Methodenartikel

hyperpolarisiertem 13 C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

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DOI:

10.3791/54751

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30. Dezember 2016

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1Department of Nuclear Medicine, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Chemistry, Technische Universität München, 3GE Global Research, 4Zentralinstitut für Medizintechnik der Technischen Universität München (IMETUM), Technische Universität München, 5Institute for Biological and Medical Imaging (IBMI), Helmholtz Zentrum München, 6IDG Institute of Developmental Genetics, Helmholtz Zentrum München

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die dynamische Kernpolarisation mit anschließender Probenauflösung hat Echtzeitstudien des Stoffwechsels in biologischen Systemen ermöglicht. Hyperpolarisiertes [1-13C]pyruvat wurde verwendet, um die Laktatdehydrogenase-Aktivität in einer Prostatakarzinom-Zelllinie in vitro zu untersuchen.

Zusammenfassung

In den vergangenen Jahrzehnten wurden neue Methoden zur Tumor - Staging, Restaging, Ansprechen auf die Behandlung Überwachung, und ein erneutes Auftreten Nachweis einer Vielzahl von Krebserkrankungen haben in Verbindung mit dem state-of-the-art - Positronen - Emissions - Tomographie mit 18 F-fluorodeoxyglucose ([18 F entstanden ] -FDG PET). 13 C - Magnetresonanz - spektroskopischen Bildgebung (13 CMRSI) ist eine minimal invasive Bildgebungsverfahren, das die Überwachung des Stoffwechsels in vivo und in Echtzeit ermöglicht. Wie bei jedem anderen Verfahren , basierend auf 13 C kernmagnetische Resonanz (NMR), steht sie vor der Herausforderung mit niedriger thermischer Polarisation und einer anschließenden geringen Signal-zu-Rausch - Verhältnis aufgrund des relativ niedrigen gyromagnetische Verhältnis von 13 C und seiner geringen natürlichen Häufigkeit in biologischen Proben. Durch Überwindung hat diese Beschränkungen, dynamische Kernpolarisation (DNP) mit anschließender Probenauflösungs kürzlich häufig verwendeten NMR und Kernspintomographie (MRI) -Systeme zur Messung aktiviert, Studium und Bild Schlüssel Stoffwechselwege in verschiedenen biologischen Systemen. Ein besonders interessantes und vielversprechendes Molekül in 13 CMRSI verwendete [1- 13 C] Pyruvat, die in den letzten zehn Jahren wurde für in vitro, preclinical weithin verwendet worden, und in jüngster Zeit , klinische Studien der zellulären Energiestoffwechsels zu untersuchen bei Krebs und anderen Krankheiten. In diesem Artikel erläutern wir die Technik der Auflösung DNP unter Verwendung eines 3,35 T präklinische DNP Hyperpolarisierer und zeigen seine Verwendung in In - vitro - Studien. Ein ähnliches Protokoll für die Hyperpolarisation kann auch zum größten Teil in in - vivo - Untersuchungen angewendet werden. Dazu verwendeten wir Lactat - Dehydrogenase (LDH) und katalysiert die metabolische Reaktion von [1- 13 C] Pyruvat [1- 13 C] Lactat in einer Prostatakarzinomzelllinie PC3, in vitro unter Verwendung von 13 CMRSI.

Einleitung

Gegenwärtig ist die am weitesten verbreitete klinische Methode für Tumor - Staging, Restaging, Ansprechen auf die Behandlung Überwachung und Rezidiverkennung von einer Vielzahl von Krebserkrankungen [18 F] -FDG PET. 1 jedoch in jüngster Zeit mehrere neue und alternative Ansätze entstanden. Eine dieser Methoden ist 13 CMRSI. Diese Technik beinhaltet die Einführung des 13 C-Moleküls in einer biologischen Probe, durch minimal invasive MRI folgte dem Stoffwechsel in vitro oder in vivo in Echtzeit zu bewerten. Dennoch ist die größte Herausforderung von 13 CMRSI, im Vergleich zu den anderen Verfahren, wie [18 F] -FDG PET oder Computertomographie, ist seine niedrige Signal-zu-Rausch - Verhältnis.

Das NMR - Signal ist direkt proportional zu der Ebene der Polarisation, ein Verhältnis der Spin ½ Keimpopulation Differenz in zwei Energiezustände an der Gesamtbevölkerung (1A). Die Polarisation ist ein Produkt der the gyromagnetische Verhältnis (γ) der Kerne und das Magnetfeld angelegt Festigkeit über der Temperatur. Eine typische Polarisations von 1 H - Kerne ist in der Größenordnung von 0,001% bis 0,005% bei 3 T, das ein relativ schlechtes Signal-Rausch - Verhältnis ergibt. Heutigen state-of-the-art MRI hat nur eine erfolgreiche Bildgebungsverfahren gewesen aufgrund der hohen Fülle von 1 H in biologischen Proben und der hohen gyromagnetischen Verhältnis von 1 H (& gamma; 1H = 42,576 MHz / T). Jedoch beobachtet andere Kerne, wie beispielsweise Kohlenstoff, ist anspruchsvoller. Der einzige stabile, magnetisch aktiven Kohlenstoffisotops 13 C, macht nur 1,1% aller Kohlenstoffatome. Darüber hinaus ist die gyromagnetische Verhältnis von 13 C (γ 13C = 10,705 MHz / T) ist viermal geringer als die von 1 H, zu einer niedrigeren Nachweiseffizienz führt. Insgesamt verursachen die niedrigen 13 C Fülle und niedrige γ 13C Wärme 13 C - Messungen 0,0176% der Empfindlichkeit eines 1 zu erreichen ,H-NMR - Messung in vivo.

Dynamische Kernpolarisation

Eine Methode , um die relativ geringe Empfindlichkeit von 13 C - Messungen zu überwinden , ist DNP. Es wurde ursprünglich im Jahre 1953 von Albert W. Overhauser- für Metalle beschrieben. In seinem Artikel, er sagte: "Es wird gezeigt , dass , wenn die Elektronenspinresonanz der Leitungselektronen gesättigt ist, werden die Kerne in gleichem Maße polarisiert werden sie , wenn ihr gyromagnetische Verhältnis , dass waren der Elektronenspin sein würde." 2 Später in diesem Jahr, Carver und Slichter experimentell bestätigt Overhauser- Hypothese 3. Im Jahr 1958 beschrieben Abragam und Proctor diesen Effekt für Elektronen in Flüssigkeiten und nannte sie die "solid-Effekt." Bei Temperaturen unterhalb von 4 K, Elektronenspinpolarisation erreicht fast 100% und mehr als drei Grßenordnungen höher als die Kernspinpolarisation (1B) 4. Tseine tritt auf, weil das gyromagnetische Verhältnis des Elektrons (γ e = 28.024,944 MHz / T) um drei Größenordnungen höher ist als die Kern gyromagnetischen Verhältnisse. Die schwachen Wechselwirkungen zwischen Elektronen und Kernen, wie beispielsweise die Overhauser-Effekt, der festen Wirkung, den Quereffekt und der thermischen Mischwirkung ermöglichen die Übertragung der Polarisation von Elektronen an Kernspins dreht unter Verwendung von Mikrowellenbestrahlung mit einer Frequenz nahe der entsprechenden Elektronen Spinresonanz (EPR) Frequenz 5,6. DNP Theorie wurde weiterentwickelt mehr Elektronen und thermische Vermischung einzubeziehen. Trotzdem bisher wurde 7,8 veröffentlicht keine einheitliche quantitative theoretische Beschreibung von DNP.

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Abbildung 1: Dynamische Kernpolarisation und Hyperpolarisation zu verstehen. A) Ein schematischer Vergleich der Spinpopulationim thermischen Gleichgewicht Polarisationszustand und dem hyperpolarisierten Zustand. B) Die Polarisation ist abhängig von der Temperatur. Die Polarisation eines Elektrons (e -) erreicht 100% unter 1,4 K. Die DNP ermöglicht den Transfer der Polarisation von dem e- an die 13 C - Kerne, die bis zu 10 5 -fache ihrer Polarisation erhöht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

DNP in Studien von biologischen Systemen Auflösung entwickelt hatte , werden unter Verwendung von 13 C - NMR, anschließende schnelle Probe einzuführen. 50 Jahre nach Overhauser- Hypothese, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. löste das technisch anspruchsvolle Ausgabe 6 das hyperpolarisierte gefrorene Probe in den flüssigen Zustand mit einem minimalen Verlust von Hyperpolarisation zu bringen. Die Auflösung DNP eröffnet ein neues Forschungsgebiet 13 CMRS genanntI, die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zu untersuchen und zu verschiedenen Krankheitszuständen 9,10 charakterisieren. Als stabile Träger eines ungepaarten Elektrons, ein Tritylrest Tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) methyl-Natriumsalz (OX063) oder (2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-yl) oxyl (TEMPO) wird üblicherweise verwendet. Diese werden mit der gewünschten 13 C-markiertes Molekül vermischt und ausgesetzt einer Mikrowellenbestrahlung mit einer Frequenz nahe der entsprechenden EPR - Frequenz. Unter Verwendung dieser Technik kann die Polarisation von 13 C - Kerne erhöht werden bis zu 37% 11. Dies führt zu einem 10 5 -fachen Polarisations Verbesserung gegenüber dem thermischen Gleichgewicht Polarisations 11,12. Jedoch, sobald die Mikrowellenbestrahlung gestoppt wird und / oder dem 13 C-Molekül in den flüssigen Zustand überführt wird, fällt die Polarisations mit der longitudinalen Relaxationszeit (T 1) des 13 C - Kern , die polarisiert wurde. Und so kam es dass derErfindung der schnellen Auflösung Techniken oder jede nachfolgende Technik die Zeit vor dem experimentellen Messung Verkürzung (dh Injektion) für biologische Anwendungen 13 von entscheidender Bedeutung ist.

Es gibt drei wichtige Anforderungen , die das Kandidatenmolekül für eine erfolgreiche 13 CMRSI Studien erfüllen muss. Erstens hat der 13 C - Kern von Interesse eine ausreichend lange T 1 haben (> 10 s). Die Wahl der 13 C-Markierung ist von entscheidender Bedeutung. Die besten Kandidaten Kerne sind Kohlenstoffe ohne direkten Kontakt mit 1 H-Kerne über eine Bindung. Es muss auch schnell innerhalb von 2 metabolisiert werden - 3 T 1 Mal in einem nachgeschalteten Stoffwechselprodukt entstehende mit deutlich unterschiedlichen chemischen Verschiebung von der ursprünglichen Substanz. Das Gemisch Probe muss auch ein amorphes Glas , wenn es in einem festen Zustand bilden , so daß die räumliche Verteilung des Abstandes zwischen dem Elektron und 13 C abnimmt, so dass die transfer der Polarisation. Wenn das Kandidatenmolekül natürlicherweise nicht amorphes Glas bilden, muss sie sehr gut löslich in einem Verglasungsmittel sein, wie Glycerin oder Dimethylsulfoxid 14. Diese Anforderungen führen zu einer relativ geringen Anzahl von Kandidatenmolekülen. Aber auch nach dem erfolgreichen Entdeckung eines geeigneten Moleküls kann ein Arbeitsprotokoll für Hyperpolarisation der Entwicklung technisch anspruchs 9,14,15.

Erfolgreich polarisiert, wie [1- 13 C] Pyruvat 12,16 In den letzten Jahren wurden mehrere Substrate gewesen - 36 [2- 13 C] Pyruvat - 37, [1- 13 C] Ethylpyruvat 38, [1- 13 C ] Lactat 39, [1- 13 C] Fumarat 40-43, 13 C-Bicarbonat 36,44,45, [1- 13 C] Natriumacetat 43,46 - 49, 13 C-Harnstoff - 6,36,50,51 [5- 13 C] glutamine 15,52,53, [1- 13 C] Glutamat 53,54, [1- 13 C] 2-Oxoglutarat 55, [1- 13 C] Alanin und andere 14,56. Eine besonders interessante und häufig verwendete Substrat für die Hyperpolarisation ist [1- 13 C] Pyruvat. Es ist weit verbreitet in der präklinischen Studien 14,17,22 der zellulären Energiestoffwechsel bei verschiedenen Erkrankungen zu untersuchen. [1- 13 C] Pyruvat erfüllt alle Anforderungen für eine erfolgreiche Hyperpolarisation, einschließlich einer relativ langen T 1 und schnellen Transport über die Zellmembran , bevor anschließend metabolisiert wird. Präklinische Studien mit [1- 13 C] Pyruvat sind zur Zeit in der Klinik 57 übersetzt.

Metabolismus von Pyruvat

Es ist bekannt, dass es eine direkte Verbindung zwischen Mutationen in einem Krebszellen DNA und Veränderungen in ihrer Stoffwechselwege ist. Bereits in den 1920er Jahren, Otto Warburg DiscovEred , dass es in Tumoren im Vergleich zu gesundem Gewebe 58 einen erhöhten Stoffwechsel von Glukose und Produktion von Laktat - 60. Anschließend verschiedene Änderungen in anderen Stoffwechselwegen, wie dem Pentose-Phosphat-Weg, den Tricarbonsäurezyklus, oxidative Phosphorylierung und die Synthese von Nukleotiden und Lipiden, sind beschrieben worden.

Pyruvat ist das Endprodukt der Glykolyse. Im Tumor, erfährt er anaerobe Glycolyse von LDH katalysierte 61 und reagiert mit der reduzierten Form des Nicotinamid - adenin - dinucleotid - Coenzym (NADH), was zu Laktat und der oxidierten Form des Coenzyms (NAD +). Alternativ erfährt Pyruvat eine Transaminierung mit Glutamat Alanin zu bilden, durch die Alanin-Transaminase katalysierte (ALT). Beide Reaktionen sind leicht reversibel. Pyruvat erfährt auch Decarboxylierung von Pyruvat-Dehydrogenase katalysiert (PDH) zu Kohlendioxid und Acetyl-CoA, reine irreversible Reaktion in diesem Schritt epresenting. Abwechslungen in diesen Reaktionsraten können auf Tumormetabolismus 17,21,22,25,62 verknüpft werden. Die Stoffwechselwege sind in Figur 2 zusammengefasst.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung der wichtigsten Stoffwechselreaktion von Pyruvat. Pyruvat / Laktat-Umwandlung wird durch LDH katalysiert, und Pyruvat / Alanin Umwandlung wird durch ALT katalysiert. Pyruvat wird irreversibel an Acetyl-CoA und CO 2 durch PDH umgewandelt und CO 2 in einem pH-abhängigen Gleichgewicht mit Bicarbonat 80. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Der Nachweis von hyperpolarisiertem [1- 13 C] Pyruvats und seiner Metaboliten wurde in der Ratte zuvor gezeigt erKunst 37,63 - 65, Leber 66, Muskel und Niere 62,67. Eine Studie zeigte signifikante Unterschiede in der Lactat-zu-Alanin - Verhältnis zwischen der normalen und fasteten Rattenleber 66 und zeigten eine stark erhöhte und hyperpolarisiertem [1- 13 C] Laktatspiegel in Leberkrebs 68,69. Es gibt Anzeichen dafür , dass die Tumorgrad kann in einem transgenen Maus - Adenokarzinom der Prostata (TRAMP) unter Verwendung von hyperpolarisiertem [1- 13 C] Pyruvat - 22, mit dem hyperpolarisierten Laktatspiegel zeigt , die eine hohe Korrelation mit dem histologischen Grad der herausgeschnittenen Tumoren identifiziert werden. Das Alanin aus Pyruvat durch ALT katalysiert wurde auch als ein nützlicher Marker in rat hepatozellulären Karzinoms 23 vorgeschlagen.

Messung der Pyruvat-Lactat metabolischen Flusses wurde zur Überwachung Ischämie 63,65,70 und als Reaktion auf die Behandlung mit einer zytotoxischen Chemotherapie 17,40, zielgerichtete Medikamente verwendet 24,25,41 oder Strahlentherapie 26 in Tiermodellen. Es wurde auch für den Nachweis der Phosphatidylinositol - 3-Kinase (PI3K) -Inhibitor LY294002 Reaktion in Glioblastom und Brustkrebs Mausmodellen 25 verwendet. Veränderungen im Pyruvatstoffwechsels bei Hirntumoren 26 und Prostatakrebs 24,71 haben auch nach der Behandlung beobachtet.

Prostatakarzinom

Das Prostatakarzinom ist die vorherrschende Krebs bei älteren Männern und der zweite bei Männern weltweit 72 zum Tode im Zusammenhang mit führenden Krebs. Bisher wurden keine zuverlässigen, nicht-invasive Methoden zur Verfügung , für eine frühe Diagnose und Charakterisierung von Prostata - Krebs 73,74, die dringende Notwendigkeit für neuartige metabolische Bildgebung Techniken betont strenge Erkennung und Durchführung von Patienten zu ermöglichen. Das Prostatakarzinom wurde als Modell verwendet , mit 13 CMRSI in Patienten kombiniert die Möglichkeiten der Auflösung DNP zu demonstrierens 57. Diese Arbeit wurde in einer ersten klinischen Studie unter Verwendung fortgesetzt [1- 13 C] Pyruvat und 13 CMRSI für die Abbildung von Prostatakrebs, und es hat gerade abgeschlossen kürzlich (NCT01229618).

Die Motivation hinter dieser Arbeit war die Anwendung der 13 CMRSI Methode in einer präklinischen Einstellung mit Zellen im Detail und für ein breiteres Publikum zu illustrieren. Messung der LDH-katalysierten Metabolismus von [1- 13 C] Pyruvat [1- 13 C] Lactat in vitro in der PC3 Prostata - Karzinom - Zelllinie, zeigen wir die mögliche Anwendung der Auflösungs DNP in in vitro - Studien und adressieren die entscheidenden Schritte und Herausforderungen während der Experimente.

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Protokoll

1. Probenstammlösung Vorbereitung

  1. Hinzufügen gadoterate Meglumin (GADM, 0,5 mol / L) zu konzentrierter [1- 13 C] Brenztraubensäure mit einer Endkonzentration von 1 mmol / L GADM zu geben. Hinzufügen Tritylrest Tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) -benzo- [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) - methyl Natriumsalz (OX063) zu dieser Mischung zu einer Endkonzentration von 15 mmol / L zu ergeben. Vortex bis zur vollständigen Auflösung.
    HINWEIS: Diese Stammlösung Vorbereitung ist für den Gebrauch entwickelt, um mit einem 3,35-T präklinischen DNP Hyperpolarisierer. Wenn ein 7-T klinischen Hyperpolarisator verwendet wird, wird die gadoterate Meglumin nicht erforderlich, da bei einem höheren Magnetfeld seine Vorteile vernachlässigbar sind. Die Zugabe eines Gadolinium-basierte Kontrastmittel erhöht die erreichbare Festkörper Polarisation und auch die Polarisationsrate. Jedoch im flüssigen Zustand verkürzt das Kontrastmittel die T 1 -Relaxationszeit.

2. Wachsende die Zellkultur

  1. 2 Wachstumsbereich. Verwenden F-12K - Medium mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und halten die Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre bei 5% CO 2. Vor dem Auflösungsschritt, entfernen Sie das Medium aus dem Kulturflasche.
    HINWEIS: Jede Zelllinie erfordert eine besondere Vorschrift für die Zellvermehrung. Konsultieren Sie die Anforderungen mit der Zelllinie Anbieter.

3. Vorbereitung der Zellen für das Experiment

  1. Entfernen Sie die Zellmedium und Waschen der Zellen mit ~ 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
  2. 5 ml Trypsin in den Kolben und das Rück die Zellkulturflaschen in den Inkubator für 3 bis 5 min.
  3. In ~ 5 ml F-12K-Medium um das Trypsin zu deaktivieren.
  4. Zählen Sie die Zellen, die eine automatische Zellzähler verwendet wird. Mischen 10 ul der Zelllösung mit 10 & mgr; l der Färbelösung. Gut mischen mit der Pipette und Transfer 10 ul des Gemisches in the Kammer eines "Zählen Glas".
  5. Entfernen und die Zellen in den Kolben zählen (s). Übertragen die entsprechenden Mengen der gewünschten Anzahl an Zellen enthalten , (beispielsweise 5 x 10 6 bis 10 8) in Kunststoffröhrchen.
  6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1.200 × g für 5 min und den Überstand verwerfen.
  7. Wieder die Zellen in der F-12K-Medium mit 10% FCS auf ein Gesamtvolumen von 800 & mgr; l und übertragen diese in einen Reaktionsbecher (2 ml). Setzen Sie den Reaktionsbecher in eine Plastikflasche mit warmem Wasser gefüllt.

4. Die Auflösung Mittelzubereitung

HINWEIS: Die Auflösungsmittel ist eine Flüssigkeit, die verwendet wird, um die hyperpolarisierte Probe aufzulösen. In biologischen Anwendungen wird die Auflösung in der Regel mit H 2 O-basierten oder Deuteriumoxid (D 2 O) -basierte Puffer, wie PBS oder Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris), enthaltend 1 g / l Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) durchgeführt.

  1. preparation von 20 mmol / l PBS-Puffer
    1. Zur Herstellung von 100 ml des Lösungsmittels löst man 36 mg Mononatriumphosphat (NaH 2 PO 4), 247 mg Dinatriumphosphat (Na 2 HPO 4) und 10 mg EDTA in einer Lösung von 20 mmol / L Natriumhydroxid ( NaOH) in D 2 O Mix richtig bis zur vollständigen Auflösung.
      HINWEIS: EDTA (1 g / l) wird zu dem Puffer möglich ferromagnetischen Ionen zu eliminieren, die den hyperpolarisations verderben können. Das NaOH wird die Brenztraubensäure in einem 1-zu neutralisieren: 1 Mol-Verhältnis mit einem pH von 7,4 zu erreichen.

5. Variable Temperatur Insert (VTI) Aufladezeit

  1. In der DNP-NMR-Polarisator Programm-Hauptfenster klicken Sie auf "Abklingzeit wurde."
    HINWEIS: Diese schaltet die Vakuumpumpe und evakuiert die VTI auf ca. 5,0 mbar. Anschließend öffnet sich das Nadelventil zwischen dem VTI und dem Flüssigheliumbehälter voll, so dass flüssiges Helium in den VTI zu fließen. Die Fließgeschwindigkeit beträgt regulated durch das Nadelventil die optimale Menge an flüssigem Helium in der VTI zu halten, bis sie die Temperatur siedenden Helium erreicht. Dann wird der VTI zu einer fast vollständigen Vakuum evakuiert und die Temperatur erreicht etwa 1,4 K. Der VTI mit flüssigem Helium bis zu 65% gefüllt ist. An diesem Punkt ist das Instrument für die Proben Einsetzen bereit.

6. Probenvorbereitung und Insertion

  1. Mit Hilfe einer Mikropipette, fügen ~ 8 & mgr; l von 13 C-markierten Probe Stammlösung in einem Plastikbecher.
  2. Bringen Sie die Plastikbecher an den Einführungsstab und starten Sie die Probeneinführungsprozess durch "Insert Probe" im Hauptprogrammfenster drücken. Wählen Sie "Normal Probe" und klicken Sie auf "Weiter".
    HINWEIS: Bei diesem Verfahren wird zunächst das Nadelventil schließt den Fluss von flüssigem Helium in VTI einzustellen, und der Druck in der VTI steigt dann. Der Probenhalter innerhalb des VTI von der flüssigen Heliums erhöht, das Einlassventilan der Spitze des VTI öffnet, und ein gasförmiges Helium Strom von dem Einlaßventil eingeführt außerhalb Kontamination durch Luft Feuchtigkeit zu verhindern.
  3. Wenn Sie gefragt werden, drücken Sie den Einführungsstab mit dem daran befestigten Plastikbecher nach unten in den VTI. Achten Sie darauf, den Probenhalter am unteren Rand des VTI zu erreichen. Andernfalls kann das gasförmige Helium die Probe drücken aus dem VTI.
  4. Lösen und den Einführungsstab entfernen.
  5. Beenden Sie den Vorgang mit "Weiter" im Dialogfenster klicken. Die Probe Insertionsvorgangs sollte nicht länger als 10 s.
    HINWEIS: Das Einlaßventil schließt sich dann das gasförmige Helium Strom unterbrochen wird, wird der Probenhalter mit den Probenbecher in flüssiges Helium eingetaucht, und das Nadelventil geöffnet wird, das flüssige Helium zu ermöglichen, in die VTI zu fließen. Nach 5 - 10 min wird die VTI unter 1,4 K, abgekühlt alle freien Elektronen ermöglicht polarisiert werden.
  6. Bestätigen Sie, dass die Plastikbecher mit der Probe durch Prüfen t richtig in die VTI eingeführt wurdeHut wird es nicht zu der Einführungsstange angebracht oder von der VTI durch Heliumgas verdrängt. Klicken Sie dann auf "Fertig stellen."

7. Mikrowelle Sweep (optional)

HINWEIS: Ein Mikrowellen Sweep ermöglicht die Bestimmung der optimalen Mikrowellenfrequenz des hyperpolarisations Rate der 13 C - Kerne in der Zielverbindung zu maximieren.

  1. Um die Mikrowelle Sweep messen, starten Sie das Programm RINMR, Typ "HYPERSENSENMR", und klicken Sie auf "Wählen Sie Config" und "Do Microsweep."
  2. Um den Prozess, wählen Sie die "kalibrieren" auf die Registerkarte Hauptfenster des Programms starten.
  3. Klicken Sie auf "Generieren" und wählen Sie den Anfang und das Ende Frequenz (zB 94,100 GHz-94,200 GHz), die Frequenzschrittgröße (zB 20 MHz), die Leistung (100 mW) und die Zeit (60 s). Klicken Sie auf "Weiter", "Enable" und "Start".
    HINWEIS: Mit diesen Einstellungen die Hyperpolarisierer erste polarisiert die Probefür 60 s einer Mikrowellenfrequenz von 94,100 GHz und einer Leistung von 100 mW verwendet wird. Dann gilt es eine 90 ° Hochfrequenz (HF) -Impuls und erfasst das hyperpolarisierte 13 C - Signal des Einbau-Spektrometers. Diese Schritte werden für jeden Schritt wiederholt in bestimmten Frequenzbereich. Für nachfolgende Hyperpolarisation, wählen Sie die Mikrowellenfrequenz mit der maximalen Signalamplitude gemessen.

8. Polarization

  1. Um den Aufbau der Polarisation zu messen, starten Sie das Programm RINMR, Typ "HYPERSENSENMR", und klicken Sie auf "Wählen Sie Config" und "Solid Aufbau."
  2. In der DNP-NMR-Polarisator Programmhauptfenster auf "Polarization", um den Prozess in Gang Hyperpolarisation.
  3. Wählen Sie die optimale Mikrowellenfrequenz (während der Mikrowellen Sweep erhalten) und die Leistung (zB 100 mW) für die Probe und klicken Sie auf "Weiter" .
  4. Enable "den Aufbau der Polarisation Überwachung" und klicken Sie auf "Fertig stellen."
  5. Polarisieren der Probe auf> 95% (~ 60 min für [1- 13 C] Pyruvat).
    HINWEIS: Bei der Polarisation, Mikrowellen werden in die VTI geführt und auf die Probe, so dass die 13 C - Spins mit dem hyperpolarisierten ungepaarten Elektronenspins auszurichten. Um die Hyperpolarisation Anhaftungen, RF - Impulse mit einem Flipwinkel (FA) von 5 ° messen angewendet periodisch (beispielsweise alle 300 s) und das resultierende Signal wird als Polarisationsaufbaukurve aufgetragen.

9. Auflösung

  1. Wenn die Polarisation erreicht> 95%, initiieren den Auflösungsprozess durch "Auflösung" in der DNP-NMR-Polarisator Programmhauptfenster klicken.
  2. Wählen Sie den Auflösungsprozess aus dem Drop-Down-Menü und klicken Sie auf "Weiter".
    HINWEIS: Der Polarisator ermöglicht es, die gewünschte Auflösungsprozess zu definieren, indem die Zeitsteuerung des Verfolgergas wählen.
  3. Last ~ 5 ml des Lösungsmittels durch das obere Ventil in einen beheizten Behälter in ter Auflösung Teil des Polarisierers. Berechnen Sie die exakte Volumen des Lösungsmittels benötigt folgende Gleichung verwendet wird:
    figure-protocol-1
    wobei V DA das gewünschte Volumen des Lösungsmittels, m PA, m OX063 und m Gad sind die Massen des Pyruvat, OX063 und gadoterate Meglumin ist jeweils zu der Probenstammlösung.
  4. Legen Sie die Auflösung Stick in der aktiven Position über dem Einlassventil.
    HINWEIS: Dies ermöglicht das Gerät seine Auflösung Instrumentierung zu den Probenbecher in der VTI zu verbinden.
  5. Klicken Sie auf "Fertig stellen", um den Auflösungsprozess zu starten.
    HINWEIS: Die Auflösungsmittel zu 3 bar mit Heliumgas unter Druck gesetzt wird und anschließend auf 200 ° C erhitzt, eine Druckerhöhung verursacht wird. Wenn der Druck 10 bar erreicht, schließt sich das Nadelventil den Fluss von flüssigem Helium in die VTI einzustellen. Der Probenhalter wirft die Schaleaus dem flüssigen Helium. Die Auflösung Stick wird in den VTI abgesenkt und auf der Probenschale verbunden. Das konditionierte Lösungsmittel wird durch den Druck gedrückt wird, die sich von dem Heizbehälter führt die Auflösungspuffer und Heliumgas, durch die Auflösung Stock auf den Becher enthält, eine schnelle Auflösung der Probe verursacht. Die Lösung fließt dann in die Sammelkolben über Kunststoffschlauch. Die Auflösung Stick mit dem daran befestigten Becher wird dann von der VTI angehoben.
  6. Bewegen Sie die Auflösung Stick mit dem daran befestigten Becher auf die "Reinigung" Position und den Prozess beenden, indem Sie auf "Fertig stellen."

10. Nachweis des 13 C Hyperpolarisierte Signal

  1. 13 C metabolischen Magnetresonanzspektroskopie in vitro
    1. Mischungs 200 ul der 20 mmol / l gelöst hyperpolarisierten Probe aus dem Sammelkolben mit 800 ul der Zelllösung.
      HINWEIS: Die resultierende Endkonzentrationvon [1- 13 C] Pyruvat 4 mmol / L.
    2. Mischen Sie die Suspension auch mit einer Mikropipette und Transfer ~ 600 & mgr; l in einem 5-mm-NMR-Röhrchen.
    3. Legen Sie die 5-mm-NMR-Röhrchen in das 1-T-NMR-Spektrometer. Im Hauptfenster der Software, klicken Sie auf "Ausführen", um die Messung zu starten, alle 3 s Reihe von hundert 10 ° HF-Impulse anwenden.
      HINWEIS: Messen der Zeit zwischen dem anfänglichen Mischen der hyperpolarisierten Probe mit den Zellen und dem Beginn der spektroskopischen Akquisition. Sicherzustellen, dass der Mischvorgang nicht mehr als 30 s nicht überschreitet Polarisationsverlust zu minimieren.
  2. 13 C metabolischen Magnetresonanztomographie
    1. Um einen Behälter für die in - vitro - Experimenten unter Verwendung des MRI - Spektrometer bauen, nehmen Sie eine 5-ml - Spritze und verbinden Sie es mit einem Katheter (d = 1,2 mm) , die lang genug ist , aus dem Spektrometer des Iso-Zentrum zum ansprechbar Bereich des zu erreichen Spektrometer.
    2. Füllen Sie den In - vitro - Behälter mit the Zell - Lösung der gewünschten Konzentration für das Experiment (beispielsweise 10 8) oder mit einer enzymatischen Lösung.
    3. Legen Sie eine in vitro Behälter im Isozentrum des MRI - Magneten. Legen Sie eine 13 C-abgestimmten Hochfrequenzempfängerspule auf dem Behälter. Legen Sie eine konzentrierte 13 C-markierten Kalibrierphantom (zB 10-mol / L 13 C-Harnstoff) in der Nähe.
    4. Legen Sie die "In - vitro - Container" in der Nähe des Iso-Zentrum des NMR - Scanner.
    5. Führen Sie die Standard - 3-Ebene Lokalisierungssequenz des Scanners und stellen Sie die in - vitro - Behälter die Position der Iso-Zentrum, je nach Bedarf.
    6. Führen Sie einen 1 H T2-gewichteten "anatomischen" Sequenz für den in - vitro - Behälter Lokalisierung. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 2D - Spin - Echo mit axialer Ausrichtung, Wiederholungszeit (TR) = 2.000 ms, Echozeit (TE) = 20 ms, Schichtdicke = 1 mm, Sichtfeld für den in - vitro - Behälter, und16 Echos pro Anregung. Stellen Sie sicher, dass Feld Shim auf Protonen bei diesem Schritt durchgeführt wird.
    7. In den anatomischen Bilder, wählen Sie 5 angrenzend an die Region von Interesse zentriert Scheiben. Verschreiben eines 13 C - spektroskopische Kalibrierung Erwerb Abdeckung der ausgewählten anatomischen Scheiben schneiden. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 2D-Block-Siegert Kalibriersequenz mit axialer Ausrichtung 12 x 12 centric codiert, TR = 1000 ms, Schichtdicke = 5 mm, Sichtfeld passende anatomische Bilder, die Anzahl der Scans (NS) = 64, Bandbreite = 5000 Hz und FA = 90 °.
    8. Wählen Sie die 13 C - spektroskopischen Kalibrierungssequenz (für weitere Informationen siehe Schulte et al. 2011) 75 von der Pulssequenzbibliothek. Laden Sie die Pulsfolge an den Scanner vom Computer, indem Sie auf "Download". Klicken Sie auf "Spectra Prescan", um die spektroskopischen Prescan laufen. Im Spektrum Größe Grundstück, stellen Sie die Spitze aus dem 13 C Kalibrierphantom zum center der Scannerfrequenz. Stellen Sie die Empfänger Gewinne auf das Maximum. Klicken Sie auf "Start" , um die 13 C - spektroskopische Kalibrierung nacheinander ausgeführt. Notieren Sie sich die gemeldete Sendeverstärkung und zentrierte Frequenz.
    9. Legen Sie eine 13 C chemical shift imaging (CSI) Erwerb Abdeckung der ausgewählten anatomischen Scheiben schneiden. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 2D-Echo-Planar-spektroskopischen Bildgebung (EPSI) mit axialer Ausrichtung 12 x 12 centric codiert, TR = 400 ms, Schichtdicke = 5 mm, Sichtfeld passende anatomische Bilder, NS = 300 und Bandbreite = 5.000 Hz .
      HINWEIS: EPSI Proben eine einzelne Zeile im k-Raum wiederholt nach einer HF-Anregung sowohl räumlichen und spektralen Informationen gleichzeitig zu erfassen. Weitere Informationen über die Aufnahmetechniken, siehe den Artikel von Durst et al. 2015 76.
    10. Laden Sie die 13 C - CSI - Sequenz und führen Sie den spektroskopischen Prescan. Stellen Sie den Scanner Frequenz und übertragen die Verstärkung, wie durch die Kalibrierungssequenz angegebenAusgabe.
    11. Nachdem die hyperpolarisierte Lösung in dem Sammelkolben aufgebracht wird, entwerfen ~ 3 ml in eine Spritze und es dann in den Katheter an den in - vitro - Behälter verbunden injizieren. Starten Sie die Aufnahme. Nach der Akquisition abgeschlossen ist, speichern Sie die Rohdatendatei für eine spätere Rekonstruktion.

11. Datenrekonstruktion

  1. Wenden Sie eine der beiden beschriebenen kinetischen Modellen der erfassten Daten zu analysieren.
    1. In dem ersten Verfahren zur Beschreibung der LDH Kinetik kinetische Wert (k), vergleicht die Summe aus dem Lactat - Signal (M LAC) auf das Signal aller hyperpolarisiertem Moleküle (M x) 21,77.
      figure-protocol-2
    2. In dem anderen Verfahren messen die Lactat und Pyruvat - Signale im Laufe der Zeit und passen diese an einem kinetischen Modell 17,25,71. Um die metabolische Wechselkurs zu lösen, k PA → LAC und die effektiveSignalzerfallsrate von Lactat, r LAC, verwenden Sie die folgende lineare Differentialgleichungen der Zwei Ort - Austausch - Differenzmodell, wodurch man für Laktat:

      figure-protocol-3

Hinweis: Die effektive Laktat Signal Zerfallsrate r LAC ist abhängig von der Laktat longitudinale Relaxationszeit (T 1, LAC), die gegenüber metabolischen Wechselkurs von Lactat zu Pyruvat k LAC → PA, der angelegten FA und TR und die Signalintensität Pyruvat (M PA) und Laktat (M LAC), unter Berücksichtigung der irreversiblen Signalreduktion nach jedem aufeinanderfolgenden Anregung:

figure-protocol-4

Daher ergibt r LAC in einem einzigen, untrennbaren Begriff der Signalabfall. Da es möglich ist für t zu korrigieren,er Flip - Winkel und die Wiederholungszeit, und obwohl es ein Fluß LAC → PA ist, gehen wir davon aus, dass der Wechselkurs von Lactat zu Pyruvat (k LAC → PA) muss nicht in die Berechnung einbezogen werden, basierend auf den Ergebnissen der Harrison et al. 2012 78. Ihre Ergebnisse zeigen , dass die k LAC → PA nicht so entscheidend , eine Rolle spielt , wie man annehmen würde. In diesem Modus können die T 1 -Relaxationszeit von Lactat zu quantifizieren. Dieses Modell ist unabhängig von Pyruvat Verabreichung an die Messung, die im Falle von in vitro - Experimenten, ist nicht entscheidend und kann vernachlässigt werden. Sie räumt jedoch ein , spielen eine wichtige Rolle für die in - vivo - Messungen 79.

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Ergebnisse

Die Ergebnisse der "Mikrowellen - sweep" sind in Abbildung 3 dargestellt. Es zeigt , dass die optimale Mikrowellenfrequenz für die [1- 13 C] Pyruvat Probe bei 94,156 GHz für die lokale 3.35-T Hyperpolarisierer ist. Alle folgenden hyperpolarisations Experiment (n = 14) wurden unter Verwendung dieser Mikrowellenfrequenz mit einer Leistung von 100 mW durchgeführt. Die Mikrowellenstrahlung wurde 60 bis 80 min aufgebracht wird, auf einen Festkörper-Hyperpolarisation von mehr als 90% führt. Die Erg...

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Diskussion

13 CMRSI mit hyperpolarisiertem Sonden ist ein vielversprechendes Verfahren Metabolismus in Echtzeit in vitro zu überwachen und in vivo. Ein sehr wichtiger Aspekt , wenn dieses experimentelle Verfahren verwendet , ist die richtige Standardisierung, insbesondere in - vitro - Experimente in Bezug auf . Erstens muss die Vorbereitung der Probe richtig durchgeführt werden, und stets die gleiche Konzentration von hyperpolarisiertem Material in jedem Versuch zu erzielen. Dies erfo...

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Offenlegungen

Rolf F. Schulte und Marion I. Menzel sind bei GE Global Research beschäftigt.

Danksagungen

E.K. bedankt sich für die Unterstützung durch die Graduate School of Bioengineering (GSB) an der Technischen Universität München. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des SFB-Sonderforschungsbereichs 824 "Bildgebung zur Auswahl, Überwachung und Individualisierung von Krebstherapien" unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HyperSense DNP PolarisatorOxford Instruments3,35 T präklinischer DNP-Hyperpolarisierer
GE/Agilent MR901GE Healthcare/Agilent Technologies7 T präklinischer MRT-Scanner mit kleiner Bohrung für Experimente an Nagetieren
Spinsolve CarbonMagritek1 T NMR-Spektrometer mit Permanentmagnet
DeuteriumoxidSigma Aldrich7789-20-0
Natriumphosphat zweibasischSigma Aldrich7558-79-4
Natriumphosphat monbasischSigma Aldrich7558-80-7
NatriumhydroxidSigma Aldrich1310-73-2
DinatriumedetatSigma Aldrich6381-92-6
Brenztraubensäure - 13C1Cambridge Isotopes LaboratoriesCLM-8077-1
Dotarem (0,5 mmol/L)GuerbetGadoterat Meglumin   
Tris (8-Carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2– 4,5]-bis-(1,3)-dithiol-4-yl)-methylnatriumsalz (OX063)GE HealthcareTritylradikal zur Verwendung als Quelle der
ATCCCRL1435
F-12K Medium ATCC30-2004
Fötales RinderserumATCCSCRR-30-2020
Trypsin-EDTA-Lösung, 1xATCC30-2101
Proben-PlastikbecherOxford Instruments
TrypanblauBio-Rad145-0013-MSDS
Freie-Elektronen-PC3-Zelllinie

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