Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Benoîte Bourdin; Emilie Segura; Marie-Philippe Tétreault; Sylvie Lesage; Lucie Parent

doi:10.3791/54732

Methodenartikel

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

DOI:

10.3791/54732

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28. September 2016

Benoîte Bourdin¹ , Emilie Segura¹ , Marie-Philippe Tétreault¹ , Sylvie Lesage² , Lucie Parent¹

¹Département de Physiologie Moléculaire et Intégrative, Montreal Heart Institute Research Centre, ²Département de Microbiologie, Infectiologie, Immunologie, Centre de recherche de l'Hôpital Maisonneuve-Rosemont

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ererbten Arrhythmien werden häufig durch Mutationen verursacht, die die Oberfläche Lieferung eines oder mehrerer Ionenkanäle verändern. Hier passen wir die Durchflusszytometrie-Assays eine Quantifizierung der relativen Gesamt und Zelloberflächenproteinexpression von rekombinanten Ionenkanäle in tsa-201-Zellen exprimiert zu liefern.

Zusammenfassung

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Vererbte oder de novo Mutationen in kationenselektiven Kanälen können zum plötzlichen Herztod führen. Es wird oft postuliert, dass eine Veränderung des Plasmamembrantransports dieser mehrfach überspannenden Transmembranproteine, mit oder ohne Änderung des Kanal-Gatings, wesentlich zu diesem Prozess beiträgt. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, eine Methode zu entwickeln, mit der die Änderung der relativen Zelloberflächenexpression von kardialen Ionenkanälen in großem Maßstab quantifiziert werden kann. Hierin wird ein detailliertes Protokoll zur Bestimmung der relativen Gesamt- und Zelloberflächenexpression von kardialen L-Typ-Kalziumkanälen Ca_V1.2 und membranassoziierten Untereinheiten in tsA-201-Zellen unter Verwendung von zweifarbigen Fluoreszenzzytometrie-Assays bereitgestellt. Im Vergleich zu anderen mikroskopiebasierten oder Immunblotting-basierten qualitativen Methoden handelt es sich bei Durchflusszytometrie-Experimenten um schnelle, reproduzierbare und großvolumige Assays, die quantifizierbare Endpunkte an großen Proben lebender Zellen (von 10⁴ bis 10⁶ Zellen) mit ähnlichen zellulären Eigenschaften in einem einzigen Fluss liefern. Die Konstrukte wurden so konzipiert, dass sie mCherry konstitutiv am intrazellulären C-Terminus exprimieren (was eine schnelle Beurteilung der Gesamtproteinexpression ermöglicht) und ein extrazelluläres Hämagglutinin (HA)-Epitop exprimieren, um die Zelloberflächenexpression von Membranproteinen unter Verwendung eines anti-HA-Fluoreszenz-konjugierten Antikörpers abzuschätzen. Um falsch negative Ergebnisse zu vermeiden, wurden auch Experimente in permeabilisierten Zellen durchgeführt, um die Zugänglichkeit und korrekte Expression des HA-Epitops zu bestätigen. Das detaillierte Verfahren umfasst: (1) das Design von getaggten DNA-Konstrukten (Desoxyribonukleinsäure), (2) die lipidvermittelte Transfektion von Konstrukten in tsA-201-Zellen, (3) die Kultur, Ernte und Färbung von nicht-permeabilisierten und permeabilisierten Zellen und (4) die Erfassung und Analyse von Fluoreszenzsignalen. Darüber hinaus werden die Grundprinzipien der Durchflusszytometrie erläutert und das Versuchsdesign, einschließlich der Auswahl der Fluorophore, der Titration des HA-Antikörpers und der Kontrollexperimente, ausführlich diskutiert. Dieser spezielle Ansatz bietet eine objektive relative Quantifizierung der Gesamt- und Zelloberflächenexpression von Ionenkanälen, die zur Untersuchung von Ionenpumpen und Plasmamembrantransportern erweitert werden kann.

Einleitung

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Dieses Dokument bietet einen zuverlässigen Assay, um die relative Zelloberflächenexpression der Membranproteine wie Ionenkanäle exprimiert in rekombinanten Zellen unter Verwendung der bestehenden Technologie Durchflusszytometrie zu melden. Ionenkanäle sind porenbildende Membranproteine, die durch Gating den Fluss von Ionen durch die Zellmembran zum Steuern elektrischer Signale verantwortlich sind. Sie werden durch den Aktivierungsmechanismus, der Natur klassifiziert und Selektivität der Ionenspezies durch die Pore queren, wo sie lokalisiert sind. Auf zellulärer und Gewebespiegel, die makroskopischen Ionenflüsse durch Ionenkanäle sind das Produkt von biophysikalisch....

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Protokoll

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1. Doppelt Tagged DNA-Konstrukte

Legen Sie die HA - Epitop (YPYDVPDYA) in der extrazellulären Linker von Ca _V α2δ1 zwischen D676 und R677 durch ortsgerichtete Mutagenese (3B) ^20. Verwenden Vorwärtsprimer gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC und Reverse-Primer acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC.
Subklonierung der cDNA - Sequenz des markierten HA Ca _V α2δ1 in den Säuger pmCherry-N1 - Expressionsvektor , der das Protein an den N-Terminus von mCherry zwischen den SacI- und SalI - Stellen (3B) ²⁰ verschmolzen auszudrücken.
HINWEIS: Geeignete Kanalfunktion muss mi....

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Ergebnisse

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Dieser Artikel beschreibt ein zuverlässiges Protokoll Gesamt- und Zelloberfläche von rekombinanten Ionenkanäle in Tsa-201cells durch eine Zweifarben-Durchflusszytometrie-Assay ausgedrückt zu quantifizieren. Als Beispiel wurde die relative Zelloberfläche und die Gesamtproteinexpression für die Ca _V α2δ1subunit quantifiziert. Um wurde die Zweifarben - Durchflusszytometrie - Assay, Ca _V α2δ1 doppelt auszuführen getaggt eine extrazelluläre nichtfluoreszierenden Epitop H.......

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Diskussion

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Diese Durchflusszytometrie basierenden Assay wurde zur Messung der relativen Gesamt und Zelloberflächenniveaus von fluoreszenzmarkierten porenbildenden und die zugehörigen Untereinheiten von spannungsabhängigen Calciumkanälen ^14,22,26 erfolgreich angewendet. Es wird verwendet, am besten, wenn die Wirkung der genetischen Mutationen zu untersuchen und somit erfordert, daß die intrinsische Fluoreszenzintensität des fluoreszierend markierten markierten Wildtyp-Konstrukt sein, mindestens 10 bis 100-fach größer ist.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Wir danken Herrn Serge Sénéchal und Dr. Jacques Thibodeau dafür, dass sie ihr Fachwissen mit uns geteilt und uns Zugang zu ihrer Plattform für Durchflusszytometrie und Zellsortierung gewährt haben. Diese Arbeit wurde mit dem von den Canadian Institutes of Health Research 130256 Betriebskostenzuschuss, einem Zuschuss der Canadian Heart and Stroke Foundation und der Unterstützung von L.P. durch die "Fondation de l'Institut de Cardiologie de Montréal" abgeschlossen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Q5 Site-Directed Mutagenese Kit	New England Biolabs	E0554S	Kann durch das QuickChange Site-Directed Mutagenese Kit (Agilent, #200523) ersetzt werden.
Röhrchen 1,5 ml	Sarstedt	72-690-001
Röhrchen 15 ml	Sarstedt	62-554-002
Einweg-Messpipetten	VWR	160001-192
100 mm Kulturschale	Corning	430167	Für die Standardkultur von HEKT-Zellen.
35 mm Kulturschale	Falcon	353001	Für die Standardkultur von HEKT-Zellen.
Serologische Pipette 1 ml	Sarstedt	86.1251.001
Serologische Pipette 5 ml	Sarstedt	86.1253.001
Serologische Pipette 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
Serologische Pipette 25 ml	Sarstedt	86.1285.001
Dulbecco's High-Glucose	Medium Life Technologies	12100-046	Warm in 37 & Deg; C Wasserbad vor Gebrauch.
Fötales Rinderserum, qualifiziert, hitzeinaktiviert, Ursprung in den USA	Life Technologies	16140-071
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-019	Für die liposomale Transfektion. Kann durch Calciumphosphat-Transfektion substituiert werden.
Opti-MEM I Reduziertes Serum Medium	Life Technologies	31985-070	Warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch.
Trypsin-EDTA (1x) 0,05%, Phenolrot	Life Technologies	25300-062
1,5 ml Mikroröhrchen	Sarstedt	72.690.001
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x	Fisher	BP661-10	Kann "hausgemacht" werden.
Anti-HA FITC konjugierter Antikörper	Sigma	H7411
IgG1− FITC Isotype Control	Antikörper Sigma	F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixierung/Permeabilisierung Solution Kit	BD Biosciences	554714	Fixierung/Permeabilisierung. Permeabilisierung/Waschlösung, bei 4 & °C lagern.
Hämazytometer	Fisher	49105161
Trypan Blue	Fisher	15250061	Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erreichen.
Gekühlte Mikrozentrifuge, 5430R	Eppendorf
Forma Steri-Cycle CO₂ Inkubator	Fisher	370
Laborplattform Wippe	Fisher	545034
Wasserbad	VWR	89032-216
BD FACSARIA III	BD Biosciences	648282	Durchflusszytometer.
FlowJo Software v10	FlowJo	FlowJo v10 Dongle	Für die Datenanalyse.

A14H172200

Referenzen

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Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defec....

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Schlagwörter

Flow Cytometry Cell Surface Expression Total Protein Expression Fluorescent Antibody Staining DNA Transfection tsA 201 Cells mCherry Tagging HA Epitope Detection Permeabilized Cells Non Permeabilized Cells

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

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