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Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

DOI:

10.3791/54727

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27. Oktober 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Western University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben ein einfaches Protokoll, das nur grundlegende Laborgeräte verwendet, um große Mengen eines Fusionsproteins zu erzeugen und zu reinigen, das das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein der Maus enthält. Dieses Protein kann verwendet werden, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis zu induzieren, die sowohl von T- als auch von B-Zellen angetrieben wird.

Zusammenfassung

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Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), von der angenommen wird, dass sie als Folge von Autoimmunreaktionen auftritt, die auf Myelin abzielen. Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist das häufigste Tiermodell für ZNS-Autoimmunerkrankungen und wird typischerweise durch Immunisierung mit kurzen Peptiden induziert, die immundominante CD4+ T-Zell-Epitope von Myelinproteinen repräsentieren. B-Zellen erkennen jedoch unverarbeitetes Protein direkt, und die Immunisierung mit kurzem Peptid aktiviert keine B-Zellen, die das native Protein erkennen. Da jüngste klinische Studien mit B-Zell-depletierenden Therapien bei MS darauf hindeuten, dass B-Zellen bei der Krankheitsauslösung beim Menschen eine Rolle spielen, besteht ein dringender Bedarf an Tiermodellen, die die B-Zell-Erkennung von Autoantigenen beinhalten. Zu diesem Zweck haben wir ein neues Fusionsprotein generiert, das die extrazelluläre Domäne der Mausversion des Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteins (MOG) sowie N-terminale Fusionen eines His-Tags zur Aufreinigung und des Thioredoxin-Proteins zur Verbesserung der Löslichkeit (MOG-Tag) enthält. Eine Protease-Spaltstelle des Tabakätzvirus (TEV) wurde eingebaut, um die Entfernung aller Tag-Sequenzen zu ermöglichen, so dass nur die reine extrazelluläre Domäne MOG1-125 übrig blieb. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, bei dem nur Standard-Laborgeräte verwendet werden, um große Mengen an reinemMOG-Tag oder MOG1-125 herzustellen. Dieses Protokoll erzeugt konstant über 200 mgMOG-Tag-Protein. Die Immunisierung mitMOG-Tag oder MOG1-125 erzeugt eine Autoimmunreaktion, die pathogene B-Zellen umfasst, die das native Maus-MOG erkennen.

Einleitung

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MS ist eine menschliche Krankheit durch eine chronische Entzündung und Neurodegeneration des ZNS charakterisiert, die in Richtung Myelin gerichtet durch eine Autoimmunreaktion angetrieben wird gedacht werden. Der Verlust von Myelin und Axonen im Laufe der Zeit führen zur allmählichen Rückgang der kognitiven und motorischen Funktion 1. "Experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis" ist ein Oberbegriff für Tiermodellen von Autoimmunkrankheit zu CNS Myelin gerichtet. Wie menschliche MS wird EAE typischerweise durch Immunzellinfiltration des ZNS gekennzeichnet und in einigen Fällen Demyelinisierung 2. Um jedoch zu der Grad zu einem gegebenen EAE-Modell menschlichen MS teil ähnelt, hängt von der Spezies oder Stamm verwendet und von der Komplexität der zugrunde liegenden anti-Myelinautoimmunreaktion.

Anti-Myelin-Autoimmunität kann experimentell auf verschiedene Weise hervorgerufen werden, aber die am häufigsten verwendete Methode ist heute Mäuse mit einem kurzen Peptid von Aminosäuren zu immunisieren, die immunodominante CD4 nachahmen + T - Zell - Epitop eines Myelinprotein. Dies stellt die Mindestanforderung eine pathogene Reaktion zu induzieren. Vielleicht die häufigste von diesen ist ein 21 Aminosäure-Peptid , das von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein abgeleitet ist (MOG 35-55), die EAE verwendet wird , 3 in C57BL / 6 - Mäusen zu induzieren. Jedoch für einige experimentelle Zwecke ist es wünschenswert oder sogar notwendig, mit größeren Proteinantigenen zu immunisieren und tatsächlich gibt mehrere Vorteile dieses über Immunisierung mit kurzen Peptid. Erstens, weil der MHC-Restriktion, sind kurze Peptide Regel nur dann wirksam, in einem sehr begrenzten Bereich von Spannungen, während größere Proteinantigene, entweder das gesamte Protein oder einen bestimmten Domäne darstellt normalerweise in mehreren Inzuchtmäusestämmen zur Präsentation verarbeitet werden kann, oder sogar in anderen Spezies 4. Zweitens ist ein größeres Protein-Antigen in der Lage, eine komplexere Immunantwort enthält mehrere Arten von Lymphozyten in Antigenerkennung induzierende, anstatt limiting Antigen - Erkennung an CD4 + T - Zellen. Beispielsweise B-Zellen über den B-Zell-Rezeptor (BCR) interagieren direkt mit ganzen nicht prozessierten Proteins. Wir und andere haben gezeigt, dass B - Zellen durch MOG 35-55 Immunisierung aktiviert gezeigt nicht erkennen MOG - Protein 5. Da B - Zellen 6, die vor kurzem in der menschlichen MS gezeigt wurden Modelle EAE eine pathogene Rolle zu spielen , die B - Zellen bei Autoimmunpathologie integrieren zunehmend an Bedeutung gewinnen .

Trotz der Vorteile der größeren Protein-Antigene unter Verwendung von EAE zu induzieren, bleiben einige im Handel erhältliche Quellen für solche Proteine. Tatsächlich, während kurze Peptide wie MOG 35-55 sehr schnell synthetisiert werden kann und bei relativ niedrigen Kosten, die kommerziellen Möglichkeiten für MOG Proteins sind begrenzt und die Kosten wesentlich zu erwerben. Dennoch gibt es mehrere Expressionsvektoren für Forschungsgruppen verfügbar MOG extrazelluläre Domäne (MOG 1-125) selbst zu erzeugen. However, alle der Expressionssysteme, die in der Literatur identifiziert worden sind , auf älteren Technologien basieren , die seit mit effizienter Expressionssysteme 7 ersetzt wurden. Ferner sind die meisten 8 basierend auf Ratten- oder menschlichen MOG. Für einige Untersuchungen der Autoimmunität bei Mäusen, ein Antigen auf der Maus MOG Autoantigen basiert, ist bevorzugt. Schließlich werden alle MOG-basierten Proteine , die wir identifiziert haben, entweder kommerziell oder als Expressionsvektoren, Fusionsproteine zusätzliche Aminosäuren zum MOG 1-125 Base enthält. Dazu gehören ein Tag für die Reinigung und in der Regel andere Sequenzen als auch, von denen viele mit einer Funktion, die wir nicht in der Lage waren, zu identifizieren.

Um diese Einschränkungen zu begegnen, haben wir einen für ein Protein neuartige Fusion basiert auf der Maus MOG extrazelluläre Domäne an einen Tag fusionierten thioredoxin mit dem bekannten Unlösbarkeit von MOG - Protein 5 zu bekämpfen. Die Tag-Sequenz enthält auch eine 6xHis-Sequenz für die Reinigung und eine TEV-Protease cleAvage Seite, die für die vollständige Entfernung aller Tag-Sequenzen ermöglicht, falls gewünscht. Dies ist die einzige Methode , die wir kennen reinen MOG 1-125 Protein zu erzeugen. Zur Produktion großer Mengen an Protein zu erleichtern, wurde die MOG 1-125 - Sequenz für die bakterielle Expression-Kodon - optimierten und das MOG - Tag - Fusionsprotein wurde in den pET-32 - Expressionssystem eingesetzt wird . Hier beschreiben wir ausführlich in das Protokoll zu erzeugen und MOG - Tag - Protein zu reinigen und rein MOG 1-125, mit nicht spezialisierten Ausrüstung zur Verfügung zu den meisten Immunologie Laboratorien.

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Protokoll

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1. Protein Induction

HINWEIS: In den folgenden Schritten, BL21 Escherichia coli transformierten Bakterien mit einem pET-32 Vektor , der die Sequenz für das MOG - Tag - Fusionsprotein enthält (siehe Referenz 5 und Abbildung 1) zu hohen Dichten gezüchtet werden und dann das MOG - Tag - Protein zu exprimieren induziert . Siehe Abbildung 2 für die gesamte Timeline - beachten Sie, dass die Tage sind ungefähre Angaben und alternative Haltepunkte sind im Protokoll vermerkt. Wenn mit gereinigtem pET-32 MOG - Tag - Vektor - DNA ausgehend, wird es notwendig sein, es chemisch in kompetente BL21 E. Transformation coli - Bakterien Ampicillin - Selektion verwenden, wie bereits 9 gut beschrieben. Kann eine erfolgreiche Transformation durch Reinigen von DNA aus ausgewählten Bakterien unter Verwendung eines handelsüblichen Kits, durch Verdau mit den Restriktionsenzymen , gefolgt bestätigt werden Alter1 und Sac1 10 eine 424 bp - Bande auf einem Agarosegel herzustellen.

  1. Impfen 5 ml steriles LB-Medium (LB) Brühe (0,1 mg / ml Ampicillin) mit einem BL21-MOG - Tag Glycerolstammlösung und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 200 Umdrehungen pro Minute.
  2. Platzieren zwei 1 L Erlenmeyerkolben, die 500 ml steriles LB-Brühe in einem 37 ° C Inkubator in Vorbereitung für den nächsten Tag.
  3. Hinzufügen 500 ul 100 mg / ml Ampicillin zu jedem der Kolben, die 500 ml LB aus Schritt 1.2 (Endkonzentration 0,1 mg / ml Ampicillin). 1 ml der Übernachtkultur aus Schritt 1.1 bis jeder der beiden Kolben mit LB-Brühe. Inkubieren bei 37 ° C und 200 Upm für 5 Stunden oder bis zu einer optischen Dichte von 0,6.
  4. Nehmen Sie eine 1-ml-Aliquot von einem der Kolben und übertragen sie in einen separaten 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen bei 16.000 × g für 1 min und entfernen Sie den Überstand. Das Röhrchen als T 0 (pre-Induktion) und dann legte das Bakterienpellet in einen -20 ° C Gefrierschrank für zukünftige Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Analyse (§ 8 und Abbildung 3) zu sehen.
  5. 0,5 ml von 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid, Isopropyl β-D-thiogalactosid (IPTG) in jede Kulturflasche. Inkubieren Sie die Kolben bei 37 ° C, 200 Umdrehungen pro Minute für 4 Stunden, dann bei Raumtemperatur bei 75 Umdrehungen pro Minute über Nacht.

2. Ernte MOG - Tag - Protein

HINWEIS: In dieser Phase werden die Bakterien große Mengen an MOG - Tag - Protein produziert. Ernten MOG - Tag werden die Bakterien zunächst in einem Triton X-100 - Puffer , gefolgt durch Beschallung lysiert. MOG - Tag wird dann von inclusion bodies und denaturiert mit Imidazol und Guanidin freigesetzt, was zu einem rohen Proteinlösung die MOG - Tag - Protein enthält.

  1. Nehmen Sie eine 1-ml-Aliquot von einem der Nacht-Kulturen aus Schritt 1.5 und übertragen sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pellet die Zellen bei 16.000 × g für 1 min und entfernen Sie den Überstand. Beschriften Sie die Wannee T O / N (nach Induktion) setzen dann das Bakterienpellet in einem -20 ° C Gefrierschrank für zukünftige SDS - Page - Analyse (Abbildung 3).
  2. die Kulturen gleichmäßig auf 250 ml Flaschen kompatibel mit Hochgeschwindigkeitszentrifugieren verteilen und diese vorwärts von diesem Punkt auf Eis halten. Pellet die Bakterienzellen bei 22.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
  3. Überstand verwerfen. Lagern Sie die Bakterienpellets bei -20 ° C oder weiterhin 2,4 bis Schritt.
  4. Vorbereitung Lysepuffer (0,1 mg / ml Hühnerei-Lysozym, 0,1% Triton-X (v / v) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)) durch Zugabe von 60 ul Triton X-100 und 120 & mgr; l von 50 mg / ml Hühnerei-Lysozym Stammlösung zu 60 ml PBS.
  5. Resuspendieren und alle der Bakterienpellets aus Schritt 2.3 in insgesamt 30 ml Lysepuffer kombinieren. Übertragen Sie diese Lautstärke auf einen runden Boden 50-ml-Tube der Lage Hochgeschwindigkeitszentrifugieren. Dieses Rohr in einem 30 ° C Wasserbad für 30 min. Während der Inkubationszeit, schütteln Sie die Röhrezweimal um die Zellen zu resuspendieren.
  6. Nach der Inkubation übertragen das Röhrchen auf Eis und beschallen die Lösung bei 20 kHz, Amplitude 70%, Puls auf 3 sec, Puls ab 3 Sekunden und fünf Impulse pro Runde. Beschallen die Lösung für insgesamt sechs Runden und lassen Sie die Lösung auf Eis zu kühlen in-zwischen den Runden.
  7. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 24.000 × g für 15 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und wiederholen Sie die Schritte 2,5-2,7 einmal. Lagern Sie das Pellet bei -20 ° C oder weiterhin 2,8 bis Schritt.
  8. Bereiten Puffer A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM Imidazol, pH 7,9) durch Zusatz von 0,8766 g NaCl, 0,09456 g Tris-HCl und 0,01021 g Imidazol in einen 100 ml Becher. Hinzufügen H 2 O , bis das Volumen 28 ml erreicht dann den pH - Wert der Lösung auf 7,9 einzustellen. Dann wird die Lösung in einen 100 ml Messzylinder geben und H 2 O , bis das Volumen 30 ml ist.
  9. Resuspendieren des Pellets aus Schritt 2.7 in 30 ml Puffer A und Inkubation für 3 h dieser Lösung bei 4 ° C. Während dieser Zeitabwiegen 17,2 g Guanidin-HCl.
  10. Beschallen die Lösung auf Eis 2.6 die gleichen Einstellungen wie in Schritt verwendet wird. Dann fügen 17,2 g Guanidin-HCl zur Lösung. Inkubieren dies auf Eis für 1 Stunde das MOG - Tag - Protein löslich zu machen .
  11. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 24.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und Speichern der Überstand bei 4 ° C bis zur Proteinreinigung.

3. Protein Purification

HINWEIS: In den folgenden Schritten das MOG - Tag - Protein wird durch 4 Runden Absorption auf geladene Nickel - Harz gereinigt werden (über das His-Tag) und Elution.

  1. Nehmen Sie die folgenden Puffer:
    1. Bereiten Puffer B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM Imidazol, 6 M Guanidin-HCl, pH 7,9). Hinzufügen 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 0,0681 g Imidazol und 114,64 g Guanidin-HCl in einem 500 ml Becherglas gegeben. Dann H 2 O hinzu , bis sie 190 ml erreicht , und den pH - Wert auf 7,9 einzustellen. Übertragen Sie das Solution in einen 250 ml Messzylinder geben und H 2 O , bis das Volumen 200 ml beträgt.
    2. Vorbereitung Elutionspuffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M Imidazol, 6 M Guanidin-HCl, pH 7,9). Hinzufügen 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 6,808 g Imidazol und 114,64 g Guanidin-HCl in einem 500 ml-Becherglas. In H 2 O bis 190 ml erreicht und den pH - Wert auf 7,9. Die Lösung wird in einem 250 ml Messzylinder geben und H 2 O , bis das Volumen 200 ml beträgt.
    3. Bereiten Streifenpuffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7,9). Hinzufügen 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA in einen 500 ml Becher. In H 2 O bis 190 ml erreicht und den pH - Wert auf 7,9. Die Lösung wird in einem 250 ml Messzylinder geben und H 2 O , bis das Volumen 200 ml beträgt.
    4. Bereiten Ladepuffer (0,1 M Nickelsulfat). In 5,257 g Nickelsulfat in einen 500 - ml - Becher und fügen H 2 O bis 190 ml erreicht (VORSICHT, nicht behandeln NickelSulfat außerhalb einer Abzugshaube , bis das Nickelsulfat wurde in H 2 O) gelöst. Sobald das Nickelsulfat gelöst hat, wird die Lösung in einen 250 ml Messzylinder geben und H 2 O , bis das Volumen 200 ml erreicht.
  2. Split 10 ml Nickel-Harz zwischen zwei konische 50 ml-Zentrifugenröhrchen widerstehen kann Zentrifugalkräfte über 4.500 xg (5 ml in jedem Röhrchen).
  3. Laden und ins Gleichgewicht des Nickel Harz:
    1. Das Harz wird durch Zugabe von 40 ml H 2 O zu jedem Röhrchen enthaltenden Harz. Legen Sie die Rohre horizontal auf einer Wippe und lassen Sie sie bei 4 ° C für 5 Minuten rühren. Sobald Sie fertig sind, Zentrifuge die Röhrchen bei 4.500 × g für 8 Minuten bei 4 ° C.
    2. Überstand verwerfen durch Pipettieren zu vermeiden, um das Pellet zu stören. In 40 ml Ladungspuffer in jedes Röhrchen. Übertragen Sie die Rohre auf einer Wippe und lassen Sie sie bei 4 ° C für 15 min rühren. Sobald Sie fertig sind, Zentrifuge die Röhrchen bei 4.500 × g für 8 Minuten bei 4 ° C.
    3. Überstand verwerfen fügen Sie dann 40 ml Puffer B zu den Rohren. Übertragen Sie die Rohre auf einer Wippe und lassen Sie sie bei 4 ° C für 5 Minuten rühren. Sobald Sie fertig sind, Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 4500 × g für 8 Minuten bei 4 ° C dann den Überstand verwerfen.
  4. Optional: Nehmen Sie 150 ul des solubilisierten Proteins in Schritt gesammelt 2.11 und es in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Das Röhrchen als Vorinkubation und frieren diese bei -20 ° C für eine spätere SDS - Page - Analyse (Abbildung 3, Crude MOG - Tag).
  5. Reinige das MOG - Tag Protein:
    1. Übertragen , das gesamte Volumen des solubilisierten Proteins von Schritt 2.11 (~ 40 ml, minus den kleinen in Schritt 3.4 entnommene Probe) mit dem ersten Rohr (2, Rohr 1) , die Nickel Harz aus Schritt 3.3, mischen und legen sich horizontal auf einer Wippe bei 4 ° C für 1 Stunde.
    2. Zentrifugiere die Röhrchen bei 4.500 × g für 8 min bei 4 ° C. Sobald Sie fertig sind, den Überstand in die zweiteRohr (2, Rohr 2) aus Nickel Harz und inkubieren , wie im vorherigen Schritt beschrieben. In der Zwischenzeit weiterhin, mit den Schritten 3 bis 6 unten mit Rohr 1.
    3. Resuspendieren Nickelharz in Rohr 1 in 40 ml Elutionspuffer und das Reagenzglas horizontal auf einer Wippe bei 4 ° C für 5 min. Zentrifuge dann das Röhrchen bei 4.500 × g für 8 min bei 4 ° C.
    4. Den Überstand enthalten , eluiert MOG - Tag - Protein in einer 250 ml Flasche mit der Aufschrift "gereinigtes MOG - Tag - Protein 'und halten diese Flasche bei 4 ° C. Mit jedem Elutionsschritt bündeln, um die resultierende Überstand in dieser Flasche.
    5. 40 ml von Streifenpuffer zu dem Nickelharz und legen sich horizontal auf einer Wippe für 5 min bei 4 ° C.
    6. Zentrifugiere die Röhrchen bei 4.500 × g für 8 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, dann laden Sie den Nickel-Harz wie in Schritt 3.3 aufgeführt.
    7. Sobald Sie fertig sind, mit dem zweiten Rohr vorwärts bewegen, wie in Schritt 3.5 aufgeführt. Insgesamt 4 Rundes der Absorption des solubilisierten Proteins von Schritt 2.11 auf den geladenen Nickelharz und Elution wird das meiste Protein obwohl erholen, falls gewünscht, zusätzliches Protein konnte in weiteren Runden der Absorption und Elution zurückgewonnen werden.
  6. Nach vier (oder mehr) Runden der Absorption und Elution abgeschlossen sind, speichern Sie die gepoolten gereinigtes Protein bei 4 ° C über Nacht. Nickel Harz in 40 ml einer 20% igen Ethanollösung bei 4 ° C gelagert werden, bis sie wieder benötigt wird.

4. Messung Proteinkonzentration

HINWEIS: Bevor fortfahren es ist notwendig , die Menge an gereinigtem Protein MOG - Tag in 3 wird verwendet , um Dieser Wert Abschnitt erzeugt zu quantifizieren das Endvolumen zu bestimmen , um das Protein am Ende des Protokolls zu konzentrieren. Wir beschreiben einen Standard-Bradford-Test hier. Die Konzentration an gereinigtem Protein MOG - Tag wird durch Vergleich der spektralen Absorption von seriell DILUT bestimmted MOG tag Protein mit einer Standardkurve von Rinderserumalbumin (BSA) bei einer bekannten Konzentration.

  1. Machen 10x Acetatpuffer durch Zugabe von 23 ml Eisessig und 8,2 g Natriumacetat in einem 3 l Becherglas gegeben und dann fügen Sie 1,9 l H 2 O , um das Natriumacetat zu lösen. Diese Lösung wird in einen 2 - Liter Messzylinder und fügen Sie H 2 O , bis das Volumen erreicht 2 L. speichern Dann ist es in einem 2 - l - Flasche bei Raumtemperatur. Auffüllen auf 1 ml Acetatpuffer 1x durch Zugabe von 100 ul 10fach Acetatpuffer bis 900 & mgr; l H 2 O.
  2. eine 96-Well-Platte für Verdünnungen durch Zugabe von 30 & mgr; l 1x Acetat-Puffer in Vertiefungen G2-8 und 60 & mgr; l bis G9 ein. In 48 ul 1x Acetatpuffer zu H2 und H3.
  3. Stellen Sie die Anfangs serielle Verdünnung der BSA-Standard in der Reihe G wie folgt zusammen: In 216 ul 1x Acetatpuffer und 54 & mgr; l von im Handel erhältlichen 2 mg / ml BSA-Standard in gut G1 und gründlich mischen. In 210 & mgr; l von gut G1 bis gut G2, gründlich mischen,und dann 180 & mgr; l und G2 zu gut G3 hinzuzufügen. In 150 ul gut G3 gut G4, gründlich mischen und diesen Trend von 30 & mgr; l Zugabe weniger zu jedem nachfolgenden gut bis gut G8. (Siehe Tabelle 1 für die Listen der äquivalenten Verdünnungsfaktoren).
  4. Einrichten Dreifachproben von jeder Verdünnung von 10 & mgr; l gut G1 Transferieren zu den Vertiefungen A1, B1 und C1, und 10 ul gut G2 zu Mulden A2, B2 und C2, und so weiter. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette.
  5. So richten Sie Verdünnungen von MOG - Tag, fügen Sie 60 ul gereinigtes MOG - Tag - Protein aus Schritt 3,6 bis gut H1. In 12 ul von gut H1 bis gut H2, gründlich mischen, dann fügen Sie 12 ul gut H2 zu gut H3, gründlich mischen (dies erzeugt eine 1x Verdünnung in H1, 1/5 Verdünnung in H2 und 1/25 Verdünnung in H3) .
  6. Einrichten Dreifachproben für die MOG - Tag Verdünnungen durch Übertragung 10 & mgr; l von Vertiefungen H1-H3 an Reihen D, E und F, wie in Schritt 4.4 beschrieben.
  7. Mix 2 ml Protein Assay FarbstoffReagenz Konzentrat mit 8 ml H 2 O. Mit 200 & mgr; l dieser Mischung auf alle vorbelasteten Wells in den Reihen A, B, C, D, E und F, eine Mehrkanal-Pipette, falls vorhanden. Pop alle Blasen in den Vertiefungen unter Verwendung einer Nadel, bevor die Proteinkonzentration zu lesen.
  8. Innerhalb von 10 min den Farbstoff-Reagenz der Zugabe Messung der 595 nm Absorbanz von allen Wells in den Reihen A, B, C, D, E und F.
  9. Verwenden Reihen A, B, und C eine Standardkurve einzurichten, in denen die Positionen 1-9 entsprechen 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 und 0 mg / ml BSA. Auf der Basis dieser Kurve wird die Konzentration von MOG - Tag - Protein mit der Verdünnung von MOG - Tag, der am besten die Standardkurve passt. Normalerweise wird es 200 bis 250 mg des MOG - Tag - Protein aus 1 l Bakterienkultur unter Verwendung des Protokolls beschrieben.
    HINWEIS: Um MOG 1-125 von hier zum optionalen Abschnitt 7 am Ende des Protokolls aufgeführt vorgehen zu machen. Andernfalls fahren Sie in Abschnitt 5.

5. Dialyse

HINWEIS: Die Dialyse wird durchgeführt , um nach und nach Guanidin aus der Lösung gereinigt, vergällt MOG - Tag enthält , entfernen Sie das Protein zu ermöglichen refold. Sorgfalt muß bei diesem Schritt ist, wie es MOG selbst sehr unlöslich ist, und während dies durch das Vorhandensein des Thioredoxin-Tag verbessert wird, ist es immer noch anfällig, aus der Lösung zu kommen. Daher erfolgt nach und nach einem relativ niedrigen MOG - Tag Konzentration und sollte Neufaltung.

  1. Vor der Dialyse beginnen, verdünne das gereinigte MOG tag Protein mit Puffer B (Puffer B kann in Schritt 3.1 wie aufgeführt hergestellt werden) , bis die Konzentration 0,5 mg / ml oder weniger, bezogen auf die Menge des MOG - Tag in Abschnitt 4 berechnet.
  2. Schneiden Sie ca. 30 cm von Dialyseschlauch Schlangenhaut und sichern einen Ende mit einem Verriegelungs hemostat durch das Ende der Schlangenhaut über dreimal falten und das gefaltete Ende mit dem hemostat Klemm. Füllen Sie den Schlangenhaut mit verdünnterMOG - Tag - Protein (zwischen 60 bis 90 ml MOG - Tag - Protein pro Röhrchen) dann Luftblasen aus der Schlangenhaut entfernen , indem sie aus dem offenen Ende zu zwingen. Schließlich verschließen das andere Ende der Röhre einen zweiten Verriegelungs hemostat verwenden.
  3. Wiederholen Sie Schritt 5.2 , um weitere Abschnitte von Dialyseschlauch füllen , bis alle MOG - Tag - Protein wurde in Schlangenhaut Dialyseschlauch wurde. Achten Sie darauf, keine Lecks vorhanden sind.
  4. Machen 1x acetat mit 4 M Guanidin durch Auswiegen 382,12 g Guanidin-HCl und Zugabe von 100 ml 10-fach Acetatpuffer hergestellt in Schritt 4.1 in einen 2 l-Becherglas. Mit 0,5 l H 2 O in das Becherglas und lassen das Guanidin-HCl aufgelöst. Nach dem Auflösen wird die Lösung in einen 1 L Messzylinder geben und H 2 O , bis das Volumen erreicht 1 L. dieses Rezept Wiederholen Sie dies für alle 2 Schlangenhäute , die erforderlich sind.
  5. Führen Sie Dialyse wie folgt: Füllen Sie einen großen Eimer (mindestens 10 l) mit 1 l 1x Acetatpuffer mit 4 M Guanidin aus Schritt 5.4. Platzieren Sie oben to 2 Abschnitte Dialyseschlauch MOG - Tag in den Eimer enthält, Raum für einen Magnetrührstab verlassen im Boden ungehindert zu drehen. Setzen Sie den Eimer in einem 4 ° C Raum auf einer magnetischen Rührplatte und schalten Sie es zu einem langsamen Drehgeschwindigkeit (dh nicht hoch, gerade genug , um die Flüssigkeit zu bewegen):
    HINWEIS: Die folgenden Schritte werden, um allmählich die Menge an Guanidin in dem Puffer zu reduzieren. Stir Zeiten werden als Minimum angegeben, kann aber über Nacht stehen gelassen werden. Die Dialyse wird ein Minimum von 3 Tage dauern, kann aber verlängert werden, falls gewünscht. machen Kontrollieren Sie regelmäßig sicher, dass der Schlauch intakt ist und dass die Enden fest geschlossen sind.
    1. Lassen Sie den Eimer sitzen und rühren für 4-5 Std.
    2. 1 l 1x Acetatpuffer (100 ml 10x Acetatpuffer und 900 ml H 2 O) an jedem Eimer.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 5.5.1 und 5.5.2 insgesamt 3-mal für insgesamt 4 l Puffer in den Eimer.
    4. Entsorgen Sie die Hälfte des Puffers in den Eimer und füllen mit 1 l 1x Acetatpuffer (100 ml 10 - fach - Acetat - Puffer und 900 ml H 2 O, kein Guanidin) und den Schlauch und Rührstab eingerichtet.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 5.5.1 und 5.5.2 einmal ( das heißt , bis es insgesamt 4 l Puffer in dem Eimer ist).
    6. Schließlich ersetzen Sie die gesamte 4 l Volumen in den Eimer mit 4 l frischem Acetatpuffer 1x und lassen Sie rühren für 4-5 Std. Für beste Ergebnisse, tun Sie diesen Schritt am Tag der Proteinkonzentration.
    7. Die Dialyseschläuche mit neu gefaltet MOG - Tag vorsichtig entfernen und Eimer Puffer zu verwerfen.

6. Concentrating MOG - Tag - Protein

Hinweis: Im letzten Schritt, rückgefaltetem MOG tag Protein an die Arbeitslösung für die Lagerung eingeengt. Als MOG - Tag sehr unlöslich ist, sollte es nicht mehr als 5 mg / ml. Diese Konzentration ist etwa äquimolaren mit 0,4 mg / ml MOG 35-55 Peptid, das EAE üblicherweise verwendet wird , in Mäusen (mixed 1 zu induzieren: 1 mit komplettem Freund'schem adjuvant (CFA)). Während des Konzentrationsprozesses ist es nicht ungewöhnlich, dass eine kleine Menge von Protein aus der Lösung in Form von weißen Niederschlag zu kommen. Übermäßige Fällung ist jedoch ein Problem.

  1. Berechne die endgültige gewünschte Volumen ein MOG - Tag - Konzentration von 5 mg / ml zu erreichen, basierend auf dem Wert berechnet wird in Abschnitt 4.
  2. Linie eine Pfanne mit Aluminiumfolie und decken die Aluminiumfolie mit Polyethylenglykol (PEG) 3350 und PEG 8000 in einem Verhältnis 1: 1. Das PEG 3350 wird in diese Mischung eingebracht , wie es die Proteinaggregation während der Konzentration helfen kann verhindern , und ist eine effektive cyropreservative 11.
  3. Setzen Sie den Schlangenhaut Schlauch (mit MOG - Tag - Protein innen) auf der Oberseite der Aluminiumfolie und Deckel mit PEG 8000. Lassen Sie diese sitzen bei Raumtemperatur und überprüfen Sie die Lautstärke regelmäßig , bis das Volumen auf oder unter dem geschätzten endgültigen Volumen gleich (in Schritt berechnet 6.1) wird das tatsächliche Volumen in dem nächsten Schritt gemessen werden. Wenn die Pfanne wirdmit Wasser während des Konzentrationsprozesses übersättigten, eine frische Pfanne mit Aluminiumfolie und PEG 3350 und PEG 8000 eingerichtet.
  4. Waschen Sie die Außenseite der Schlangenhäute mit H 2 O und übertragen Sie die MOG - Tag - Protein in eine separate Glasflasche eine serologische Pipette. Verfolgen Sie die Lautstärke wie das Protein das Volumen, um sicherzustellen, übertragen wird korrekt ist.
    1. Wenn das Volumen unter dem geschätzten endgültigen Volumen reduziert wurde, fügen Sie 1x Acetatpuffer, bis die gewünschte Lautstärke erreicht ist. Wenn das Volumen über dem geschätzten Gesamtvolumen ist, übertragen Sie den Tag MOG - Protein wieder in den Dialyseschlauch und weiterhin die Konzentration (Schritte 6,2-6,3).
    2. Verteilen Sie das MOG - Tag - Protein unter 1,5 - ml - Röhrchen (0,5 ml pro Röhrchen), die Gefäße bei -80 ° C bis benötigt. Zur Induktion von EAE, mischen dieses Volumen 1: 1 mit CFA.
  5. Ausführen eines SDS - PAGE - Gel , die Expression des MOG - Tag - Protein unter Verwendung der Proben , die in den Schritten 1 genommen , um zu bestätigen.4, 2.1, 3.4, und das gereinigte Protein MOG aus Schritt 6.4.

7. Generieren von MOG 1-125 von MOG - Tag TEV Protease (Optional)

Hinweis: dieser optionale Schritt weiterhin aus dem Ende von Schritt 4. Wenn MOG 1-125 ohne zusätzliche Tag - Sequenzen benötigt wird, können die Tag - Sequenzen unter Verwendung von TEV - Protease (Figur 4) entfernt werden. Soweit uns bekannt ist, gibt es kein anderes Expressionssystem erzeugen kann reines MOG 1-125. Es sollte jedoch angemerkt werden , dass ohne die Thioredoxin - Tag, MOG 1-125 stark unlöslich ist , und dies kann zu Problemen bei der Reinigung und Handhabung verursachen, und aus diesem Grund das Tag , wenn es unbedingt erforderlich , aus experimentellen Gründen zu entfernen. Mehrere Schritte sind erforderlich , reine MOG 1-125 zu erzeugen. MOG - Tag wird zuerst in TEV - Protease - Spaltungspuffer dialysiert. Nach der Verdauung mit TEV-Protease wird das Volumen mit späteren Reinigung st zu unterstützen reduzierteps, dann in Puffer B dialysiert, und dann wird das His-Tag enthält Markierungssequenz nickel Harz entfernt werden. Schließlich Protein wird quantifiziert und reine MOG 1-125 wird auf die Endkonzentration konzentriert.

  1. Auffüllen auf 1 l 10fach TEV-Spaltungspuffer (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA) durch Zugabe von 1,861 g EDTA, 44,4 g Tris-HCl und 26,5 g Tris in einen 2 l-Becherglas. In H 2 O , bis das Volumen 990 ml erreicht dann den pH - Wert auf 8 , um das EDTA zu lösen. Die Lösung wird in einen 1 - Liter - Messzylinder und bringen das Volumen bis zu 1 L mit H 2 O.
  2. Verdünnte MOG - Tag - Protein aus Schritt 3,6 bis 0,5 mg / ml Puffer B unter Verwendung von (dem gleichen Puffer in Schritt 3.1 beschrieben), bezogen auf die Menge an Protein in Abschnitt berechnet 4. Übertragung 120 ml verdünntem MOG tag Protein Schlangenhaut Schlauch Dialyse wie beschrieben in Schritten von 5,2 bis 5,3. Das Volumen kann die Menge der TEV - Protease jedoch skaliert werden benötigt , um alle der MOG - Tag - Protein zu spalten wird substantial.
  3. Folgen Sie Protokoll, um die Dialyse aufgelistet in Schritt 5.5, außer mit 10-fach TEV-Spaltpuffer der 10-fach-Acetat-Puffer ersetzen in Schritt 7.1.
  4. Übertragen Sie die MOG - Tag, jetzt in TEV Spaltungspuffer, auf eine neue 250 - ml - Glasflasche und überwachen das erhöhte Volumen von Dialyse. 1 & mgr; l β-Mercapto-ethanol pro jede 2,85 ml MOG - Tag - Protein in die Flasche gegeben. Fügen mindestens 1 mg TEV - Protease (TEV Lager Lösung bei 5 mg / ml) für jede 50 mg des MOG - Tag - Protein (TEV Protease zu 1:10 TEV aufaddiert werden können: MOG - Protein - Verhältnis) und Inkubieren bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt mindestens 72 Stunden für.
    HINWEIS: Am Ende der TEV Protease inkubiert, weiße Niederschläge am Boden der Glasflasche gesehen werden sollte.
  5. Bevor das Protein in einen Dialyseschlauch übertragen, Guanidin-HCl zu der Lösung hinzu, bis die Proteine ​​das Protein vom Kleben an der Glasflasche um Präzipitate zu verhindern aufzulösen. Übertragung von 150 uldiese Lösung auf einem Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml und das Rohr als "MOG mit TEV" beschriften. Lagern Sie die Lösung bei -20 ° C für zukünftige SDS-PAGE-Analyse.
  6. Übertragen, die gesamte Flüssigkeit aus Schritt 7.5 in Rohr Dialyse als 5,2-5,3 in Schritten aufgeführt. Füllen Sie einen großen Eimer mit 2 l H 2 O und legen Sie die Dialyseschlauch in den Eimer. Inkubieren dies bei 4 ° C mit Licht über Nacht gerührt wurde. Dieser Schritt ist wichtig, das Guanidin zu verdünnen out die Proteinkonzentration zu ermöglichen, schnell auf, und das EDTA aus der Lösung entfernt zu beginnen, die mit der Proteinreinigung stören.
  7. Konzentriere das Protein in den Schlauch Dialyse wie in den Schritten 6,2-6,3 aufgeführt (mit Ausnahme nur verwenden PEG 8000), so daß das Endvolumen der Lösung beträgt ~ 40 ml. Waschen Sie die Dialyseschlauch mit H 2 O und entfernen jegliche restliche PEG 8000 noch mit dem Rohr befestigt. Diese Volumenreduktion ermöglicht es, das gesamte verdaute Protein in einen 50-ml-Röhrchen passen Nickel re enthält,sin, wie in Schritt 3.5 beschrieben.
  8. Dialysiere die verdaute Protein zu Puffer B:
    1. Füllen Sie einen großen Eimer mit 1 l Puffer B (29,22 g NaCl, 3,152 g Tris-HCl, 0,3405 g Imidazole, 573,18 g Guanidin-HCl, pH 7,9).
    2. Platzieren Sie die Schlangenhäute enthält verdauten Protein aus Schritt 7.7 in den Eimer zusammen mit einer stir Magneten (wie detaillierter in Schritt 5.5 beschrieben). Setzen Sie den Eimer in einen 4 ° C kalten Raum auf einer Rührplatte zu einem langsamen rühren gesetzt und lassen Sie die Schlangenhäute für 5 oder mehr Stunden dialysiert.
    3. Leeren Sie den Eimer und füllen Sie ihn mit einem anderen 1 l Puffer B und lassen diese in der 4 ° C kalten Raum auf einer Rührplatte zu einem langsamen rühren gesetzt sitzen und lassen Sie die Schlangenhäute für 5 oder mehr h dialysiert.
  9. Führen Sie die Reinigung des MOG 1-125 - Protein , wie in Abschnitt 3, mit dem wichtigen Unterschied , detailliert , dass die gespaltenen Tag - Sequenzen werden durch die Nickelharz gebunden werden, MOG verlassen 1-125 in Lösung. Auch hier werden vier Runden der Reinigung seinauf dem gleichen Volumen durchgeführt, aber in diesem Fall ist das Ziel Reinheit zu verbessern, und nicht so viel Protein wie möglich wiederherzustellen. Siehe Abbildung 4.
    1. Nehmen Sie die Proteinreinigung Puffer in Schritt 3.1 aufgeführten
    2. Aufladen beide Rohre aus Nickel-Harz, wie in Schritt 3.3 beschrieben.
    3. Reinige MOG 1-125 durch das Protokoll detailliert in Schritt 3.5, mit der wesentlichen Ausnahme , dass das Eluat aus der Nickelharz Tag verworfen (keep 150 ul des Eluats in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für zukünftige SDS-PAGE - Analyse), während die Lösung enthält MOG 1-125 wird als Endprodukt erhalten.
  10. Messen Sie die Konzentration von MOG 1-125 Protein , wie in Kapitel 4:
    1. Stellen Sie die BSA-Standardkurve Verdünnungen wie in Schritten 4.2 und 4.4 beschrieben.
    2. Stellen Sie die Verdünnungen von MOG 1-125 bis wie in den Schritten 4.5 und 4.6 beschrieben. Alternativ kann es nützlich sein, eine größere Reichweite zu erzeugenVerdünnungen (1x, 1/2, 1/4 und 1/8, zum Beispiel). Einstellen von Lautstärke von 1x Acetatpuffer und MOG 1-125 entsprechend.
    3. Führen Sie die Bradford - Assay wie in den Schritten von 4,7 bis 4,9 und berechnen Sie die Menge von MOG erzeugt 1-125 beschrieben. Die erwartete Rendite beträgt etwa 4 mg oder mehr Protein.
  11. Refold MOG 1-125 durch schrittweise Entfernung von Guanidin über Dialyse, wie in Abschnitt 5 beschrieben.
  12. Konzentrat MOG 1-125 Protein , wie in Abschnitt 6 beschrieben Die Endkonzentration sollte 2,24 mg / ml, sein , die bis 5 mg / mL MOG - Tag äquimolare ist.

8. SDS-PAGE - Gel zu bestätigen MOG - Tag Produktion und Reinheit

HINWEIS: Die Proben aus den Schritten 1.4, 2.1, 3.4, aufgenommen und 6.4 werden durch Standard - SDS-PAGE analysiert , um MOG - Tag Produktion und Reinheit zu bestätigen. Dieser Schritt sollte nach der letzten Reinigung von entweder MOG - Tag oder MOG 1-125 durchgeführt werden.

  1. Erstellen Sie eine 2x SDS-PAGE - Ladepuffer durch Zugabe von 1,576 g Tris-HCl auf 2 ml H 2 O und stellen Sie den pH - Wert auf 6,8. Hinzufügen , 0,4 g SDS in die Tris-HCl - Lösung und dann H 2 O hinzu , bis das Volumen 7 ml erreicht.
  2. Hinzufügen 0,2 g Bromphenolblau bis 10 ml H 2 O , dann 1 ml dieser zu der Lösung in Schritt 8.1 hergestellt. Schließlich, fügen Sie 2 ml Glycerin die 2x SDS-PAGE-Ladepuffer zu beenden. Wenn diese Lösung Lagerung bei 4 ° C zu halten und sie vor Licht zu schützen für bis zu 3 Monate.
  3. Auftauen der gefrorenen Aliquots von Bakterien aus den Schritten 1.4 und 2.1 sowie dem solubilisierten MOG - Tag - Protein aus den Schritten 3.4 und 6.4 bei Raumtemperatur.
  4. Entfernen Sie die Salze aus den in den Schritten gesammelt Lösungen 3.4 und 6.4 durch Zugabe von 60 & mgr; l von jedem zu Protein Entsalzungssäulen. Reinige die Proteine ​​Anweisungen des folgenden Herstellers.
  5. Geben Sie 20 & mgr; l β-Mercapto-ethanol ad 1 ml der Lösung in Schritt 8.2 hergestellt. Werden 40 ul dieser auf die beiden bacterial Pellets aus Schritt 8.3 und 60 & mgr; l zu den entsalzt Proteine ​​aus Schritt 8.4 und diese für 10 min bei 95 ° C inkubieren.
  6. Machen 1x SDS Laufpuffer Seite durch Auswiegen von 5 g Tris, 28,8 g Glycin und 1 g SDS. Fügen diese zu einem 1 L Becherglas und fügen 500 mL H 2 O , alles zu lösen. Nach dem Auflösen wird die Lösung in einen 1 L Messzylinder und füllen mit H 2 O , bis das Volumen 1 L. erreicht
  7. Einrichten dann ein 12% Polyacrylamid-Gel in einem Gel-Vorrichtung die 1x SDS-PAGE-Laufpuffer zum Gel Vorrichtung hinzuzufügen, so dass der Laufpuffer unmittelbar oberhalb der Oberseite der Vertiefungen in dem Gel ist. Waschen Sie die Vertiefungen des Gels durch Pipettieren von 50 ul jeder Puffer in die Vertiefungen fünfmal ausgeführt wird.
  8. Last 10 ul Protein Leiter in die erste Vertiefung und dann werden 10 ul der gekochten Lösungen aus Schritt 8.5 Vertiefungen zu separieren. Führen Sie das Gel bei 115 V für 60 min.
  9. Entfernen Sie das Gel aus dem Gerät und überträgt es auf einen kleinen Behälter. Füllen Sie den container mit 100 ml reinem H 2 O und Transfer für 8 Minuten , den Behälter zu einer langsam rotierenden Plattform. Nach dem 8 min, Dump das Wasser und waschen Sie das Gel zweimal mit H 2 O
  10. Dump das H 2 O aus dem Behälter und mit 100 ml schnellen stain Reagenz in den Behälter. Lassen Sie diese über Nacht auf einer langsam rotierenden Plattform zu sitzen, mit Alufolie abdecken.
  11. Dump die schnelle Fleck Reagenz und fügen Sie ca. 100 ml H 2 O in den Behälter. Erlauben diese auf einer rotierenden Plattform für 8 min zu sitzen. Dump die H 2 O und wiederholen Sie den H 2 O - Waschung zweimal.
  12. Bild das Gel einen Imager für Coomassie-Blau Flecken verwenden. Suchen Sie nach einer Band um 31.86 kDa (MOG - Tag - Protein) und eine schwächere Bande bei 63,72 kDa (MOG - Tag - Dimere).

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nachdem die Reinigung abgeschlossen ist, gesammelten Proben in den Schritten 1.4, 2.1, 3.4, und das Endprodukt aus Schritt 6.4 sollte auf einem Proteingel (3A) betrieben werden. MOG - Tag sollte zuerst erscheinen als 31,86 kDa - Bande in der T O / N Probe, aber nicht 0 T, und sollte die einzige Band in der letzten reinen Produkt. Um zu testen , ob das MOG - Tag - Protein korrekt gefaltet ist, kann das MOG - Tag - Pro...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier haben wir ein Protokoll für die Herstellung von MOG - Tag - Protein beschrieben und wie zur Erzeugung reinen MOG 1-125 aus dem MOG - Tag - Protein. Dieses Protokoll wird sowohl anhand His-Tag - basierte Proteinreinigungsverfahren auf Standard sowie einem zuvor beschriebenen Protokoll für die Erzeugung eines älteren MOG-basierten Protein - 15. Obwohl es hier nicht beschrieben wird, ist die primäre Verwendung des MOG - Tag - Protein EAE durch Immunisierung mit Pr...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Multiple Sclerosis Society of Canada unterstützt. RWJ ist Preisträger des Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Scholarship Award.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BL21 E. coli- pet32-MOGtagKerfoot LaborDiese Bakterien werden benötigt, um das MOGtagProtein herzustellen. Glycerinbestände dieser Bakterien sind auf Anfrage erhältlich.
LB Brühe MüllerBioshopLBL407.1
Ampicillinbio basicAB0028Rekonstituieren Sie das Pulver zu 50% Ethanol/ 50% H2O bei 100 mg/ml. Bei -20 μC lagern.
IPTGBioshopIPT002.5Rekonstituieren Sie das Pulver in H2O bei 1M und lagern Sie es bei -20 °C.
Hühner-Ei-LysozymBioshopLYS702.10Rekonstituieren in H2O bei 50 mg/ml und lagern bei -80 °C.
Triton-X100SigmaT-8532
Phosphatgepufferte KochsalzlösungLife Technologies20012-027Kommerzielle phosphatgepufferte Kochsalzlösung ist nicht erforderlich, jede im Labor hergestellte phosphatgepufferte Standardkochsalzlösung ist ausreichend.
NatriumchloridBioshopSOD004.1
Tris-HClBioshopTRS002.1
ImidazolBioshopIMD508.100
Guanidin-HClSigmaG3272Die Qualität muss mehr als 98% Reinheit betragen.
0,5 M EDTABioshopEDT111.500
Nickel (II)-sulfatBioshopNIC700.500
Sein BindeharzEMD Millipore69670-3In 20 % Ethanol 80 % H2O bei 4 & Grad lagern; C
Wasserfreies EthanolKommerzielle AlkoholeP016EAANNach Bedarf mit Wasser verdünnen.
EisessigBioshopACE222.1
Natriumacetat-TrihydratBioshopSAA305.500
Rinderserumalbumin StandardBio-rad500-0206
Bio-rad Protein Assay Farbstoff ReagenzkonzentratBio-rad500-0006
Ethylendiamin Tetraessigsäure, DinatriumsalzdihydratFisher scientificBP120-500
Tris-baseBioshopTRS001.1
7000 MW Schlangenhaut-DialyseschlauchThermoscientific68700
2-MercaptoethanolSigmaM3148-25mlDieses Reagenz sollte nicht außerhalb eines Abzugs gehandhabt werden.
AcTEV-Proteaselifetechnologies12575-015Die Herstellung Ihrer eigenen TEV-Protease kann mit (https://www.addgene.org/8827/) durchgeführt und wie in der Referenz gereinigt werden 17
Polyethylenglykol 3350BioshopPEG335.1
Polyethylenglykol 8000BioshopPEG800.1
Nunc MaxiSorp 96-Well-Platte mit flachem Bodenebioscience44-2404-21
UltraschallgerätFisher scientificFB-120-110
Eon Mikroplatten-SpektrometerBiotek11-120-611Dieses Gerät verwendet die Datenanalysesoftware Gen5.
Gen5 Datenanalyse-SoftwareBioTek
NatriumdodecylsulfatBioshopSDS001
BromphenolblauBioshopBRO777
GlycerolBioshopGLY001
Protein-EntsalzungssäulenThermoscientific89849
Glycin BioshopGLN001
vorgefertigtes 12% Polyacrylamid-Gelbio-rad456-1045
SchnellfärbereagenzEMD Millipore553215
Gel dock EZ Imagerbio-rad1708270
Weißlicht-Probentablettbio-rad1708272 Wird zusammen mit dem Gel Dock EZ Imager für Coomassie-Blauflecken verwendet
Proteinleiterbio-rad1610375

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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