Eine effiziente Methode zur Synthese von Peptoide mit gemischten Lysine-Typ / Arginin-Monomeren und die Bewertung der Anti-Leishmania-Aktivität

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll zur Synthese von Peptoiden mit gemischter kationischer Funktionalität in der gleichen Sequenz vorgestellt (Lysin- und Arginin-Typ-Monomere). Anschließende Tests dieser Verbindungen gegen Leishmania mexicana, die protozoischen Parasiten, die kutane Leishmaniose verursachen, werden ebenfalls beschrieben.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die manuelle Festphasensynthese von linearen Peptoiden, die zwei unterschiedlich funktionalisierte kationische Monomere enthalten. Bei diesem Verfahren können aminofunktionalisierte "Lysin"- und Guanido-funktionalisierte "Arginin"-Peptoidmonomere in dieselbe Peptoidsequenz eingeschlossen werden. Bei diesem Verfahren wird ein On-Harz- (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)ethyl) oder Dde-Schutz verwendet, orthogonale Bedingungen zum Boc-Schutz von Lysinmonomeren. Die anschließende Entschützung ermöglicht eine effiziente Guanidinylierungsreaktion auf dem Harz, um die Argininrückstände zu bilden. Das Verfahren ist kompatibel mit der gebräuchlichen Submonomermethode der Peptoidsynthese, so dass einfache Peptoide mit gängigen Laborgeräten und kommerziell erhältlichen Reagenzien hergestellt werden können. Die repräsentative Synthese, Reinigung und Charakterisierung von zwei gemischten Peptoiden wird beschrieben. Die Bewertung dieser Verbindungen als potentielle Antiinfektiva in Screening-Assays gegen Leishmania mexicana wird ebenfalls beschrieben. Der Protozoen-Parasit L. mexicana ist ein Erreger der kutanen Leishmaniose, einer vernachlässigten Tropenkrankheit, von der weltweit bis zu 12 Millionen Menschen betroffen sind.

Einleitung

Peptoide (oder Poly- N - substituierten Glycine) sind eine Klasse von Peptid-Mimetika , die ähnliche Eigenschaften wie Peptide und als solche bieten zunehmend für Anwendungen , medizinische und Materialien untersucht. In Peptiden ist die Seitenkette jeder Aminosäure an den α-Kohlenstoff des Amid-Rückgrat verbunden ist; in Peptoide sind die Seitenketten an das Stickstoffatom des Gerüsts verschoben. Entscheidend ist, gibt dieser Peptoide größere Resistenz gegenüber Proteolyse.

Peptoide werden unter Verwendung der Submonomer - Methode von Zuckerman Pionier allgemein synthetisiert et al., Wo Peptoid Monomere können an einen festen Träger und die anschließende Verdrängung des Halogens befestigt durch sequentielle haloacetylation einer Amin - Funktionalität aufgebaut werden , um ein primäres Amin verwendet wird . ¹ Unsere Gruppe hat kürzlich entwickelte eine Anpassung an dieses Verfahren Submonomer Lysin- und Arginin-Typ-Peptoid-Reste innerhalb der gleichen Peptoid-Sequenz für die f enthalten sein sollen, damitrste Zeit. ² Dieses Handbuch Festphasen - Ansatz Synthese zu Peptoid verwendet im Handel erhältlichen Reagenzien und gemeinsame Laborausrüstung, zugänglich für die meisten Labors zu machen. Peptoide wurden Peptide gezeigt , vielversprechende Aktivität gegen ein breites Spektrum von Gram - negativen Bakterien, Gram - positive Bakterien und Pilzarten haben, die viele bekannte antimikrobielle vergleichbar sind. ^3-9

In unserer Arbeit wurden als neue Antiinfektiva-Verbindungen zur Behandlung der vernachlässigten Tropenkrankheit Leishmaniose. ^5,10 Leishmaniose ist endemisch in mehr als 80 Ländern weltweit und es wird geschätzt , dass mehr als 12 Millionen Menschen infiziert sind global. ¹¹ Die Peptoide verwendet Krankheit wird durch einzellige Parasiten verursacht , die durch den Biss eines sandfly übertragen werden. Leishmanienspezies kutanen Leishmaniose verursachen kann, eine Bedingung , die zu Narben und Schäden an den Schleimhäuten führt, oder die lebensbedrohlichen viszeralen leishmaniasis, die tödlich Organschäden verursacht. Kein Impfstoff ist derzeit für diese Krankheit und bestehende Therapien stützen sich auf eine kleine Anzahl von Medikamenten, die starke Nebenwirkungen haben. Darüber hinaus Resistenz gegen bestehende Medikamente ist ein aufstrebendes und ernstes Problem so neue Therapien dringend benötigt werden , um effektiv Leishmaniose in Zukunft zu behandeln. ^12-16

In dieser antimikrobiellen Anwendungen werden Peptoide oft mit einem Gemisch aus kationischen und hydrophoben Monomeren sein amphipathischen gestaltet. Diese ^3,4 Peptoide einen Grad an Selektivität gegenüber Bakterienzellen geben kann, reduzieren die Toxizität für Säugerzellen, und ihre Aktivität als Molekular Transporter zu verbessern . ^17-20 enthalten die Mehrheit der anti-infektiöse Peptoide in der Literatur kationischen Seitenketten , die entweder von aminofunktionalisierten Lysin-Monomeren oder Arginin-Typ - Reste ausschließlich bestehen. Peptid-Peptoid-Chimären, in denen die kationische Ketten des a bestehenmino Säuren Lysin oder Arginin, haben auch die Wirkung der kationischen Gruppen auf Aktivität und Toxizität zu untersuchen , synthetisiert. ^21-25

Poly-Lysin Peptoide leicht synthetisiert werden können, im Handel erhältliche Boc-geschützten Aminen. Die Poly-Arginin Peptoide berichtet können mit einem Verfahren hergestellt werden , die Pyrazol-1-carboxamidin als Guanidinylierung Mittel verwendet. ^18. Dies ist jedoch nur durchgeführt werden kann , nachdem der Peptoid wurde von dem Harz und Boc - Schutz an Seitenketten entfernt, so gespalten jedes Lysin-Typ-Rest innerhalb der Sequenz wird in einen Argininrest umgewandelt. In dem Bemühen um eine Feinabstimmung der chemischen und biologischen Eigenschaften der Verbindungen, entwickelten wir ein Verfahren , das doppelten kationischer Funktionalität (beispielsweise N Lys und Arg N) in einem gegebenen Peptoid Sequenz ermöglicht zum ersten Mal aufgenommen werden. ²

Hier beschreiben wir die Synthese, Reinigung und Charakterisierung von two neuartige Peptoide, die beide Lysin- und Arginin-Reste-Typ in der gleichen Reihenfolge enthalten. Das Verfahren verwendet orthogonal N - Boc und N -Dde Schutz auf Harz mit Pyrazol-1-carboxamidine als Guanidinylierungsreagenz. Die biologische Bewertung dieser Peptoide wird auch in Zytotoxizitätstests gegen Leishmania mexicana, dem Erreger der kutanen Leishmaniose beschrieben. Dies stellt eine praktische Methode, um Peptoide mit Dual kationischer Funktionalität zuzugreifen und ihre biologische Aktivität zu beurteilen. Es wird erwartet, dass diese Methode die Synthese von amphipathischen Peptoide durch die Peptoid Gemeinschaft in Zukunft helfen werden.

Protokoll

1. Festphasensynthese von Peptoide

HINWEIS: Peptoide werden manuell mit dem submonomeren Verfahren der Festphasen-Peptoid-Synthese synthetisiert. Dieses Verfahren ermöglicht eine hohe Kopplungseffizienz und gute Endprodukt Ausbeuten. Synthese an fester Phase ermöglicht auch überschüssigen Reaktanden am Ende jeder Stufe und das Verfahren modifiziert wurde hier leicht entfernt zu werden , um verschiedene funktionalisierte kationische Monomere (dh Arginin-Typ und Lysin-Typ - Reste) ermöglichen innerhalb desselben aufgenommen werden Sequenz. ^1,2

1. Synthese eines linearen Peptoid
   Achtung: Führen Sie die Sicherheitsbeurteilungen vor der Synthese zu starten. Führen Sie alle Reaktionen in einem Abzug und tragen eine angemessene persönliche Schutzausrüstung geeignete (dh Einweg - Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel). Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie die folgenden Reagenzien und Lösungsmittel. Dimethylformamid (DMF) ist ein Verdacht teratogen und dichloromethane (DCM) ist krebserregend. N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIC) und Piperidin sind gefährlich für die Augen, die Haut, über den Atem Einatmen und kann zu Hautsensibilisierung führen. Hydrazin ist ein Verdacht, karzinogen, tödlich beim Einatmen und verursacht schwere Verbrennungen der Haut oder Augen. Bromessigsäure ist auch gefährlich für die Haut, die Augen und die Atemwege und kann zu Verbrennungen bei Kontakt verursachen. Trifluoressigsäure (TFA) ist eine flüchtige Flüssigkeit und verursachen schwere Verbrennungen so mit Sorgfalt zu behandeln. Schwerlast-Handschuhe empfohlen.
   1. Hinzufügen, 0,12 g Fmoc-geschütztem Rink-Amid-Harz (0,1 mmol, typische Beladung 0,7 mmol / g) zu einem verkappten 20 ml Polypropylen-Reaktionsgefäß mit zwei Fritten. 5 ml Dimethylformamid (DMF), um das Harz zu quellen und das Gefäß verlassen für mindestens 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Lassen Sie das DMF eine Festphasenextraktion Vakuum-Plattform.
   2. Um die Fmoc-Gruppe auf die geschwollene Harz entschützen, 2 ml Piperidin-Lösung (20% in DMF v / v). Das Gefäß wird aufeine Schütteltablar bei Raumtemperatur (450 Umdrehungen pro Minute) und 5 min schütteln. Entfernen Sie die Lösung über Vakuumstation.
      1. Wiederholen Fmoc-Abspaltung mit 2 ml Piperidin-Lösung und schütteln für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Lassen Sie nach wie vor die Lösung.
   3. Das Harz wird durch Zugabe von 2 ml DMF und Mischen des Harzes für 30 sec. Lassen Sie das DMF und wiederholen Sie drei weitere Male.
   4. Für die Acetylierung 1 ml Bromessigsäure - Lösung (0,6 M in DMF) und 0,2 ml N, N '-diisopropylcarbodiimide Lösung (DIC, 50% in DMF v / v). Verlassen Reaktionsgefäß für 20 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal.
   5. Für die Verschiebung, 1 ml Aminlösung (1,5 M in DMF). Schütteln, um das Harz für 60 min bei Raumtemperatur. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal.
      1. Um einen Arginin-Monomer hinzuzufügen, folgen Schritt 1.7. Je nach der gewünschten Peptoid-Sequenz, verschiedene Aminewird hinzugefügt werden.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.4 und 1.1.5.
   7. Um ein Guanidin funktionalisierten Monomer umfassen (dh, N Arg), 1 ml ungeschützter Diamin - Lösung (1,5 M in DMF) zu dem Harz und schütteln für 60 min bei Raumtemperatur.
      1. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal.
      2. In 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol in 0,5 ml DMF, 10 Äquivalente) die Dde-Gruppe an das freie primäre Amin zu addieren und für 60 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF dreimal.
   8. Weiterhin Submonomer-Synthese, wie in 1.1.4 bis 1.1.7, bis die gewünschte Sequenz hergestellt wird. 2 ml DMF, das Harz zu waschen und dreimal wiederholen.
   9. Um die Dde-Gruppe auf Harz entschützen, 4 ml 2% Hydrazin-Lösung (in DMF v / v) und schütteln Sie für 3 Minuten bei Raumtemperatur. Lassen Sie die Lösung und dreimal wiederholen.
   10. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml DMF drei times.
   11. Hinzufügen , Pyrazol-1-carboxamidin (6 Äquivalente pro freie Amin, das heißt pro N Arg Monomeren, in dem minimalen Volumen an DMF) und N, N - Diisopropylethylamin oder DIPEA (6 Äquivalente pro freies Amin) und schüttle bei Raumtemperatur für 60 min .
   12. Die Lösung ablaufen und wäscht das Harz mit 2 ml Dichlormethan dreimal. Lassen Sie das Harz in Luft für 10 Minuten, um zu trocknen, dann kann das Harz bis Spaltung (Abschnitt 2) gespeichert werden.
   13. Um die Synthese pausieren, waschen Sie das Harz mit 2 ml DMF dreimal. 2 ml DMF, Stopfen der Synthesebehälter und lassen bei Raumtemperatur in einem Abzug.
       HINWEIS: Die Synthese angehalten werden kann, nachdem eine Verschiebung Schritt (mit Ausnahme des zweiten Verschiebungsschritt als Diketopiperazinen gebildet werden).
2. Sidechain - Entschützung und Abspaltung vom Harz
   1. Verpflichten einen Test spalten den Fortschritt der Synthese (Reinheit und Masse) an jedem beliebigen Punkt während der Synthese nach dem displa zu überprüfenZement Schritte, Addition oder Entfernung von Dde-Schutzgruppe oder nach der letzten Sequenz gemacht wurden.
      1. Übertragen etwa 10 Harzperlen aus dem Reaktionsgefäß in eine neue 8 ml Polypropylen-Fritte Patrone.
      2. 1 ml Trifluoressigsäure Spaltung Cocktail (mit 95% TFA, 2,5% H ₂ O, 2,5% Triisopropylsilan) und schütteln Sie für 90 Minuten bei Raumtemperatur.
      3. Filtriere den TFA Spaltungscocktail aus dem Harz unter Verwendung des Frittenreaktionsgefäß in einen 10 ml-Rundkolben.
      4. Man dampft die Spaltung Cocktail am Rotationsverdampfer abgeblasen, und der sich ergebende Öl in 1 ml Acetonitril / Wasser zur Vorlage bei LC-MS oder analytische HPLC.
   2. Für die endgültige Spaltung: in der gleichen Fritten Polypropylen - Reaktionspatrone für die Synthese verwendet, 4 ml TFA - Spaltung Cocktail (95% TFA, 2,5% H ₂ O, 2,5% Triisopropylsilan) und das Gefäß bedecken. Schütteln für 90 min bei Raumtemperatur.
   3. Filter the TFA Spaltungscocktail aus dem Harz, das das Frittenreaktionsgefäß in einen 50 ml Rundkolben werden.
   4. Dampfe das Spaltungscocktail mit einem Rotationsverdampfer. Nachdem die TFA entfernt wurde, sollte das Produkt als Öl erhalten werden. Zur Unterstützung der TFA Entfernung aus diesem Rohöl, 2 ml wasserfreiem Diethylether und die Peptoid sollte auszufällen.
      1. Entweder die Diethylether über eine Pipette entfernen und zu entsorgen oder einem Rotationsverdampfer verdampft werden. Wiederholen Diethylether Fällung dreimal.
   5. Man löst das rohe Peptoid in 10 ml Acetonitril / Wasser-Lösung angesäuert (50% Acetonitril, 0,1% TFA in Wasser v / v). In Behälter vorgewogen, bei 20 ° C einfrieren und lyophilisieren zu einem trockenen Pulver.

2. Charakterisierung und Aufreinigung

HINWEIS: Die Peptoid-Synthese kann überwacht werden und die endgültige Peptoid über analytische Umkehrphasen-HPLC beurteilt unter Verwendung einer C18-Säule und electrospray Flüssig-Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS). Alle HPLC-Lösungsmittel von Lösungsmitteln für die LC-MS sollte frisch zubereitet werden.

1. analytische HPLC
   1. Wiegen 1 mg Peptoid in einem kleinen Glasfläschchen. Fügen Sie das Mindestvolumen von Acetonitril zu lösen und auf 1 ml mit Wasser verdünnen. Stellen Sie sicher, dass die Peptoid vollständig gelöst hat.
   2. Einzuspritzen 10 ul einer analytischen HPLC (vorgeschlagen Gradient 0 bis 100% Lösungsmittel B über 30 min, wobei Lösungsmittel A = 95% Wasser, 5% Acetonitril, 0,05% TFA und Lösungsmittel B = 95% Acetonitril, 5% Wasser, 0,03% TFA) , gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   3. Visualisieren bei 220 nm UV-Spektrum.
2. ESI LC-MS
   1. Auffüllen auf 1 mg / ml Peptoid-Lösung, wie in Schritt 2.1.1.
   2. Injizieren 1 ul LC-MS Elektrosprühverfahren wenn das Molekulargewicht des Ziel Peptoid zu bestimmen, vorhanden ist, den Anweisungen des Herstellers verwendet wird.
   3. Überprüfen Sie die Zielmasse der Peptoid-Sequenz eine Pept mitoid Rechner, gemäß den Anweisungen auf dem Rechner. ²⁶ Dieses Web - Dienstprogramm ermöglicht auch die Zuordnung einer Streichung / Zusatzprodukte im Massenspektrum zu sehen. ²⁶
3. Präparative Umkehrphasen - HPLC
   1. Auflösen rohe Peptoide in 2 ml angesäuertem Wasser / Acetonitril (95% Wasser, 5% MeCN, 0,1% TFA) und Reinigung durch präparative RP-HPLC unter Verwendung des Protokolls Herstellers. Bestimmen Sie die Steigung durch die Elutionszeit von analytischen HPLC und die erhaltene Menge injiziert wird von den Säulendimensionen ab.
   2. Visualisieren Sie einen Detektor eingestellt bei 220 nm verwendet wird.
   3. Sammle Fraktionen in 15 ml-Zentrifugenröhrchen bei 20 ° C und lyophilisiere einzufrieren.
   4. Re-Analyse von Fraktionen mittels LC-MS und analytische HPLC nach dem Protokoll des Herstellers. Rekombinieren gereinigten Fraktionen.

3. Biologische Testung gegen Leishmania mexicana Parasites

Caution. Die Sicherheitsbewertungen vor Beginn der Synthese durchgeführt werden muss Leishmania mexicana ist eine Gefahr für die Gruppe 2 Erreger in Großbritannien und angemessene Kontrollmaßnahmen klassifiziert vor vorhanden sein müssen Tests beginnen. Alle Arbeiten müssen entsprechend getragen in einer Klasse 2 MSW und angemessene persönliche Schutzausrüstung durchgeführt werden (dh, Nitril Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel).

1. Subculture von Parasiten
   1. Defrost 1 ml -150 ° C eingefroren Lager Leishmania mexicana M379 von Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad für 30 Sekunden platzieren.
   2. Übertragung der Stammlösung zu 10 ml Schneider-Insektenmedium (bei pH 7,0 , supplementiert mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin) in einem 25 cm ³ Zellkulturkolben , der mit einem nicht belüftete Kappe.
   3. 72 h bei 26 ° C inkubieren.
   4. Untersuchen Sie Parasiten unter dem Mikroskop (400-facher Vergrößerung) Zustand zu überprüfen. they sollte mit vielen teilender Zellen in der log-Phase Insektenstadium Promastigoten, prozyklischen Formen sein.
   5. Pflegen procyclischen Promastigoten durch Subkultivierung Parasiten zu einer Konzentration von 5 x 10 ⁵ Parasiten / ml alle drei Tage. Zählen von Zellen eine Neubauer verbesserten Zählkammer.
2. Die Transformation von L. mexicana Insekten Stadium in Säuger Stadium axenic amastigote Form ²⁷
   1. Tag 0: Vorbereiten 10 ml Kultur von log Stadium - Parasiten bei 5 x 10 ⁵ Parasiten / ml in Schneider-Insektenmedium (bei pH 7,0 , supplementiert mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin) in einem 25 cm ³ Zell Kulturflasche mit einem nicht-Filtrierkappe.
   2. für 48 Stunden bei 26 ° C inkubieren.
   3. Tag 3: Transfer 10 ml Kultur in einen 50 ml-Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 447 xg für 5 min.
   4. Gießen alte Medium ab und gibt 10 ml Schneider-Insektenmedium (bei pH 5,5, ergänzt mit 20% hessen-inaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin). Vorsichtig das Pellet von Parasiten in dem neuen Medium mit einer Pipette.
   5. Zählen Sie die Anzahl der Parasiten eine Neubauer verbesserten Zählkammer. Verdünnt auf eine Konzentration von 5 x 10 ⁵ Parasiten / ml mit pH 5,5 Medium und in einen 25 cm ³ Zellkulturflasche.
   6. für etwa 6 Tage bei 26 ° C inkubieren.
   7. Tag 9: Untersuchen Parasiten unter dem Mikroskop (400X). Sie sollten in der nicht-replizierenden, infektiöse metazyklisch promastigote Bühne.
   8. Zählen Sie die Anzahl der Parasiten eine Neubauer verbesserten Zählkammer. Verdünnt auf eine Konzentration von 5 x 10 ⁵ Parasiten / ml mit pH 5,5 Medium.
   9. Entfernen 10 ml der Zellkultur und Transfer in Zellkulturflasche. 5 Tage bei 32 ° C inkubieren.
   10. Tag 14: Überprüfen Auftreten von Parasiten unter dem Mikroskop (400X). Sie sollten in der pathogenen amastigote Stufe sein, die Geissel Charakter fehltistisch von Promastigoten und bereit für den Test.
3. Zytotoxizitätstest auf L. mexicana axenic Amastigoten.
   HINWEIS: Die biologische Prüfung der Peptoide verwendet Hochdurchsatz-Assays in 96-Well-Platten durchgeführt. Dieses Protokoll beschreibt das Testen von L. mexicana axenic Amastigoten, aber identische Assays können auch auf die Promastigoten Stadium - Parasiten in geeigneten Medien durchgeführt werden. 60 min 100 uM und anschließend 24 Stunden nach einer 10-fachen Verdünnung inkubiert - Verbindungen werden mit Parasiten in Konzentrationen von 3 inkubiert. Die Ergebnisse werden durch Messen der Fluoreszenz der Vertiefungen nach der Inkubation mit Resazurin-basierte Zellebensfähigkeit Lösung (zB alamarBlue) gewonnen.
   1. Bereiten Verbindung Stammlösungen. Abwiegen 1 mg des endgültigen gereinigten Peptoid Produkt einer Analysenwaage verwenden. Fügen Sie den entsprechenden Volumen der Molekularbiologie Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5 mM. Machen Sie 6 ul Aliquots undeinfrieren bei -20 ° C.
   2. Herstellung der Verbindung Lösungen auf 96 - Well - Platten (eine empfohlene Plattenlayout in den Ergebnisteil zu sehen ist, Figur 6) in dreifacher Ausfertigung 100-3 uM. In 2 ul 5 mM Stammlösung jeder Verbindung in der oberen Reihe (dh A). In 48 ul frisch Schneiders Insektenmedium (bei pH 5,5 und 20% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin / Streptomycin (P / S)) nach oben Reihe einen Mehrkanal-Pipette. In 25 ul Schneider-Insektenmedium für alle anderen Reihen (B - F).
      1. Führen Sie eine serielle Verdünnung durch Pipettieren von 25 ul Lösung aus der oberen Reihe. In der Zeile unterhalb und mischen. Führen Sie Verdünnungen bis zur letzten Zeile, wo die letzten 25 ul-Lösung verworfen werden sollte.
      2. Verwenden Amphotericin B (5 mM Bestände) als positive Kontrolle und DMSO (2% ige Lösung) als negative Kontrolle in dreifacher Ausführung.
   3. Bereiten Parasiten Lösung: Kultur in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei447 × g für 5 min. Gießen Sie alte Medium und 10 ml Schneider-Insektenmedium (bei pH 5,5 und 20% FBS, 1% P / S).
   4. Vorsichtig lösen sich die Pellets von Parasiten in dem neuen Medium mit einer Pipette und rechnen mit einem Neubauer verbesserten Zählkammer. Verdünnte Kultur bis 8 x 10 & ^sup6 ; Parasiten / ml.
   5. In 25 ul L. mexicana Kultur in jede Kammer . Inkubieren Platten für 60 min bei 32 ° C.
   6. Entfernen Platte aus dem Inkubator und entfernen Sie aus jeder Vertiefung 40 ul-Lösung.
   7. In 90 ul frisches Medium und Inkubation für 24 Stunden bei 32 ° C.
   8. In 10 ul Resazurin-basierte Lösung die Lebensfähigkeit der Zellen zu jeder Vertiefung. bei 32 ° C für 4 Stunden inkubiert.
   9. Messen Sie die Fluoreszenz einen Plattenleser (λ _ex = 540 nm, λ _em = 600 nm), als den Anweisungen des Herstellers. Analysieren von Daten durch die durchschnittliche Entfernung Hintergrund (von Medium nur Wells) und Vergleichen der Fluoreszenz von Brunnen nach der Normalisierung in Bezug auf ter DMSO-Kontrollen.

Ergebnisse

Als ein repräsentatives Ergebnis der Synthese und Charakterisierung von zwei 12-Rest Peptoide, enthaltend zwei Lysin-Monomeren und zwei-arginine Monomeren jeweils beschrieben. Die nachfolgenden Ergebnisse Zytotoxizitätstest werden auch gezeigt.

Zwei Peptoide [(N Narg N spe N spe) (N ae N spe N spe)] ₂ (a) und [(N hArg N spe N spe) (N Lys N spe N spe)] ₂ (b) wurden synthetisiert unter Verwendung von 120 mg Rinkamid each (Beladung = 0,79 mmol / g Harz). Alle Acetylierung und Verdrängungsschritte wurden durchgeführt, wie oben beschrieben, mit allen kommerziell erworben Reagenzien. - (-) - N spe (S) α-Methylbenzylamin, N ae N - (tert - Butoxycarbonyl) -1,2-Durchm: Für diese Rückstände wurden die folgenden Amine in dem Verschiebungsschritt verwendetinoethane, N Lys N - (tert - Butoxycarbonyl) -1,4-diaminobutan. Für die Argininderivat - Reste wurden folgende ungeschützte Diaminen gekoppelt: N hArg 1,4-Diaminobutan oder N Narg 1,2-Diaminoethan, gefolgt von on-Harz Schutz mit 2-acetyldimedone (Dde-OH). Nachdem die gesamte Sequenz synthetisiert worden war, ergibt Hydrazin Abspaltung der Dde freie Amine zu guanidinylate.

Abbildung 1. Peptoid - Strukturen (a) [(N Narg N spe N spe) (N ae N spe N spe)] ₂ und (b) [(N hArg N spe N spe) (N ng> Lys N spe N spe)] _2. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Das Verfahren für die gemischte Arginin / Lysin Peptoide synthetisieren. I. Standard-Verdrängungsschritt im submonomeren Verfahren mit Diamin; ii. Die Zugabe von Dde-OH, 90 Minuten schützen freie Amin; iii. Weitere Ergänzungen der Peptoid-Kette unter Verwendung des Submonomer-Verfahren zu verlängern; iv. Entschützung von Dde 2% Hydrazin in DMF verwendet wird; V. Guanidinylierung des freien Amins auf Harz mit Pyrazol-1-carboxamidine und DIPEA in DMF; vi. Saure Spaltung vom Harz und die Entfernung der Schutzgruppe von Boc-Gruppen.large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Nach der Spaltung vom Harz und Lyophilisierung wurden die Rohprodukte als weißes Pulver erhalten: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Produkte wurden mittels RP-HPLC gereinigt, wie es mit höchstens 50 mg Injektionen unter Verwendung einer LC-Pumpe mit einem UV-VIS-Detektor (λ = 250 nm) auf einer analytischen Säule beschrieben, 250 mm x 10 mm, 5 & mgr; m; Fließgeschwindigkeit = 2 ml / min. Fraktionen, die die Zielmasse entsprechen, wurden kombiniert und als weiße Pulver erhalten: (a) 54 mg (b) 65 mg, endgültige Ausbeuten von ca. 30% für Anteile> 90% rein.

Die endgültige Verbindung Identitäten nach der Reinigung wurden mittels LC-MS (siehe Abbildung 3) bestätigte ein Triple - Quadrupol - Massenspektrometer mit einem UPLC ausgestattet ist und einem Photodiodenarray - Detektor. Die genaue Massenspektrometrie wurde unter Verwendung des gleichen Spektrometer auf T unternommen er [M + 2H] ²⁺ -Ionen. Die folgenden berechneten und beobachteten Massen wurden in enger Übereinstimmung (Abbildung 4): (a) berechnet = 896,0026 amu beobachtet = 896,0038 amu; (B) berechnet = 952,0691 amu beobachtet = 952,0730 amu.

Abbildung 3. LC-MS für gereinigtes Peptoide. (A) m / z = 1.792 und (b) m / z = 1.903. Wo die obere TIC ist, mittlere LC-MS - Spektrum, unten UV - Chromatogramm bei 220 nm. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4. Genaue Massenspektrometrische Daten für Peptoide (a) und (b)."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Produktreinheit wurde (mit einem UV-VIS-Detektor auf einer analytischen Säule LC Pumpe, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 & mgr; m; Fließgeschwindigkeit = 1 ml / min) unter Verwendung einer analytischen RP-HPLC untersucht, und bei 220 nm sichtbar gemacht, die Extinktion von Amid - Rückgrat. 5a und 5b zeigt , daß die Verbindungen homogen sind.

Figur 5. Analytische HPLC für die gereinigten Peptoide (a) und (b). Es gibt einen Gradienten von 0-100% B über 30 min, Säulenofen bei 40 ° C (A = 95% H ₂ O, 5% MeCN, 0,05 % TFA;. B = 95% MeCN, 5% H ₂ O, 0,03% TFA) cl Bitteick hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die gereinigten Peptoide (a) und (b) wurden in Zytotoxizitätsassays gegen L. getestet mexicana axenic Amastigoten. Gefrorene Bestände von L. mexicana wurden aufgetaut und in die amastigote Bühne bereit für den Test umgewandelt. 72 Stunden nach dem Auftauen sollte die Parasiten Insekt Stufe Promastigoten in ihrer prozyklischen Form sein, in der log-Phase mit vielen teilender Zellen. In diesem Stadium können die Parasiten in den amastigote Stufe unter Verwendung des pH und Temperaturverschiebung beschrieben. ²⁷ am Tag 9 der Transformation transformiert werden, werden die Parasiten in den nicht-replizierenden infektiösen metazyklisch promastigote Stufe. Schließlich am 14. Tag sollten die Parasiten in der pathogenen amastigote Stadium, wo Parasiten die charakteristische Geißeln der Promastigoten fehlen. ²⁸

5 mM Stammlösungen der Verbindungen wurden in Zellkultur DMSO und getestet in dreifacher Ausführung hergestellt aufmindestens zwei Gelegenheiten eine robuste Datensatz, um sicherzustellen, wurde gesammelt. Ein repräsentativer 96-Well - Platte Plan ist in Figur 6 gezeigt ist . Am Ende des Tests wurde die Lebensfähigkeit der Zellen Reagenzes zu jeder Vertiefung und die Fluoreszenz hinzugefügt wurde gemessen , wie beschrieben , getestet , um die Lebensfähigkeit der Parasiten bei jeder Konzentration zu berechnen (siehe Abbildung 7 ). ED ₅₀ -Werte wurden als Peptoid (a)> 100 uM und Peptoid (b) 37 uM jeweils berechnet. Die Fehlerbalken aufgetragen, um die Unterschiede zwischen den Vertiefungen als Standardabweichung zeigen und es ist zu erkennen, dass diese angemessen sind für die meisten Bars.

Abbildung 6. Repräsentative 96 - Well - Platte Plan für einen Zytotoxizitätstest auf 2 Peptoid - Lösungen (einschließlich positiver und negativer Kontrollen). Med + = mittel (Schneiders Insektenmedium, pH 5,5, 20% FBS, 1% P / S). L. mex. =8 x 10 ⁶ / ml Parasit Kultur in med +. AmphoB = 5 mM in DMSO. Peptoid = 5 mM Stammlösung in DMSO. Leere Brunnen sollte steriles Wasser enthalten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. Die Ergebnisse aus Zytotoxizitätstest gegen L. mexicana axenic amastigote Parasiten unter Verwendung von Peptoid (a) und (b). Es ist ersichtlich, dass der Peptoid (b) ist wirksamer als Peptoid (a) auf den Prozentsatz der lebensfähigen Parasiten reduzieren, wobei beide Verbindungen eine dosisabhängige Wirkung. Die Fehlerbalken zeigen die Veränderung zwischen den Wells als Standardabweichung aufgetragen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Peptoide werden zunehmend in der chemischen Biologie und der medizinischen Chemie Felder in Anwendungen wie neuartige Therapeutika untersucht ^3-5, Zellabgabemittel ^18,20 und Diagnose - Tools. ²⁹ Typischerweise sind diese Sequenzen sind kationische eine gewisse Selektivität für den Krankheitserreger zu schaffen über Säugetierzellen, die Fähigkeit, durch Zellmembranen zu durchdringen und auch die Löslichkeit in wässrigen Systemen unterstützen. Es gibt zahlreiche Beispiele von kationischen Peptoide, die ausschließlich Lysin- oder Arginin-mimetische Reste in der Literatur enthalten. Jedoch bisher die Synthese von Peptoiden, die beide dieser kationischen Reste in der gleichen Sequenz enthalten wurde durch den Mangel eines geeigneten Syntheseverfahren behindert. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht gemischte kationische Peptoide in einer effizienten Weise zu synthetisierenden und ist sehr wünschenswert, da sie einen Weg bietet, die biologischen und chemischen Eigenschaften der amphipathischen Peptoide zu modulieren.

nt "> Unser Verfahren verwendet eine Anpassung an die Submonomer Peptoid-Synthese allgemein verwendet und ermöglicht die Zugabe beider Lysin- und Arginin-Monomeren innerhalb der gleichen Sequenz. Es verwendet Kopplungen Raumtemperatur und etablierten Schutzgruppenchemie so ist es, dass dieses Verfahren zu erwarten ist eine Vielzahl von Diaminen kann, wird für die meisten Forschungsgruppen nützlich sein. Um orthogonale Schutz für die Arginin-Typ-Rest hinzufügen, wird ein ungeschützter Diamin unter Standardverdrängungsbedingungen gegeben und dann in einem 60-Minuten-Kupplung mit Dde-OH geschützt. sein verwendet , die jeweils Seitenketten von 2 Kohlenstoffatomen bis 6 Kohlenstoffe lang installiert werden, das heißt, 1,2-Diaminoethan zu 1,6-Diaminohexan werden können. Die Schutz Dde-OH löst sich gut in DMF und ist eine sehr effiziente und selektive Schutzgruppe für primäre Amine. die Dde-Schutzgruppe verlässt sekundären Aminen nicht betroffen, zum Beispiel die ungeschützten N - Terminus von Peptoid - Kette. ³⁰ Eine Einschränkung besteht darin , dass die syn alleArbeit wurde manuell durchgeführt werden; jedoch wird erwartet, daß die Kopplungsbedingungen entwickelt das Verfahren zugänglich für die Verwendung mit automatisierten Peptid / Peptoid Synthesizern machen.

Die auf Harz Entschützung der Dde-Gruppen wird mit einer 2% Hydrazin-Lösung in DMF durchgeführt, um freie Amine lassen, die auf Harz unter Verwendung von Pyrazol-1-carboxamidine guanidinylated werden kann. Sechs Äquivalente des Pyrazol-1-carboxamidine und sechs Äquivalenten DIPEA pro freie Amin auf dem Harz verwendet werden (dh sechs Äquivalente für jedes N Arg Monomer installiert werden). Wiederum ist diese Reaktion auch effizient und die Pyrazol-1-carboxamidin Reagenz eine gute Löslichkeit in DMF hat. Beendigung der Reaktion wird in der Regel über LC-MS nach 60 Minuten bei Raumtemperatur angesehen.

Aufgrund der Vielseitigkeit der Submonomer-Verfahren kann eine Vielzahl von primären Aminen in der Verdrängungsstufe verwendet werden, so können die Bedingungen benötigen, zu erhöhen Kupplungs effi optimiert werdenzienz und die allgemeine Produktausbeuten oder Reinheit. ³¹ für die Sequenzen oben diskutiert wurde , waren keine besonderen Voraussetzungen für eine erfolgreiche Kupplungen. Allerdings könnten längere Verschiebung Zeiten oder höhere Aminkonzentrationen für problematische Verschiebungen verwendet werden (dh für schlecht nukleophilen oder sperriger Amine). Manche Amine können nicht vollständig löslich in DMF, in diesem Fall ist es empfehlenswert, diese in N - Methyl-2-pyrrolidon (NMP) oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel für Festphasenreaktionen statt , wie in einem vorhergehenden umfassende Methode zur Synthese Submonomer aufzulösen von Peptoiden. ³² einzuarbeiten Monomere , die ungeschützte Heteroatome in den Seitenketten, Acetylierung unter Verwendung von Chloressigsäure enthalten , wurde von anderen Gruppen als wirksam erwiesen. ³³ Zusätzlich können andere Harze , die mit diesem Verfahren verwendet werden können Peptoide mit unterschiedlichen C - terminalen Funktionalisierung zu ergeben. Wang-Harze und 2-Chlortritylchlorid-Harze werden in die routinemäßig verwendetsubmonomeren Synthese von Peptoide. Beispielsweise wurde dieses Verfahren erfolgreich mit 2-Chlortritylchlorid - Harz , in unsere Gruppe verwendet. ² verschiedene feste Träger wird eine andere Ladevorgang erfordern Rinkamid hier diskutiert (abhängig von der spezifischen verwendeten Harzes) , so sollte dies mit der Literatur überprüft werden , vor der Synthese.

Ähnlich wie die Peptidsynthese, die Bedingungen für die abschließende Abspaltung der Peptoid-off-Harz kann auch für die spezifische Sequenz optimiert werden. In diesem Protokoll wurde ein TFA Spaltungscocktail (mit Triisopropylsilan und Wasser als Fänger) verwendet. Die Peptoide hier vorgestellten enthielt nur Boc-Schutz, die eine einigermaßen säurelabile Gruppe ist. Um eine vollständige Entfernung der Schutzgruppen von Sequenzen mit einem größeren Anteil von Schutzresten oder weniger säurelabilen Schutzgruppen, längere Spaltungszeiten erforderlich sein können (dh Spaltungszeiten von mehr als 2 Stunden werden für Sequenzen empfohlen, Pbf oder tertiär-bu enthaltentyl Ester geschützten Gruppen). Alternative Fängern kann auch für spezielle Seitenketten verwendet werden (beispielsweise Ethandithiol oder 2-Mercaptoethanol häufig in Peptiden verwendet werden, die schwefelhaltige Seitenketten wie Cystein oder Methionin).

Der biologische Test vorgestellt, ist ein Standard-Zytotoxizitätstest, die verändert werden können, verschiedene Zelllinien anpassen. Es ist wichtig zu beachten, dass jeder 96-Well-Platte ausreichende Kontrollen das Vertrauen in die erzielten Ergebnisse zu ermöglichen, enthalten sollte. In diesem Fall wird Amphotericin B als positive Kontrolle verwendet, da es ein bekanntes Medikament verwendet wird, um die Krankheit zu behandeln und DMSO wird als negative Kontrolle verwendet, da dies das Lösungsmittel, um Verbindung Bestände für den Assay verwendet wird. Wenn andere Zelllinien verwendet werden, alternative, sollten geeignete Kontrollen erhalten und vor Gebrauch validiert werden. L. mexicana ist mit dem Peptoid bei Konzentrationen zwischen 100 und 2 & mgr; M für eine Stunde inkubiert und dann der Parasit / Peptoid - Lösung wird verdünnt , indemein Faktor von zehn für die Inkubation über Nacht (dh Brunnen zunächst mit 100 & mgr; M Peptoid Lager sind auf 10 uM verdünnt).

Die Lebensfähigkeit der Zellen Reagens wird am Ende des Tests in jede Vertiefung (10% der Gesamtvertiefungsvolumen) zugegeben. Eine sichtbare Farbänderung wird zwischen Brunnen mit lebensfähigen Parasiten (pink), Kontrollvertiefungen ohne tragfähige Parasiten (blau) und einem Spektrum zwischen mit Zwischen Zahlen von lebenden Parasiten gesehen. Die Fluoreszenz ist proportional zur Anzahl der lebenden Zellen und entspricht der Stoffwechselaktivität der Zellen; Resazurin Farbstoff (nicht fluoreszierenden) mit dem fluoreszierenden Resorufin durch Reduktionsreaktionen in metabolisch aktiven Zellen umgewandelt. ³⁴ In diesem Test wird die Inkubationszeit mit der Lebensfähigkeit der Zellen Reagenz für L. optimiert mexicana. Inkubationszeiten mit der Lebensfähigkeit Reagenz für Platten ausgesät bei verschiedenen Zellkonzentrationen oder mit verschiedenen Zelllinien variieren (beispielsweise kann dieses Verfahren auch verwendet werden,mit Säugerzellen). Abhängig von der genauen Plattenleser verwendet wird, müssen Überlegungen angestellt werden, bevor Fluoreszenzmessungen getroffen werden. Eventuell vorhandene Luftblasen in den Vertiefungen sollten genaue Messwerte entfernt werden, um sicherzustellen, ergriffen werden können. Einige Plattenleser gelesen von der Unterseite der Platten, wobei in diesem Fall flach 96-Well-Platten Boden verwendet werden. Andere Maschinen können von der Oberseite der Platte zu lesen, so dass der Deckel der Platte sollte vor der Messung entfernt werden.

Schließlich wird in der Zukunft, so kann dieses Protokoll mit automatisierten Synthesizern kompatibel sein, die zur Herstellung vieler Sequenzen in der Lage sind, parallel. Zusätzlich ist die Synthese von cyclischen Peptoide diese Methode auch möglich verwenden. Dieses Protokoll sollte Forscher mit einer praktischen Syntheseverfahren bereitzustellen, das verwendet werden kann, mit neuen Peptoid Gerüste zuzugreifen sowohl Lysin- und Arginin-Monomeren, die in vielen Anwendungen nützlich sein können, einschließlich Materialien oder medizinischen Bereichen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polypropylen-Festphasen-Extraktionspatronen mit zwei Fritten	Crawford Scientific	12131017 und 12131015	20 ml und 6 ml Kartuschen, die für diese Zubereitung verwendet werden
Trifluoressigsäure	, Tokyo Chemical Industry (Europe)	T0431-100g	>98%; ACHTUNG: kann schwere Verbrennungen und Reizungen der Atemwege verursachen
N,N'-Diisopropylcarbodiimid	Sigma Aldrich	38370-100ML	98%; ACHTUNG: gefährlich für Augen, Haut und durch Einatmen über die Atemwege, kann auch zu einer Sensibilisierung führen
Dimethylformamid	Fischer Scientific	10346180	HPLC-Qualität; VORSICHT: Verdacht auf teratogenes
Acetonitril	Fischer Scientific	10407440
Dichlormethan	Fischer Scientific	in	10354263 99,8%; ACHTUNG: Verdacht auf Karzinogen
Bromacetinsäure	Sigma Aldrich	17000-100G	>99%; ACHTUNG: verursacht Verbrennungen und ist gefährlich für Haut, Augen und Atemwege
(S)-(-)-alpha-Methylbenzylamin	Sigma Aldrich	115568-100G	98%; ACHTUNG: gesundheitsschädlich beim Verschlucken, giftig bei Berührung mit der Haut, verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden, wird zur Synthese des Nspe-Monomers
verwendetN-Boc 1,4-diaminobutan	Tokyo Chemical Industry (Europe)	A1373-25g	>98%; ACHTUNG: verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden, wird zur Synthese des NLys-Monomers
verwendetN-Boc 1,2-diaminoethan	Tokyo Chemical Industry (Europe)	A1371-25g	>97%; ACHTUNG: verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden, die zur Synthese des Nae-Monomers
1,2-Diaminobutan	Sigma Aldrich	D13208-100G	99% verwendet werden; ACHTUNG: entzündbare Flüssigkeit und Dämpfe, gesundheitsschädlich beim Verschlucken oder Einatmen, giftig bei Berührung mit der Haut, verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden, wird bei der Synthese des NhArg-Monomers
1,4-Diaminoethan	Sigma Aldrich	03550-250ML	99,5%; ACHTUNG: entzündliche Flüssigkeiten und Dämpfe, gesundheitsschädlich beim Verschlucken oder Einatmen, giftig bei Berührung mit der Haut, verursachen schwere Hautverbrennungen und Augenschäden, werden bei der Synthese des NnArg-Monomers verwendet
1H-Pyrazol-1-carboxamidin HCl	Sigma Aldrich	402516-10G	als HCl-Salz; ACHTUNG: gesundheitsschädlich beim Verschlucken und kann allergische Hautreaktionen hervorrufen, verursacht schwere Augenschäden
Hydrazin-Monohydrat	Sigma Aldrich	207942-5G	Reagenzqualität; ACHTUNG: Verdacht auf Karzinogen, bei Einatmen tödlich und verursacht schwere Verbrennungen an Haut und Augen
2-Acetyldimedon	Novabiochem	8510150005	Dde-OH
Rink Amidharz	Novabiochem	8551190005	100-200 mesh, hohe Belastung
Piperidin	Sigma Aldrich	411027-1L	>99,5 %, eine kontrollierte Substanz, daher muss vor dem Kauf eine entsprechende Genehmigung eingeholt werden; ACHTUNG: Flüssigkeit und Dampf leicht entzündlich, gesundheitsschädlich bei Verschlucken und giftig bei Berührung mit der Haut oder beim Einatmen, verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden, schädlich für Wasserorganismen mit langfristiger Wirkung
Triisopropylsilan	Sigma Aldrich	233781-50G	98%; ACHTUNG: entzündbare Flüssigkeit und Dämpfe, verursachen Hautreizungen und schwere Augenreizungen
alamarBlue	ThermoFischer	DAL1025	Nicht als gefährlich eingestuft
Schneider's Insektenmedium	Sigma Aldrich	S9895-1L	Pulverförmig, das Medium muss vor der Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt werden; vor der Verwendung in biologischen Assays auf Raumtemperatur erwärmen lassen
96-Well-Platten	VWR	734-1793	Flacher Boden (um eine Fluoreszenzmessung von unten zu ermöglichen), mit Gewebekulturen behandelt
Lösungsmittel-Reservoire	VWR	613-1182	Zur Verwendung mit Mehrkanalpipette
Mehrkanalpipette	Eppendorf	3122000043
Pipettenspitzen	Starlab Group	S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810	Volumen der Spitze abhängig von der verwendeten Pipette. 10  &Mikro; l, 10 - 200  &Mikro; l und 1.000  &Mikro; l empfohlen für Assays
25 cm3 Zellkulturflaschen	VWR	734-2312
50 ml Zentrifugenröhrchen	VWR	525-0791
Dimethylsulfoxid (molekularbiologische Qualität)	Sigma Aldrich	D8418-50ML	Nicht als gefährlich eingestuft
Hitze inaktiviertes fötales Rinderserum	ThermoFischer	10082139-100mL	Gibco
Penicillin/Streptomycin	ThermoFischer	15140148-20mL	Abkürzung: P/
S Amphotericin B	Sigma Aldrich	46006-100mg	Amphotericin B Trihydrat, VetranalTM Analysestandard