Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der D. discoideum Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging

Zusammenfassung

Die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum wurde kürzlich als System zur Untersuchung von Proteinfehlfaltung und Proteostase etabliert. Hier beschreiben wir eine neue bildgebende Methodik, um die temperaturinduzierte Proteinaggregation und die zelluläre Stressantwort in D. discoideum zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die komplexe Lebensweise der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum macht sie zu einem wertvollen Modell für das Studium verschiedener biologischer Prozesse. Kürzlich haben wir gezeigt, dass D. discoideum bemerkenswert widerstandsfähig gegenüber Proteinaggregation ist und dazu verwendet werden kann, Einblicke in das zelluläre Proteinqualitätskontrollsystem zu gewinnen. Die Verwendung von D. discoideum als Modellsystem stellt jedoch einige Herausforderungen für mikroskopiebasierte experimentelle Ansätze dar, wie z.B. die hohe Beweglichkeit der Zellen und ihre Anfälligkeit für Phototoxizität. Letzteres erweist sich als besonders schwierig bei der Untersuchung der Proteinhomöostase, da die phototoxischen Effekte eine zelluläre Stressantwort induzieren und somit das Verhalten des Proteinqualitätskontrollsystems verändern können.

Temperaturanstieg ist eine häufig verwendete Methode, um zellulären Stress zu induzieren. In dieser Arbeit beschreiben wir ein temperaturkontrollierbares Bildgebungsprotokoll, das es ermöglicht, temperaturinduzierte Störungen in D. discoideum zu beobachten. Darüber hinaus kann dieses Bildgebungsprotokoll bei normaler Wachstumstemperatur auch die Phototoxizität spürbar reduzieren und so eine Bildgebung mit höheren Intensitäten ermöglichen. Dies kann besonders nützlich sein, wenn Proteine mit sehr niedrigen Expressionsniveaus abgebildet werden. Darüber hinaus erfordert die hohe Beweglichkeit der Zellen oft die Erfassung mehrerer Sichtfelder, um einzelnen Zellen zu folgen, und die Anzahl der Felder muss gegen das gewünschte Zeitintervall und die gewünschte Belichtungszeit abgewogen werden.

Einleitung

Dictyostelium discoideum sind Einzelgänger Boden lebenden Amöben , die auf Bakterien und anderen Mikroorganismen ernähren, die durch Phagozytose aufgenommen werden. Es hat eine einzigartige und bemerkenswerte Lebenszyklus , die einen großen Bereich der Forschung seit seiner Entdeckung ¹ gewesen ist. Das frühe Interesse an der vielzelligen Entwicklung ² und die molekularen Grundlagen der Chemotaxis ³ wurde bald durch Studien ergänzt mit Schwerpunkt auf der Zellbeweglichkeit, Zellpolarität, angeborene Immunität. Zusätzlich D. discoideum wurde als Modellsystem für die biomedizinische Forschung ^4,5 eingeführt.

Vor kurzem haben wir D. discoideum als ein neues System , das Protein Qualitätskontrolle (PQC) System ^6,7 zu studieren. Seine Proteom ist in aggregationsanfälligen Prion-ähnliche Proteine angereichert, die ⁸ eine Herausforderung für die Proteinqualitätskontrolle darstellt. Um zu untersuchen , ob D. discoideum hat spezielle molekulare Mechanismen entwickelt , seine zur Steuerung hoch aggregation anfällige Proteom, untersuchten wir das Verhalten der Aggregation neigende Proteine ​​Marker sowohl unter normalen Wachstumsbedingungen und bei Stress. Stressbedingungen, wie Wärmebeanspruchung kann die Rate der Protein misfolding ⁹ zu erhöhen verwendet werden. Deshalb haben wir versucht, ein System, wo wir Temperaturänderungen auslösen können und gleichzeitig das Verhalten von Markerproteinen folgen. Zu diesem Zweck kombiniert, wir Abbildung lebender Zellen mit Peltier-gesteuerte Erwärmung eine thermische Stufe Einsatz (Kühlkammer) verwendet wird. Diese Methode erlaubt uns eine konstante und gleichmäßige Temperatur sowie zur Aufrechterhaltung einer schnellen, aber dennoch präzise Temperaturänderung zu induzieren.

Bildgebung lebender Zellen verwendet , um eine Vielzahl von biologischen Prozessen in D. zu studieren discoideum. Allerdings steht dieser Ansatz zwei wichtige Einschränkungen. Zunächst werden die Zellen, die eine hohe Beweglichkeit anzuzeigen und neigen aus dem Sichtfeld zu wandern, wodurch einzelne Zellen verfolgen, erfordert oft Bildgebung einer großen Fläche. Die Mobilitätszelle kannvon Agar - Overlay ¹⁰ jedoch verringert werden, sind diese Bedingungen für langfristige Bildgebung aufgrund einer Abnahme der Lebensfähigkeit nicht geeignet. Zweitens D. discoideum Zellen zeigen eine besonders hohe Empfindlichkeit gegenüber Phototoxizität, die ¹¹ in Zellabrundung und mitotischen Arrest führt. Vorherige Protokolle adressiert dieses Problem durch Zugabe von Ascorbat als Radikalfänger und Reduzierung der Belichtungszeiten ^12. Letzteres kann kritisch sein, wenn das Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird, und zeigt ein schwaches Fluoreszenzsignal. Die Autoren schlagen auch vor, entweder durch Abbilden in einem klimatisierten Raum oder durch Verwendung von temperaturgesteuerte Inkubation Kästen, um eine konstante Temperatur von 21 ° C zu schaffen , die das Ziel und den Mikroskoptisch ¹² abzudecken.

Hier beschreiben wir ein Verfahren mit verbesserter Temperatursteuerung durch eine Kühlkammer unter Verwendung von auf 23 ° C eingestellt. Während der Abbildung unserer Set-up eine deutliche Steigerung der Beständigkeit gegen Phototoxizität. Eserlaubt die Verwendung von höheren Belichtungszeiten und höhere Anregungslichtintensitäten. Dies ist von besonderer Bedeutung während des Zeitraffer-Bildgebung, da die Zeitintervalle sorgfältig ausgewogen gegen die Anzahl der Positionen abgebildet werden müssen und der Belichtungszeit verwendet. Die Möglichkeit, die Anzahl der abgebildeten Positionen zu erhöhen, ermöglicht auch die Abdeckung eines breiten Abbildungsbereich und erleichtert die Verfolgung einzelner Zellen über einen längeren Zeitraum.

Protokoll

1. Zellpräparation

1. Wachsende Zellen
   1. Wachsen D. discoideum Zellen in AX - Medium bei 23 ° C unter Licht in Gewebekulturplatten. Vermeiden Sie Zellen in hoher Dichte über 75% Konfluenz zu halten.
      Hinweis: Für eine optimale Reaktion auf Hitzestress, müssen Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase zu sein und nicht die stationäre Phase erreicht haben sollte.
   2. Am Tag vor der Bildgebung, aufgeteilt Zellen in niedrige Fluoreszenzmedium (LFM) bis 1 x 10 ⁴ Zellen / ml.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, durch die AX Medium verursachte Hintergrundfluoreszenz zu verringern. Die Inkubationszeit kann auf ein Minimum von 2 Stunden reduziert werden. Doch in AX-Medium aufgenommen Bläschen können noch einige Hintergrundsignal nach 2 h erzeugen.
2. Vorbereitung Zellen für die Mikroskopie
   1. Vor Bildgebung, Ernten der Zellen aus dem Gewebeplatte in LFM und übertragen eine ausreichende Anzahl von Zellen in Glasbodenschalen.
      HINWEIS: In der Regel,1 x 10 ⁵ Zellen / ml reicht; Wenn jedoch die Versuchsaufbau lange Abbildungsperioden (mehr als 8 h) erfordert, müssen die Zellzahlen sorgfältig eingestellt werden, wie D. discoideum Zellen werden dem Entwicklungszyklus übergehen und beginnen zu streamen und zu aggregieren , wenn die Zellzahlen hoch sind , während Nährstoffe niedrig sind.
   2. Lassen Sie die Zellen für 20 min absetzen. Entfernen Sie nicht abgesetzten Zellen durch vorsichtiges das verwendete Medium durch frisches Medium ersetzt.

2. Imaging

HINWEIS: sowie in der konfokalen Mikroskopie-Setups Das Protokoll kann auf Weitfeld-Systemen verwendet werden. Die Verwendung eines temperaturgesteuerten Inkubation Box in denen die Ziele und den Mikroskoptisch ist hilfreich, aber nicht unbedingt notwendig für die Temperaturregelung. Die Temperatur der Inkubation Kasten wird auf die höchste Temperatur in dem Experiment verwendet gesetzt, beispielsweise auf 40 ° C , wenn Wärmespannung durchgeführt wird. Andernfalls wird die Temperatur auf 25 eingestellt6; C. Temperaturänderungen sollten im Voraus erfolgen, damit das System anzupassen, wie Veränderungen in der Temperatur während der Abbildung des Fokus beeinflussen können.
HINWEIS: Während der Bilderzeugung wird die Temperatur gesteuert, um eine Kühlkammer verwendet wird. Die Standardtemperatur für die Bildgebung nicht gestressten Zellen beträgt 23 ° C. Für die Wärmebelastungsbedingungen wird die Temperatur entsprechend auf das gewünschte Niveau erhöht. Das Piezoelement in der Kühlkammer kann sehr schnell auf die Temperaturverschiebung reagieren. Allerdings wird der Fokus der Bilder leicht ändern (es auf bis zu 20 & mgr; m in Abhängigkeit von der Temperaturverschiebung kann abweichen). Somit manuelle Refokussierung wird innerhalb der ersten Minuten der Bildaufnahme erforderlich ist, es sei denn, das verwendete Mikroskop mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet ist.

1. Bildaufnahme unter unbelasteten Bedingungen
   1. Bildzellen unter unbelasteten Bedingungen bei 23 ° C, mindestens 6 Sichtfelder (FOVs) erwerben.
      HINWEIS: Nicht-Spannungszustand kann visualized entweder durch eine kurze Time-Lapse (5-30 min) oder dem Erwerb von repräsentativen Standbilder aufnehmen. Für jede Bedingung oder Zelllinie ein Minimum von 6 Sichtfelder (FOVs) erwerben.
      HINWEIS: Sollten einzelne Zellen von Interesse sind, positionieren Sie die entsprechenden Zellen in der Mitte des FOV und eine 3 x 3 Fliesenserie mit dem FOV notieren Sie die Zellen von Interesse in der Mitte enthält , D.. discoideum Zellen sind frei beweglich und kann aus dem FOV migrieren. Jedoch erhöht die 3 x 3 Fliesenserie den Bereich möglicherweise durch die Zelle von Interesse untersucht und es bleibt nachvollziehbar für Zeitraffer-Perioden von ~ 6 Stunden.
   2. Erwerben z-Stapel von höchstens 7 & mgr; m in 1 bis 0,25 & mgr; m vor, um das gesamte Volumen der Zelle zu erfassen.
   3. Erwerben Bild eines Referenzhellfeld die Gesamtzahl der Zellen zu beurteilen.
2. Bildaufnahme für Hitzestress
   1. Die Temperatur der Kühlkammer auf 30 ° C gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Nachdem die Temperaturanzeige den gewünschten Wert ein, neu auszurichten manuell im Hellfeldkanal und überprüfen Sie alle aufgezeichneten FOVs vor dem Start des Zeitraffer erreicht hat.
   3. Starten Sie eine Zeitraffer 4 Stunden von Hitzestress mit einem Zeitintervall von 5-10 Minuten zwischen den Zeitpunkten. Überprüfen Sie die korrekte während der Erfassung der ersten beiden Zeitpunkte zu konzentrieren.
3. Bildaufnahme während der Wiederherstellung
   1. Nach dem Hitzestress zu reduzieren für die Temperaturanzeige auf 23 ° C, warten, bis die Temperatur wieder manuell anzupassen und neu auszurichten.
   2. Nehmen Sie Zeitrafferfilme in der Erholungsphase für 8-10 Stunden in 10-20 Minuten Zeitintervallen. Überprüfen Sie die korrekte während der Erfassung des ersten Zeitpunkt zu konzentrieren.

3. Bildanalyse

ANMERKUNG: Um die Anzahl der Zellen beherbergen cytosolischen Foci, Beurteilung der Gesamtzahl der Zellen und die Anzahl der Zellen mit cytosolischen Foci in jedem Zeit quantifizierenRahmen. Aufgrund der Schwierigkeit von Zellen aus Hellfeld- Bilder Segmentieren, muss die Quantifizierung manuell durchgeführt werden. Im Folgenden wird die Datenanalyse für die freie Bildverarbeitungspaket beschrieben ((http://fiji.sc/Fiji). Es erfordert das Plugin "Zellzähler" (http://fiji.sc/Cell_Counter).

1. Beurteilung der Gesamtzahl der Zellen
   1. Legen Sie das Hellfeld-Bildstapel (XYT), indem Sie auf "Datei" und "Öffnen".
   2. Öffnen Sie die "Zellzähler" Plugin ( "Plugins" - "Zellzähler"). Laden Sie das Bild Stapel von "initialisieren" klicken.
   3. Wählen Sie die geeignete Art von Zählern durch Ankreuzen des entsprechenden Kästchens.
      Hinweis: Verwenden Sie Typ 1 als Zähler für die Gesamtzahl der Zellen und Typ 2 als Zähler für Zellen, die mit zytosolischen Brennpunkte. Zählen Sie alle Zellen.
   4. Speichern Sie die Markierungen, indem Sie auf "Save Markers".
2. Die Beurteilung der Anzahl der Zellen mit zytosolischen Brennpunkte
   1. Legen Sie das Fluoreszenzbild Hyperstack (XZYT) ( "Datei" - "Open") und eine maximale Intensitätsprojektion der "Z-Projector" (Bild / Stacks) mit machen.
   2. Öffnen Sie die "Zellzähler" Plugin. Legen Sie das resultierende Bildstapel (XYT), indem Sie auf "initialisieren".
   3. Legen Sie die Markierungen, indem Sie auf "Load Marker".
      ACHTUNG: Die Dateinamen des Referenzbildes und der Fluoreszenz-Stack müssen identisch sein. Benennen Sie gegebenenfalls entsprechend vor dem Bildstapel initialisiert.
   4. Wählen Sie den entsprechenden Marker-Typ (siehe 3.1.3) und Zellen mit zytosolischen Brennpunkten zählen. Die bestehenden Marker können als Richtlinien für die Lage einzelner Zellen verwendet werden.
   5. Rufen Sie die Anzahl der Zählungen pro Scheibe durch einen Klick auf "Ergebnisse" und die Zählungen an anderer Stelle für weitere Berechnungen zu speichern.

Ergebnisse

Das beschriebene Bildgebungsprotokoll kann verwendet werden , um das Verhalten von aggregationsanfällig prion-ähnliche Proteine in der Amöbe D. Analyse discoideum während der Hitzestress. 1 zeigt die Verteilung von GFP-markiertem Polyglutamin - Protein - Q103 in Zellen , die unter normalen Wachstumsbedingungen (1A), nach 2 Stunden Wärmebelastung bei 30 ° C (1B) und nach 6 Stunden Stress Wiederherstellungs- und Wachstum bei normalen Wachstumsbedingungen (Abbildung 1C). Bei Temperaturerhöhung von 23 ° C bis 30 ° C, die Q103-GFP Marker verschmilzt aus einer diffusen Verteilung Strukturen punktiert. Nach dem Stressabbau und das Wachstum bei normaler Temperatur, lösen sich diese Strukturen. Die Umverteilung von Q103-GFP und die Bildung von Hitzestress induzierten cytosolischen Herde können Bildanalyse quantifiziert werden. 2A zeigt die Analyse einzelner FOVs mit Fiji und das Plugin "Cell Zähler ". 2B zeigt die Quantifizierung der Wärmestressantwort. Dies zeigt , dass die cytosolische Q103-GFP Brennpunkte Erhöhung der Zahl mit fortHitzeStress. Während Hitzestress, die Proteinqualitätskontrolle (PQC) System ist überwältigt, so Aggregations- neigen Proteine wie das Prion-like protein Q103 kann nicht in einem löslichen Zustand und zunehmend Aggregat in zytosolischen Foci aufrechterhalten werden. die Zellen auch eine charakteristische Rundungs zeigen, wie in 1B. die Reduktion der cytosolischen Foci nach Stress Entfernung dargestellt legt nahe , dass die aggregierte Proteine ​​werden gelöst.

Die Abbildungsqualität ist empfindlich gegenüber der anfänglichen Zelldichte, Fig . 3 zeigt ein Beispiel für Zellen nach der Belastungswiederherstellung geeigneten Anfangszelldichte (3A) und eine hohe Anfangszelldichte (3B) zu vergleichen. Wenn die anfängliche Zelldichte zu hoch war, Sternzellented Ströme zu bilden , wie in 3b dargestellt. Diese, die Schwierigkeiten bei der nachfolgenden Quantifizierung wie die Zellen auferlegt sind aus der Brennebene bewegt.

Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um temperaturbedingte Veränderungen zu überwachen, wie oben beschrieben. Es kann auch zu reduzieren Phototoxizität verwendet werden , wenn bei einem physiologischen Wachstumstemperatur Bildgebung. Abbildung 4 zeigt einen Vergleich der Zelle bei 23 ° C in einer Kühlkammer (4A) abgebildet und ohne Temperaturregelung in einem klimatisierten Raum abgebildeten Zellen, Set auf 25 ° C (4B). Bei konstanten Kontakt mit dem Anregungslicht runden Zellen, wenn sie nicht unter temperierten Bedingungen abgebildet. Diese Änderung in der Zellform anzeigt Stress.

Abbildung 1: D. ausgedrückt discoideum Zellen (GFP - Signal in invertierten Graustufen - Nachschlagtabelle dargestellt). (A) Unter normalen Wachstumsbedingungen bei 23 ° C, Q103-GFP diffus im Cytoplasma verteilt. (B) Nach 2 Stunden von Hitzestress bei 30 ° C, Q103-GFP verschmilzt in zytosolischen Brennpunkte (rote Pfeile). Die Zellen zeigen eine charakteristische Formänderung und abrunden. (C) Nach dem Stressabbau und das Wachstum bei 23 ° C werden die cytosolische Brennpunkte gelöst. Nach 6 Stunden, kann keine cytosolische Foci beobachtet werden. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Quantifizierung der thermisch induzierten cytosolischen Foci - Bildung (A) Analyse von Zellen , die das freie Bildverarbeitungspaket Fiji und das Plugin "Zellzähler" verwendet wird .. Die Gesamtmenge an Zellen (Typ 1, blau Zähler Marker) in der Hellfeldbild bestimmt. Die Marker werden in der GFP-Kanal und die Anzahl der Zellen mit cytosolischen Foci (Typ 2, rot Zähler Marker) geladen wird bestimmt. (B) Quantifizierung der Brennpunkte nach 3 h Wärmebelastung bei 30 ° C und 3 Stunden von Stress Erholung bei 23 ° C (n = 4 Sichtfelder, Fehlerbalken = SD). Bitte hier klicken , um eine größere Version davon zu sehen Zahl.

g> Abbildung 3: Einfluss der Zelldichte auf Zellen , die bei anfänglichen Zelldichten <10 ⁵ Zellen / ml abgebildet Langzeit Zeitraffer-Bildgebung (A).. Nach 3 Stunden von Hitzestress bei 30 ° C und 6 Stunden von Stress Erholung bei 23 ° C, bleiben immer noch Zellen im vegetativen Zyklus und dividieren. Nur wenige Zellen, die die Brennebene verlassen. (B) Zellen , die bei anfänglichen Zelldichten> 10 ⁶ Zellen / ml abgebildet. Nach 9 h Bildgebung (Einstellungen wie in A), haben Zellen, die den Entwicklungszyklus eingegeben und gestartet Streaming und aggregiert werden. Zellen in den Aggregaten nicht eindeutig unterschieden werden kann. Ein großer Teil der Zellen tritt aus der Brennebene und nicht analysiert werden kann. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abb . 4: Einfluss der Temperaturregelung auf phototoxische Effekte (A) Zellen abgebildet für 10 min mit Temperaturkontrolle bei 23 ° C: 6 Sichtfelder, z-Stapel (Abstand 0,5 uM, Probendicke 8 uM), Zeitraffer (Gesamt Zeit 10 min, Ablauf 1 min), GFP-Kanal (0,07 ms Belichtungszeit, 10% Laserintensität), RFP-Kanal (0,1 ms Belichtungszeit, 10% Laserintensität). Die Zellen zeigen keine Anzeichen der charakteristischen morphologischen Veränderungen mit phototoxischen Stress verbunden. (B) Zellen für 10 min ohne Temperatursteuerung (gleiche Bedingungen wie in A) abgebildet. Die Zellen Anzeichen einer phototoxischen induzierten Rundung aufweisen, Stress anzeigt. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Die Zellen wurden auf einem System abgebildet basierend auf einem Mikroskop mit einem 100x / 1,4 numerische Apertur (NA) Ziel. Die Bilder wurden mit einer CCD-Kamera als 1.024 x 1.024 Pixel-Dateien unter Verwendung von 1 x 1 Binning gesammelt.4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll kann das Verhalten eines bestimmten Proteins von Interesse in Reaktion auf die wärmeinduzierten Belastungen Studie verwendet werden. Temperaturerhöhung auf 30 ° C wurde berichtet Wärmebelastungsantwort auszulösen , und unter diesen Bedingungen die Lebensfähigkeit von D. discoideum ist deutlich reduziert.

Änderungen
Das Protokoll kann modifiziert werden, um das Verhalten verschiedener Proteine ​​unter den gleichen Belastungsbedingungen zu vergleichen. Dazu verschiedene Proteine ​​mit dem gleichen Fluoreszenzmarker exprimierenden Zellen werden in Multi-Well-Platten transferiert, wie vier Kammerschalen (Abschnitt 1.3.1). Das Protokoll kann auch auf Zellen co-exprimierenden Proteine ​​mit verschiedenen Markern, wie GFP oder RFP angewendet werden. Dies kann beispielsweise verwendet, um das Verhalten verschiedener Komponenten der Proteinqualitätskontrolle (PQC) System überwachen. Zellen, die GFP-markierten Aggregation Marker und andere RFP-markierte PCQ Komponenten exprimieren, können unter Verwendung von Multi-Well beobachtet werdenKlöpper für die Bildgebung. Dies gewährleistet den gleichen Belastungsbedingungen (Geschwindigkeit der Temperaturzunahme / abnahme, der Dauer der Temperaturerhöhung / Verringerung) und ermöglicht eine vergleichende Studien.

Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um den Einfluss des PQC System auf der Wärmebelastungsantwort zu untersuchen. Die Aktivität der Komponenten kann durch Ändern Expressionsniveaus unter Verwendung von genetischen Werkzeugen wie knock-out oder Überexpression oder durch Verwendung von handelsüblichen spezifische Inhibitoren ⁶ moduliert werden. Das Proteasom kann durch Zugabe von MG132 (100 uM) oder Lactacystin (10 uM) zu dem Wachstumsmedium inhibiert werden. Das Chaperon Hsp90 kann verhindert werden, indem Geldanamycin (6 uM) oder Radicicol (10 & mgr; M). Das Chaperon Hsp70 kann mit VER-155088 gehemmt werden, obwohl wir nicht die Wirksamkeit der Hemmung in unserer experimentellen Einstellungen bestätigen konnten bisher. Inhibitoren sollten 14 Stunden einen Tag vor der Bildgebung und die Zellen werden inkubiert werden.

Criti cal Schritte im Rahmen des Protokolls
Der entscheidende Schritt für die Beurteilung der wärmeinduzierte Störung ist der Zustand der Zellen vor dem Bildgebungsexperiment. Studien in Hefe zeigten , dass Zellen Resistenz gegen eine Vielzahl von Umwelteinflüssen während der stationären Phase ¹³ erwerben. Wir beobachteten auch minimale Reaktion auf angelegte Wärme Stress , wenn D. discoideum Zellen hatten stationäre Phase erreicht vor der Bildgebung. Um daher eine konstante Zellzahl aufrechterhalten <5 x 10 ⁵ Zellen / ml ist kritisch.

Darüber hinaus können hohe Zellzahlen Übergang vom vegetativen Zyklus von D. induzieren discoideum auf den Entwicklungszyklus, so auslösenden Verhungern Wege, die zu einer anderen Antwort führen könnte Stress zu erwärmen. Bei hohen Zellzahlen in der Erholungsphase nach der Hitzebelastung erreicht werden, Streaming und Aggregation - Zellen können mit der Datenanalyse stören , da die Zellen aus dem Fokus zu bewegen (siehe Abbildung 4).

Inhalt "> Einschränkung der Technik
Der Verlust des Fokus ist der Engpass des Protokolls. Bei Temperaturänderungen kann die Brennebene drastisch Verschiebung, die in einer Zeitperiode manuelle Refokussierung erfordert unmittelbar nach der Änderung der Temperatur. Der Sprung in der Fokus kann manchmal zu extrem sein durch Software Autofokus zu überwinden, insbesondere, wenn die Zeit zwischen den Zeitpunkten hoch ist. Wenn jedoch das verwendete Mikroskop mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet ist, kann dieser Engpass umgangen werden.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende Methoden
Im Vergleich zu bestehenden Aufbauten wie beispielsweise die Verwendung von klimatisierten Räumen, temperaturgesteuerte Inkubation Kästen in denen die Ziele und die Mikroskoptisch oder temperaturgesteuerten Bühnen und objektive Krägen stellt die Verwendung einer Kühlkammer, die eine genauere Steuerung der Umgebungs Temperatur. Das Peltier-Element in der Kühlkammer kann eine konstante und gleichmäßige tem aufrechtzuerhaltenperatur während des gesamten Versuchsaufbau. In der klassischen Setups können lokale Temperaturunterschiede zu unterschiedlichen Beobachtungs Ergebnissen führen. Darüber hinaus kann es schnell und rasch auf induzierte Änderungen in der Temperatur reagieren, während klassische Setups sehr langsam induzierte Temperaturänderungen anzupassen, insbesondere um die Temperatur zu senken. Das Peltier-Element in der Kühlkammer kann auch einen breiteren Temperaturbereich (15-40 ° C) als die klassischen Konfigurationen umfassen, mit dem Erreichen Temperaturen, wie 15 ° C oder 40 ° C ist sehr schwierig.

Dictyostelium discoideum ist besonders empfindlich gegenüber Phototoxizität. Frühere Studien Ascorbat als Fänger verwendet Phototoxizität zu reduzieren. Jedoch erfordern lange Bildgebungszeiten zusätzliche Ergänzung. Außerdem wird die Verwendung von Ascorbat auf Studien beschränkt, in dem der Mechanismus von Interesse nicht durch die Antioxidansergänzung beeinflusst wird. Wir schlagen vor, dass temperaturgesteuerte Bildgebung kann alternativ ca. verwendet werdenoach Phototoxizität zu minimieren und könnte unter Zugabe von Ascorbat kombiniert werden, um die Toxizität zu verringern.

Phototoxische Effekte können durch die Bereitstellung einer konstanten und gleichförmigen Temperatur von 23 ° C unter Verwendung einer Kühlkammer minimiert werden. Die Zellen mit Temperaturkontrolle abgebildet zeigen weniger Anzeichen von Phototoxizität, wie Zellabrundung, für einen längeren Zeitraum. Dies ermöglicht auch Bildgebung mit höheren Intensitäten, kleinere Zeitintervalle oder mehr Sichtfelder (FOVs).

Allgemeine Anwendung
Hitzestress bei höheren Temperaturen wurde eine unterschiedliche Wärmestressantwort ¹⁴ auszulösen gezeigt. Daher könnte eine andere Antwort induzieren, die Temperatur auf 34 ° C oder 37 ° C erhöht. Neben der Temperaturbelastung angelegt wird, kann die Dauer eines bestimmten Belastungssituation modifiziert werden, um die unmittelbare Reaktion oder langfristige Anpassung an Stress studieren zu beheizen.

In der Regel kann das beschriebene Protokoll seinauf ein breites Spektrum von Anwendungen erweitert. Da die präzise Temperaturregelung erheblich phototoxische Effekte reduziert, kann das Protokoll in den Einstellungen verwendet werden , die eine hohe Belichtungszeiten erfordern und / oder höhere Anregungslichtintensitäten, beispielsweise für Proteine mit einem niedrigen Expressionsniveau zu visualisieren, oder in Kombination mit kurzen Zeitintervallen zwischen Bildgebung, zum Beispiel während Zeitraffer-Bildgebung. Es kann auch für die Abbildung der gesamten Zelle, zB Mikrotubuli, da diese Einstellungen erfordern eine hohe Anzahl von optischen z-Abschnitte Spanning Objekte vorteilhaft sein.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AX Medium	FürMedium	AXM0102
LoFlo Medium	FürMedium	LF1001
MG132	Sigma	C2211
Lactacystin	Sigma	L6785
Geldanamycin	Santa Cruz	sc-200617
Radicicol	Santa Cruz	sc-200620
MatTek disch 35 mm	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Glasboden-Bildgebungsschale
CellViell Zellkulturschale	Greiner	627870	4-Kammer-Glasboden-Bildgebungsschale
Thermal Stage Heater/Cooler Einsatz	Warner Istruments	TB-3/CCD
Bipolarer Temperaturregler	Warner Istruments	CL-100
Flüssigkeitskühlsystem	Warner Instrumente	LCS-1