Die optimalen Bedingungen für die Homogenisierung von Pflanzenmaterial haben empirisch festgestellt worden ist, und kann variieren, wenn ein anderes Gewebe-Homogenisator verwendet wird.

Wenn die verschiedenen Pflanzen Genotypen enthalten similar Chlorophyllpegel, Chlorophyll Quantifizierung kann als Alternative verwendet werden, um die Proben zu normalisieren, bevor die Import Assays durchzuführen. Chlorophyll kann spektrophotometrisch nach Extraktion einer Probe der isolierten Chloroplasten in 80% (v / v) wßrigem Aceton ^19,20 bestimmt werden. Wenn jedoch die Importraten von Pflanzen verschiedene Chlorophyll Inhalt zeigen (zB Mutanten mit chlorotisch Phänotypen) miteinander verglichen werden, verwenden Chloroplasten Zahl Zählen der Chloroplasten - Proben in den Import - Assays zu normalisieren. Es ist besonders wichtig, die Chloroplasten gründlich in Schritt 3.11 zu resuspendieren. Unzureichende Aufwirbelung können Aggregate von Chloroplasten lassen, was es schwierig machen Zahlen genau zu zählen und damit die korrekte Beladung der Importreaktionen behindern wird. Wenn eine schwere Aggregation unter dem Mikroskop zu sehen ist (zB Aggregate mit> 10 Chloroplasten miteinander verbunden), auch weiterhin die Chloroplasten - Probe , bis die aggregat auf Eis schüttelnes werden entfernt. Es ist einfacher, die Chloroplasten in einem kleineren Volumen an Puffer wieder zu suspendieren.

Es ist wichtig, sich bewusst zu sein, dass Proteinimport Reaktionen (Abschnitt 5) müssen wegen ihrer radioaktiven Natur mit entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt werden. Notwendige Vorsichtsmaßnahmen gehören: Einmalhandschuhe, Laborkleidung und Schutzbrille zu tragen, die Überwachung und die Arbeitsfläche und Ausrüstung Dekontaminierung, und in einem zugelassenen Abfallbehälter aller radioaktiven Abfälle zu entsorgen. Denken Sie auch daran, dass die richtige osmotische Druck für die Aufrechterhaltung der Unversehrtheit der Chloroplasten während der Import Reaktionen kritisch ist, und dies wird hauptsächlich durch die HMS-Puffer gehalten. Denn 10x HMS viskos ist, sollte sie zunächst bis auf RT erwärmt werden, und dann gründlich gemischt und aufgetragen, um eine Schnittpipettenspitze Messung von genauen Volumina zu gewährleisten. In der Importreaktion wird kaltes Methionin zugesetzt, um den Einbau von freien radiomarkierten Methionin in keinem Zusammenhang chloropl zu hemmenast Proteine ​​durch organellären Übersetzung während der Inkubationsschritt, während BSA verwendet wird, indem sie als Substrat für Proteasen Proteolyse zu minimieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Murashige und Skoog Basalsalz	Melford	M0221
Phytoagar	Melford	P1003
2-(N-Morpholino) Ethan sulfonsäure (MES)	Melford	B2002
Triton X-100	Fisher	BPE151-500
chirurgisches Band (z.B. , Micropore, 3M)	3M	1530-1
Filterpapier	Fisher	FB59023
Percoll	Fisher	10607095
Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA)	Sigma	E4378
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Fisher	D/0700/53
4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES)	Melford	B2001
Filtrationstuch (Miracloth)	Calbiochem	475855
50 mL Zentrifugenröhrchen	Fisher	CFT-595-040M
250 mL Zentrifugenflasche	Fisher	CFT-891-V
Polytron (z.B. , Kinematica PT10-35)	Fisher	11010070
Polytron Sonde (z.B. , Kinematica PTA20S)	Fisher	11030083
Zentrifuge (z.B. , Beckman Coulter Avanti JXN-26, für 50 und 250 mL Röhrchen)	Beckman Coulter	B34182
Festwinkelrotor für 250  mL Flaschen (z.B. , JLA-16.250)	Beckman Coulter	363930
Festwinkelrotor für 50  ml-Röhrchen (z.B. , JA-25.50)	Beckman Coulter	363058
schwingender Schaufelrotor für 50 mL-Röhrchen (z.B. , JS-13.1)	Beckman Coulter	346963
radioaktiv markiertes [35S] Methionin	Perkin Elmer	NEG072002MC
auf Kaninchen-Retikulozyten-Lysat basierendes zellfreies Translationssystem (TNT T7 Quick kit für PCR-DNA)	Promega	L5540
Phasenkontrastmikroskop (z.B. , Nikon Eclipse 80i)	Nikon	nicht verfügbar
Hämozytometer (Verbesserte Neubauer BS748 Kammer)	Hawksley Technology	AC1000	0,1 mm Tiefe, 1/400 mm2
Cover Gläser	VWR	16004-094	22 mm & mal 22 mm, Dicke 0,13-0,17 mm
1,5 mL Mikrofurogenröhrchen	Sarstedt	72.690.001
2 mL Mikrofugenröhrchen	Starlab	S1620-2700
Mikrofuge (z.B., Eppendorf 5415D)	Eppendorf	nicht lieferbar
Nanodrop 2000 Spektralphotometer o.ä	Thermo Fisher	SPR-700-310L
Gluconsäure (Kaliumsalz)	Fisher	22932-2500
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma	A7906
MgATP	Sigma	A9187
Methionin	Sigma	M6039
Bromphenolblau	Fisher	B/P620/44
	Glycerin Fisher	G/0650/17
SDS	Fisher	S/5200/53
Tris Base	Melford	B2005
Dithiothreitol (DTT)	Melford	MB1015
Bildanalysesoftware (z.B. , Aida Image Analyzer)	Raytest	nicht verfügbar