Screening für Endokrine Aktivität in Wasser unter Verwendung von handelsüblichen In Vitro Trans Biotests

Zusammenfassung

Ein Protokoll zum Screening auf endokrine Aktivität in organischen Extrakten von Wasserproben, einschließlich aufbereitetem Abwasser und Oberflächenwasser (aufnehmendem Wasser), wurde unter Verwendung kommerziell erhältlicher in vitro Transaktivierungs-Bioassays angepasst.

Zusammenfassung

In - vitro - Trans Biotests haben Versprechen als Wasserqualität Monitoring - Tools gezeigt, aber ihre Annahme und weit verbreitete Anwendung ist zum Teil auf einen Mangel an standardisierten Methoden und die Verfügbarkeit von robusten, benutzerfreundliche Technologie aufgrund behindert. In dieser Studie wurden im Handel erhältlich, divisions verhaftet Zelllinien wurden quantitativ verwendet für endokrine Aktivität zu screenen von Chemikalien, die in Wasserproben von Interesse für die Umweltqualität Profis. Ein einziges, standardisiertes Protokoll, das umfassende Qualitätssicherung / Qualitätskontrolle (QA / QC) Kontrollen einbezogen wurde für Östrogen- und Glucocorticoid-Rezeptor-Aktivität entwickelt (ER und GR, jeweils) unter Verwendung eines zellbasierten Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) -Test. Die Proben der behandelten kommunalen Abwasser Abwasser und Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Kalifornien (USA), wurden unter Verwendung von Festphasenextraktion und analysiert für endokrine Aktivität extrahiert, um die standardisierten Proto mitcol. Hintergrund und Dosis-Wirkungs-für Endpunkt spezifische Referenz Chemikalien erfüllt QA / QC-Richtlinien für notwendig erachtet für eine zuverlässige Messung. Der Bioassay-Screening-Antwort für die Oberflächenwasserproben war weitgehend nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu hatte Abwasserproben aus sekundären Behandlungsanlagen die höchste messbare Aktivität, mit geschätzten Bioassay äquivalenten Konzentrationen (BEQs) bis zu 392 ng Dexamethason / L für GR und 17 ng 17β-Estradiol / L für ER. Der Bioassay Antwort für eine tertiäre Abwasserprobe war niedriger als die für sekundäre Abwässer gemessen, was auf eine geringere Rest von endokrin wirksamen Chemikalien nach vorheriger Behandlung. Dieses Protokoll hat gezeigt , dass in vitro - Trans Biotests , die im Handel erhältlich, divisions verhaftet Zelle "Kits" nutzen wollen , können für endokrine Aktivität in Wasser zu screenen angepasst werden.

Einleitung

Aktuelle Überwachung der Wasserqualität auf der Fähigkeit sagt, genau und präzise das Auftreten von chemischen Verunreinigungen als Proxy für die Exposition gegenüber Mensch und Tier zu messen. Dies ist jedoch chemisch-by-chemische Überwachung und Beurteilung Paradigma kann nicht Schritt halten mit den sich ständig ändernden chemischen Universum, das wir konfrontiert sind. Wenn wir mehr über das Schicksal und Effekte von synthetischen und natürlichen Chemikalien lernen wir weiterhin für Messinstrumente zu suchen, die biologischen Auswirkungen zu erwarten Adresse und dass zur gleichen Zeit auf Veränderungen in der chemischen Produktion, Nutzung und Umwelt Eingang immun. Solche Werkzeuge sind besonders relevant für das Verständnis, ob unbekannte oder neue Chemikalien und Transformationsprodukte, unsere Aufmerksamkeit verdienen. Darüber hinaus komplexe Mischungen von Chemikalien, die in Wasser schlecht durch einzelne chemische Überwachung angesprochen. So stehen wir vor der Herausforderung, die bestehenden Überwachungs Toolbox besser Adresse zu modernisieren, diese Probleme in Oberflächengewässern that Einleitung von gereinigtem Abwasser anfällt und städtischen / Abfluss von Regenwasser erhalten.

In den letzten Jahren haben Bioanalysetechniken versprechen als Screening-Instrumente gezeigt für die Wasserqualitätsbeurteilung. Insbesondere in'vitro Biotests, die Chemikalien wirken über bekannte, spezifische Wirkungsweisen ^1,2 sind von großem Interesse für die Umweltüberwachung Gemeinschaft ³ reagieren. Zahlreiche Untersuchungen haben in vitro Biotests eingesetzt , um die endokrine Wirkung von Trink-, Oberflächen- und Abwasser ^{4 -6} zu quantifizieren. Außerdem zielen eine Reihe von Biotests Molekular auslösenden Ereignissen (beispielsweise Rezeptoraktivierung) , die möglicherweise zu nachteiligen Wirkungen über adverse outcome pathway ^7,8 analysiert verknüpft werden können.

Die Entwicklung der bioscreening für die Wasserqualitätsbewertung hat relativ schnell gewesen, mit Hunderten von verschiedenen in vitro - Bioassay Endpunkte wurden ausgewertet haben ihreDienstprogramm ^9,10. Derzeit ist nur eine Handvoll von Biotests wurden gute Messgenauigkeit zu erreichen , gezeigt (in Laboratorien) , während die Fähigkeit , unter Wasserqualitäten ^5,6 zu unterscheiden demonstrieren. Für behandeltem Abwasser insbesondere das Auftreten von Östrogenen und Glukokortikoid Steroide wurde für die Verwendung von In - vitro - Transaktivierungsassays ^11,12 erfolgreich bilanziert. Allerdings haben die meisten Studien bisher eingesetzten Biotests, deren Zelllinien sind Eigentum der Firma (und somit nicht allgemein verfügbar), bedürfen ständiger Pflege und Manipulation, oder beides. Als Ergebnis wird die Fähigkeit, Protokolle zu standardisieren, führen inter-Laborkalibrierung Übungen und schließlich diese Screening-Technologie, um die Wasserressourcen zu übertragen Gemeinschaft gehinderten bleibt.

Mindestens ein Anbieter von In - vitro - Biotests durch die US ToxCast Programm überprüft , ist im Handel erhältlich ¹³ in leicht zu bedienen "Einfrieren und Auftauen4; Formate. Diese Abteilung verhaftet Zelle "Kits" wurden bei der Messung der Aktivität von Chemikalien aus dem Wasser , die verschiedene Ebenen der Behandlung ¹⁴ extrahiert werden robust gezeigt. Obwohl Anbieter Protokolle die Bioaktivität von einzelnen Chemikalien oder Mischungen zum Screenen verfügbar sind, erfordern einige von ihnen Modifikation, bevor sie an Wasserproben angewendet werden. Behandeltem Abwasser ^15, Abfluss von Regenwasser ^16, Vorfluter ^17,18 und in jüngster Zeit wieder aufbereitetem Wasser ^19,20 sind Paradebeispiele für wässrige Medien , die von Interesse für die Wasserqualität Gemeinschaft sind.

Diese Studie stellt eine einheitliche, standardisierte Protokoll , um die endokrine Aktivität in Wasserproben unter Verwendung von kommerziell erhältlichen, divisions verhaftet in vitro Trans Biotests zu messen. Wir haben gezeigt, Robustheit des Protokolls durch eine umfassende Bewertung der Hintergrund, Dosis Responsivität und Wiederholbarkeit der Reaktion für two Endpunkte von besonderem Interesse Estrogen und Glucocorticoidrezeptor Trans (ER und GR, beziehungsweise). Das Protokoll wurde auf Bildschirm Proben von behandeltem Abwasser und Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Kalifornien angewendet.

Protokoll

1. Sammeln und Prozesswasserprobe (Modified von Escher et al. ⁹⁾

1. Füllen Sie eine saubere 1 L Braunglasflasche mit 1 g Natriumazid und 50 mg Ascorbinsäure an die Spitze mit Wasserprobe von Interesse. Store Probe bei 4 ° C und Verfahren innerhalb von 72 Std.
   HINWEIS: Natriumazid ist sehr giftig und müssen mit Vorsicht behandelt werden. Verwenden Sie Schutzkleidung (Schutzbrille / Gesicht, Handschuhe, Kleidung) und wiegen in einem ordnungsgemäß funktionierenden Dunstabzugshaube. Verwenden Sie keine Metallspachtel zum Wiegen verwenden.
2. Übergeben, die Probe durch einen 1,6 um-Glasfaserfilter und dann durch eine vorkonditionierte Festphasenextraktion (SPE) Patrone mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5-10 ml / min. Einzustellen, den Druck der Vakuumpumpe die Durchflussrate zu steuern.
3. Vakuum-Trocknen Sie die Patrone für 15 min.
4. Eluieren die Patrone mit 10 ml Methanol, gefolgt von 10 ml Aceton: Hexan (1: 1, v / v).
5. Konzentrat Eluat ~ 1 ml unter einem leichten Strom von hochreinem Stickstoff. LösungsmittelAustausch von 500 ul Dimethylsulfoxid Zugabe (DMSO) und der Extrakt bis zu 500 & mgr; l verdampft.
6. Bringen Sie den Extrakt zu einem bernsteinfarbenen Glasautosamplergefäß. Lagerung bei -20 ° C.

2. Bereiten Sie Verdünnungen der Test Spezifische Referenz Chemische und Wasserextrakt

1. Bereiten 9 Verdünnungen für die Eichkurve.
   1. Machen Sie eine Stammlösung des Assays spezifischen Referenzsubstanz in 100% DMSO. Die endgültige Konzentration muss 2 uM 17β-Östradiol für die ER-Test sein, und 100 & mgr; M Dexamethason für den GR-Test. Bewahren Sie die Stammlösungen bei -20 ° C.
   2. In 15 ul der geeigneten Referenz chemischen Bestand auf 285 & mgr; l Assay-Medium in einem sterilen Röhrchen (Röhrchen # 1). Mischen Sie die Probe durch Pipettieren von oben und unten.
   3. In 200 ul einer Lösung von 5% DMSO in Testmedium in 8 zusätzliche Rohre (Rohre # 2-9).
   4. Übertragen einer 100-ul-Aliquot von Rohr # 1 bis # Rohr 2 durch Wannee # 9 mit einer 3-fach-Verdünnungsreihe durchzuführen. Jede verdünnte Probe muss gründlich mit einer Pipette gemischt werden, bevor eine aliquote Menge zu nehmen und es auf die nächste Röhre hinzugefügt wird.
2. Bereiten Sie eine Lösungsmittelkontrollprobe von 10 ul DMSO in 190 & mgr; l Assay-Medium gemischt wird.
3. Bereiten Sie vier Verdünnungen für jeden Wasserextrakt.
   1. In der ersten Röhre, fügen Sie 5 ul Wasser-Extrakt in 95 & mgr; l Assay-Medium und gründlich mischen. In 50 ul 5% DMSO in Testmedium in drei anderen Rohren.
   2. Durchführen einer 2-fachen Verdünnung von 50 ul Lösung von einem Rohr zum nächsten übertragen.

3. Bereiten Sie die Zellsuspension, die FRET-Bioassay Conduct

1. Bereiten Sie den Test spezifischen Medium gemäß den Anweisungen des Herstellers. Assaymedium muss bei 4 ° C gelagert werden und erwärmt auf 37 ° C in einem Wasserbad vor dem Gebrauch.
2. Nehmen Sie ein Fläschchen mit ER oder GR Division-arretierten Zellen aus dem Kryo-freizer und schnell die Zellen auftauen durch das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad für 2 Minuten unter leichtem Schütteln platzieren. Dekontaminieren Fläschchen mit 70% Ethanol und legen Sie es in der Klasse II biologischen Sicherheitsschrank.
3. Öffnen Sie das Fläschchen unter aseptischen Bedingungen und übertragen Sie die Zellen in 10 ml Testmedium.
4. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min.
5. Den Überstand aspirieren eine sterile Glaspipette verwendet und das Zellpellet in 6 ml Assaymedium zu resuspendieren.
6. Mischen Sie 5 ul der Zellsuspension mit 5 ul einer Vitalfärbung Lösung und fügen Sie einen aliquoten in einer Zählkammer.
7. Zählen Sie die Anzahl der lebenden Zellen unter Verwendung eines Lichtmikroskops oder automatisierten Zellzähler und schätzen Sie die Dichte der lebenden Zellen in der Zellsuspension. Verdünnen, wenn notwendig, eine Enddichte von 550.000 lebende Zellen pro ml Assay-Medium zu erhalten.

4. Platte Zellen in einer 96-Well-Black Wall Clear-Bodenplatte und hinzufügen verdünntem Wasserextrakt

1. Erstellen Sie eine PlatteLayout, das über einen 9-Punkt-Test spezifische Kalibrierungskurve, QA / QC-Proben und mehrere Verdünnungen für jeden Wasserextrakt enthält. Ein Beispiel einer 96-Well - Platte Layout ist in Abbildung 1 dargestellt.
2. In 90 ul Testmedium auf die Replikation zellfreie Kontrollvertiefungen.
3. Gießen Sie die Zellsuspension in einem sterilen Pipettieren Reservoir und fügen Sie 90 ul der Zellsuspension in den anderen Vertiefungen einer Mehrkanalpipette verwenden.
4. In 10 ul der verdünnten Proben während der Stufe 2 in die entsprechenden Vertiefungen vorbereitet. Die Endkonzentration von DMSO pro Napf muß maximal 0,5% sein.
5. Die Platte mit einem Deckel und legen Sie sie in einem 5% CO ₂ Inkubator bei 37 ° C für 16 Stunden.

Abb . 1: Beispiel einer 96-Well - Platte Layout Das Multi-Well - Platte wird entwickelt , um eine Assay - spezifische Kalibrierkurve umfassen 3 Typenvon QA / QC-Kontrollen (nur Medien, Zellen in einem sauberen Medium und Zellen in DMSO versetzt Medium) und 4 Verdünnungen pro Wasserextrakt. Für jede Kontrolle und Verdünnung von Wasserextrakt in drei Vertiefungen analysiert wird. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Bereiten Sie die Lade-Lösung und werden in jedes Well

1. Nach der Inkubation ermöglichen die Platte auf RT äquilibrieren. Zu diesem FRET-Bioassay, werden die Schritte 5.2 bis 5.6 sollte in Abwesenheit von direktem Licht durchgeführt werden.
2. Bereiten Sie eine 6-fachem Beladungslösung nach den Anweisungen des Herstellers.
3. In 20 ul der 6-fachem Beladungslösung in jede Vertiefung.
4. In 10 ul der Lebensfähigkeit der Zellen Reagens in jede Vertiefung der Zytotoxizität des verdünnten Wasserextrakt zu bewerten.
5. Verschließen Sie die Platte mit Aluminiumklebefolie.
6. Die Platte im Dunkeln bei RT für 2 Stunden.

6. Messen Zytotoxizität und endokrine Aktivität Antwort

1. Stellen Sie den Mikroplatten-Reader mit einer Bottom-Lesefähigkeiten bis nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Für die FRET-Trans Bioassay messen Fluoreszenz im blauen (409/460 nm Anregung (Ex) / Emission (Em) Wellenlänge) und Grün (409 Ex / 530 Em nm) Kanäle.
3. Für den Zytotoxizitätstest messen Fluoreszenz bei 560 Ex / 590 Em nm.

7. Beurteilen Sie QA / QC überprüft die Qualität der Daten zu bestimmen

1. Vergleichen Sie die durchschnittliche rohen Fluoreszenz der zellfreien (Medien nur) und Zellen-only (Zellen in einem sauberen Testmedium) Kontrollen. Die Medien-only Hintergrundfluoreszenz sollte mindestens 25% niedriger ist als die Antwort der Zellen-only Kontrolle.
2. Verarbeiten Sie die Roh-FRET-Daten. Für beide "blau" und "grün" Datensätze, subtrahieren die durchschnittliche Fluoreszenz der zellfreie Kontrollvertiefungen von allen Zellen gut enthält. Berechnen Sie dieBlau / Grün-Verhältnis für jeden experimentellen gut.
3. Vergleichen blau / grün-Verhältnis von Zellen-only und Zellen mit DMSO-Kontrollen. Die Fluoreszenzwerte dieser Kontrollen sollten innerhalb von 15% relative Standardabweichung (RSD) sein.
4. Zeichnen Sie die Assay-spezifische Kalibrierungskurve als blau / grün-Verhältnis gegen die Probenkonzentration als Protokollmolekularmasse ausgedrückt (log M). Berechnen Sie die Steigung, R ² und log EC ₅₀ (50% - Effekt - Konzentration). Kalibrierungsparameter sollten in Tabelle 1 aufgelistet innerhalb des erwarteten Bereichs liegen.
5. Berechnen Sie die RSD für alle drei Vertiefungen. Die Variabilität zwischen den Replikaten sollte über 20% liegen.
6. Für die Angaben zur Zytotoxizität (560 Ex / 590 Em nm), subtrahieren, um die zellfreie Kontrolle Durchschnitt (dh Medien Hintergrund) aus allen Zellen enthaltenden Vertiefungen.
7. Berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrund subtrahiert Fluoreszenz für jede Probe. Plotten der resultierenden Fluoreszenzdaten als Prozent der DMSO-Kontrolle. Probenverdünnungen sollte nichtweisen mehr als 20% Mortalität der Zellen im Vergleich zu den Zellen-only und DMSO Kontrollen.

8. Datenanalysen

1. Berechnen Sie den Test Nachweisgrenze (LOD) als Mindesteichreaktion plus zwei Standardabweichungen vom Mittelwert dieser Antwort.
2. Für Proben , die eine Dosis - Antwort zeigt, leiten die EC ₅₀   des Wasserextrakts der Steigung einer linearen Regression der Kalibrierungskurve zwischen 10 und 50% Wirkung Konzentrationen der Referenzsubstanz verwendet wird.
3. Berechnen Sie die bioanalytische Equivalent Konzentration (BEQ) unter Verwendung der Formel: BEQ = EC ₅₀ von Referenzsubstanz / EC ₅₀ von Wasserprobe.

Ergebnisse

In der vorliegenden Studie wurden 24 4x h-Mischproben der behandelten kommunalen Abwasser anfällt, 6 Schürfproben von Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Südkalifornien und ein Feld leer von Reinstwasser aus wurden ausgewählt, um dieses Protokoll zu illustrieren. 3 der 4 Abwasserproben wurden aus konventionellen Schlamm Kläranlagen aktiviert ( "secondary Abwasser"), und der vierte von einer fortgeschrittenen Kläranlage mit Sand / Kohlefiltration Post biologische Behandlung ( "tert...

Diskussion

Die gut dokumentierte Potenz von Umwelt Estrogene, wie 17β-Estradiol (E2), garantiert Screening für diese Chemikalien in ng / L - Konzentrationen ^23,24. In dieser Studie wurde die ER - Antwort für Abwasser Abwässer (BEQ Bereich: 2,3 bis 17 ng E2 / L) war etwas höher als für sekundäre Abwasser berichtet von der australischen AWBAn ^20, während die BEQs für Oberflächenwasser (<0,5 bis 4 ng E2 / L ) waren für die Oberflächen- und Regenwasser im Bereich an anderer Stelle berichtet (<1 bis 11 ng E2...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Das GeneBLAzer ER alpha DA Assay-Kit	Das ThermoFisher	K1393	Kit enthält ER-Teilungszellen (DA) und das LiveBLAzer FRET-Loading-Kit.
Das GeneBLAzer GR DA Assay-Kit	ThermoFisher	K1391	Kit enthält GR-Teilungs-arrestierte (DA) Zellen und das LiveBLAzer FRET-Loading-Kit.
PrestoBlue Reagenz für die Lebensfähigkeit der Zellen	ThermoFisher	A-13261
Trypanblau, 0,4 % in PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Auch bei ThermoFisher erhältlich
Corning 96-Well, schwarze Wand, klare Bodenplatte	Corning	3603	Einzeln verpackt, steril mit Deckel
Whatman Glasfaserfilter, GF/A, 1,6 & Mikro; M	Sigma-Aldrich
Mikroplatte Aluminium-Siegelfolie	E & K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc Kartusche, 200 mg Sorptionsmittel	Wasser	WAT106202
17β Östradiol	Sigma-Aldbsp;	E2758	CAS #50-28-2
Ascorbinsäure	Fisher Scientific	A61-100	Auch erhältlich bei Sigma-Aldrich
Dexamethason	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	molekularer Qualität
(Aceton, Hexan, Methanol)	Fisher Scientific		HPLC-Natriumazid
	Sigma-Aldrich	S2002	ist hochgiftig und muss mit Vorsicht gehandhabt werden. Tragen Sie Schutzkleidung und wiegen Sie unter einem Abzug. Auch bei EMD Millipore erhältlich.
Automatisierte Zellzähler oder Hämozytometer	Verschiedene*		Zu den Lieferanten gehören Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich und ThermoFisher.
Biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II	Verschiedenes*
CO2 Inkubator	Verschiedenes*
Kryo-Gefrierschrank	Verschiedenes*		Es wird empfohlen, Dewar zur Lagerung von flüssigem Stickstoff zu verwenden.
Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader	Verschiedene*		Das Lesegerät muss über Bottom-Read-Funktionen verfügen.
* Keine empfohlene Quelle, die Wahl dieses Geräts hängt vom Budget, der Häufigkeit der Nutzung und dem Platz im Labor ab.