Automatische Quantifizierung und Analyse von Zellzählung Schritte bei der Verwendung ImageJ Plugins

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Quantifizierung von Hämozytometer- und Migrations-/Invasionsmikroskopaufnahmen durch zwei neue Open-Source-ImageJ-Plugins: Cell Concentration Calculator und Migration Assay Counter. Darüber hinaus werden Bildaufnahme- und Kalibrierungsprotokolle beschrieben und die Eingabeanforderungen der Plugins ausführlich diskutiert.

Abstract

Das National Institute of Health ImageJ ist ein leistungsfähiges, frei verfügbaren Bildverarbeitungs-Software-Suite. ImageJ hat umfassende Partikelanalyse-Algorithmen, die effektiv genutzt werden kann, verschiedene biologische Partikel zu zählen. Wenn eine große Anzahl von Zellproben zu zählen, stellt der Zählkammer einen Engpass in Bezug auf die Zeit. Ebenso Membranen von Migration / Invasion Assays mit dem ImageJ Plug-Zellzähler, obwohl eine genaue Zählung, ist außerordentlich arbeitsintensiv, subjektiv und berüchtigt für verursachen Schmerzen am Handgelenk. Um diesem Bedarf zu begegnen, haben wir zwei Plugins innerhalb ImageJ für die einzige Aufgabe der automatisierten Hämozytometer (oder bekannten Volumen) und Migration / invasion Zellzählung. Beide Plugins verlassen sich auf die Fähigkeit, qualitativ hochwertige Mikroaufnahmen mit minimalen Hintergrund zu erfassen. Sie sind einfach für den schnellen Zählen und Analyse großer Probengrößen mit integrierten Analysetools zu verwenden und optimierte Kalibrierung von Zählungen zu helfen. Durch die Kombination der Kernprinzips von Zellzähler mit einem automatisierten Zählalgorithmus und post-counting Analyse Dies erhöht die Leichtigkeit, mit der Migrationsassays kann ohne Verlust an Genauigkeit bearbeitet werden.

Introduction

In - vitro - Zellzählung ist eine wichtige Grundtechnik in einem weiten Bereich von Gewebekulturexperimenten. Exakt die Anzahl der Zellen in einer Kultur , die Bestimmung ist von wesentlicher Bedeutung für die experimentelle Reproduzierbarkeit und Standardisierung ^1,2. Zellzählung kann ein Hämozytometer manuell über als auch unter Verwendung einer Vielzahl von automatisierten Verfahren, jede mit ihren eigenen Vorteilen und Nachteilen ^3,4,5 ausgeführt werden. Die meisten der automatisierten Verfahren zur Zellzählung gehören zu einer von zwei Klassen, diejenigen, die das Coulter-Prinzip verwenden oder Durchflusszytometrie. Coulte....

Protocol

1. Verbindung Mikroskop und Kamera-Setup (Zellkonzentration Calculator)

1. Erhöhen Glühbirne Helligkeit voll mit dem Licht Einstellknopf, wechseln Sie auf die 4X Objektivlinse und gewährleisten Phasenkontrastfilter ausgewählt werden.
   HINWEIS: Jede invertierte Phasenkontrastmikroskop für die Gewebekultur mit einem dunklen Hintergrund, zum Beispiel PhP Phasenkontrast, können folgende Standard - Mikroskop und Kamera Verfahren verwendet werden.
2. Innerhalb der Software des Mikroskops eingestellt Bildaufnahmeeinstellungen auf die Standardwerte.
   HINWEIS: Lesen Sie in der Bedienungsanleitung des Mikroskops die Lage dieser Einstellungen....

Results

Zellkonzentration Rechner

Abbildung 1 zeigt den Gesamtprozess der CCC - Kalibrierung und zählbar Bildaufnahme. 1A und 1B zeigen die P-Quadrat Kalibrierungsbild und Berechnung von P-Quadrat Länge in Pixeln. CCC bestimmt Zellkonzentration in einem bestimmten Volumen nach der Formel:

Discussion

Kritische Schritte, Fehlerbehebung und Einschränkungen

Das Wesen der automatisierten Rechenverfahren, insbesondere die der Partikelanalyse erfordert die mathematische Fähigkeit, diese Partikel zu definieren. Folglich ist die Genauigkeit der beiden Zellkonzentrationsrechner und Migrationsassay Zähler majorly abhängig von Bildwiedergabetreue, das heißt, wie genau das übernommene Bild das Membranzellprobe oder Migrationstest ähnelt. Es ist daher von größter Bedeutung Mikroskop und zugehörige Softw.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - mit L-Glutamin	Fisher Scientific	SH3002702	Zellkultivierungsmedien
Fötales Bovianserum (FBS)	GIBCO BRL	P00015	Medienergänzung
HTR8/SVneo Trophoblast-Zelllinie	Die Zellen wurden von Dr. Charles Graham (Queen' s University, Kingston, Kanada)		Die Software ist so konzipiert, dass sie mit jeder Zelllinie funktioniert.
Trypsin	GIBCO BRL	27250-018	Hergestellt als 0,20% (w/v) in 10 & Mikro; M EDTA 1x PBS
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
10 cm Zellkulturplatten	SARSTEDT	833902	Alle mit Gewebekulturen behandelten Platten sind geeignet
Transwell Polyester Membraneinsätze - 8,0  &Mikro; m Porengröße	Costar 3422 bestellt bei Fisher Scientific	7200150	Für 24-Well-Platten; Porengröße: 8,0 & Mikro; m; 6,5 mm Durchmesser; 0,33 cm2 Wachstumsbereich
HARLECO Hämatologie-Färbungen und -Reagenzien, EMD Millipore - Soluntionen 1, 2 & 3	EMD Millipore und bestellt bei VWR	65044A, B, & C	Das Hemacolor-Fleckenset besteht aus drei 500 ml (16,9 oz.) Polyflaschen und enthält ein Methanol-Fixiermittel (Lösung 1), einen Eosin- oder Säurefleck (Lösung 2) und einen Methylenblau- oder basischen Fleck (Lösung 3)
Applikator mit Baumwollspitze	Puritan Medical	806-WC
Einschneidige Industrierasierklingen	VWR	55411 - 055	Dicke: 0,30 mm (0,012")
Objektträger - Vorgereinigt/Glatt	Fisher Scientific	12550A3	Maße: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm
Fisherbrand Deckgläser - Rechtecke Nr. 1	Fisher Scientific	12-545E	Dicke: 0,13 bis 0,17 mm; Größe: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Eindeckmedium	Fisher Scientific	SP15-500
Leica Stereo Präpariermikroskop	Leica Microsystems Das Mikromikroskop		ist ausgestattet mit der Leica Mikroskopkamera Modell MC170 HD & Kamerasoftware ist Leica App. Suite (LAS E2) Version 3.1.1 [Build: 490]. Mikroskop-Teile:  LED3000 Spotlichtbeleuchtung Modell: MEB126, Leica M80 Optischer Träger Modell M80, Objektiv achromat 1,0X, WD=90  mm Modell: MOB306 & Objektiv Achromat 0,32X, WD=303  mm Modell: MOB315, Video Objektiv 0,5X Modell: MTU-293
Hämazytometer	Assistent Deutschland		0,100 mm Tiefe - 0,0025 mm2
Olympus Inverslichtmikroskop	Olympus Corporation	CKX41SF	Das Mikrosope ist ausgestattet mit Lumenera Infinity 1-2 2,0 Megapixel CMOS Color Kamera & Kamerasoftware ist Infinity analyze Version 6.5.2
Laminar Flow Cabinet 1300 Serie A2	Thermo Scientific &	Modell: 1375	Jeder Laminar-Flow-Schrank für die Zellkulturarbeit ist geeignet
Inkubator für Zellkulturen	Thermo Scientific	Modell: 370	Jeder Zellkultur-Inkubator ist geeignet - Die Zellen wurden in befeuchteter Umgebung kultiviert, 5% CO2, 37 ° C
ImageJ		NIH Version 1.50e	Erforderliche Mindestversion
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	Erforderliche Mindestversion