Ein Protokoll zum Screening auf endokrine Aktivität in organischen Extrakten von Wasserproben, einschließlich aufbereitetem Abwasser und Oberflächenwasser (aufnehmendem Wasser), wurde unter Verwendung kommerziell erhältlicher in vitro Transaktivierungs-Bioassays angepasst.
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Methodenartikel
Screening für Endokrine Aktivität in Wasser unter Verwendung von handelsüblichen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In - vitro - Trans Biotests haben Versprechen als Wasserqualität Monitoring - Tools gezeigt, aber ihre Annahme und weit verbreitete Anwendung ist zum Teil auf einen Mangel an standardisierten Methoden und die Verfügbarkeit von robusten, benutzerfreundliche Technologie aufgrund behindert. In dieser Studie wurden im Handel erhältlich, divisions verhaftet Zelllinien wurden quantitativ verwendet für endokrine Aktivität zu screenen von Chemikalien, die in Wasserproben von Interesse für die Umweltqualität Profis. Ein einziges, standardisiertes Protokoll, das umfassende Qualitätssicherung / Qualitätskontrolle (QA / QC) Kontrollen einbezogen wurde für Östrogen- und Glucocorticoid-Rezeptor-Aktivität entwickelt (ER und GR, jeweils) unter Verwendung eines zellbasierten Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) -Test. Die Proben der behandelten kommunalen Abwasser Abwasser und Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Kalifornien (USA), wurden unter Verwendung von Festphasenextraktion und analysiert für endokrine Aktivität extrahiert, um die standardisierten Proto mitcol. Hintergrund und Dosis-Wirkungs-für Endpunkt spezifische Referenz Chemikalien erfüllt QA / QC-Richtlinien für notwendig erachtet für eine zuverlässige Messung. Der Bioassay-Screening-Antwort für die Oberflächenwasserproben war weitgehend nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu hatte Abwasserproben aus sekundären Behandlungsanlagen die höchste messbare Aktivität, mit geschätzten Bioassay äquivalenten Konzentrationen (BEQs) bis zu 392 ng Dexamethason / L für GR und 17 ng 17β-Estradiol / L für ER. Der Bioassay Antwort für eine tertiäre Abwasserprobe war niedriger als die für sekundäre Abwässer gemessen, was auf eine geringere Rest von endokrin wirksamen Chemikalien nach vorheriger Behandlung. Dieses Protokoll hat gezeigt , dass in vitro - Trans Biotests , die im Handel erhältlich, divisions verhaftet Zelle "Kits" nutzen wollen , können für endokrine Aktivität in Wasser zu screenen angepasst werden.
Einleitung
Aktuelle Überwachung der Wasserqualität auf der Fähigkeit sagt, genau und präzise das Auftreten von chemischen Verunreinigungen als Proxy für die Exposition gegenüber Mensch und Tier zu messen. Dies ist jedoch chemisch-by-chemische Überwachung und Beurteilung Paradigma kann nicht Schritt halten mit den sich ständig ändernden chemischen Universum, das wir konfrontiert sind. Wenn wir mehr über das Schicksal und Effekte von synthetischen und natürlichen Chemikalien lernen wir weiterhin für Messinstrumente zu suchen, die biologischen Auswirkungen zu erwarten Adresse und dass zur gleichen Zeit auf Veränderungen in der chemischen Produktion, Nutzung und Umwelt Eingang immu....
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Protokoll
1. Sammeln und Prozesswasserprobe (Modified von Escher et al. 9)
- Füllen Sie eine saubere 1 L Braunglasflasche mit 1 g Natriumazid und 50 mg Ascorbinsäure an die Spitze mit Wasserprobe von Interesse. Store Probe bei 4 ° C und Verfahren innerhalb von 72 Std.
HINWEIS: Natriumazid ist sehr giftig und müssen mit Vorsicht behandelt werden. Verwenden Sie Schutzkleidung (Schutzbrille / Gesicht, Handschuhe, Kleidung) und wiegen in einem ordnungsgemäß funktionierenden Dunstabzugshaube. Verwenden Sie keine Metallspachtel zum Wiegen verwenden. - Übergeben, die Probe durch einen 1,6 um-Glasfaserfilter und dann durch eine vorkonditioni....
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Ergebnisse
In der vorliegenden Studie wurden 24 4x h-Mischproben der behandelten kommunalen Abwasser anfällt, 6 Schürfproben von Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Südkalifornien und ein Feld leer von Reinstwasser aus wurden ausgewählt, um dieses Protokoll zu illustrieren. 3 der 4 Abwasserproben wurden aus konventionellen Schlamm Kläranlagen aktiviert ( "secondary Abwasser"), und der vierte von einer fortgeschrittenen Kläranlage mit Sand / Kohlefiltration Post biologische Behandlu.......
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Diskussion
Die gut dokumentierte Potenz von Umwelt Estrogene, wie 17β-Estradiol (E2), garantiert Screening für diese Chemikalien in ng / L - Konzentrationen 23,24. In dieser Studie wurde die ER - Antwort für Abwasser Abwässer (BEQ Bereich: 2,3 bis 17 ng E2 / L) war etwas höher als für sekundäre Abwasser berichtet von der australischen AWBAn 20, während die BEQs für Oberflächenwasser (<0,5 bis 4 ng E2 / L ) waren für die Oberflächen- und Regenwasser im Bereich an anderer Stelle berichtet (<1 bis 11 ng E2.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Finanzierung wurde vom State Water Resources Control Board bereitgestellt (Vereinbarungen Nr. 10-096-250 und 14-090-270). Wir danken S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi und J. Printen. Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht, und die Bezugnahme auf Handelsnamen impliziert keine Billigung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Das GeneBLAzer ER alpha DA Assay-Kit | Das ThermoFisher | K1393 | Kit enthält ER-Teilungszellen (DA) und das LiveBLAzer FRET-Loading-Kit. |
| Das GeneBLAzer GR DA Assay-Kit | ThermoFisher | K1391 | Kit enthält GR-Teilungs-arrestierte (DA) Zellen und das LiveBLAzer FRET-Loading-Kit. |
| PrestoBlue Reagenz für die Lebensfähigkeit der Zellen | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypanblau, 0,4 % in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Auch bei ThermoFisher erhältlich |
| Corning 96-Well, schwarze Wand, klare Bodenplatte | Corning | 3603 | Einzeln verpackt, steril mit Deckel |
| Whatman Glasfaserfilter, GF/A, 1,6 & Mikro; M | Sigma-Aldrich | ||
| Mikroplatte Aluminium-Siegelfolie | E & K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc Kartusche, 200 mg Sorptionsmittel | Wasser | WAT106202 | |
| 17β Östradiol | Sigma-Aldbsp; | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbinsäure | Fisher Scientific | A61-100 | Auch erhältlich bei Sigma-Aldrich |
| Dexamethason | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | molekularer Qualität |
| (Aceton, Hexan, Methanol) | Fisher Scientific | HPLC-Natriumazid | |
| Sigma-Aldrich | S2002 | ist hochgiftig und muss mit Vorsicht gehandhabt werden. Tragen Sie Schutzkleidung und wiegen Sie unter einem Abzug. Auch bei EMD Millipore erhältlich. | |
| Automatisierte Zellzähler oder Hämozytometer | Verschiedene* | Zu den Lieferanten gehören Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich und ThermoFisher. | |
| Biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II | Verschiedenes* | ||
| CO2 Inkubator | Verschiedenes* | ||
| Kryo-Gefrierschrank | Verschiedenes* | Es wird empfohlen, Dewar zur Lagerung von flüssigem Stickstoff zu verwenden. | |
| Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader | Verschiedene* | Das Lesegerät muss über Bottom-Read-Funktionen verfügen. | |
| * Keine empfohlene Quelle, die Wahl dieses Geräts hängt vom Budget, der Häufigkeit der Nutzung und dem Platz im Labor ab. |
Referenzen
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrin....
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Nachdrucke und Genehmigungen
