Molekulare Diffusion in Plasmamembranen von primären Lymphozyten mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie gemessen

Zusammenfassung

Eine Methode zur Messung der Proteindiffusion in Membranen primärer Immunzellen mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) wird beschrieben. In dieser Arbeit wird die Verwendung von Antikörpern für die Fluoreszenzmarkierung veranschaulicht.

Zusammenfassung

Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung der Diffusion von Molekülen in biologischen Membranen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. FCS kann die molekulare Konzentration und Diffusionskoeffizienten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in der Zellmembran zu quantifizieren. Diese Technik hat die Fähigkeit , die molekularen Diffusionseigenschaften von Molekülen in der Plasmamembran von Immunzellen im eingeschwungenen Zustand (dh ohne Prozesse beeinflussen das Ergebnis bei der tatsächlichen Messzeit) zu erforschen. FCS ist für die Diffusion von Proteinen zu studieren, die typisch für die meisten endogenen Proteinen in Konzentrationen exprimiert werden. Hier wird eine einfache und robuste Methode, um die Diffusionsgeschwindigkeit von Zellmembranproteinen auf primären Lymphozyten zu bestimmen, wird demonstriert. Ein effektiver Weg, Messungen an Antikörper gefärbten lebenden Zellen durchzuführen und häufig auftretende Beobachtungen nach dem Erwerb werden beschrieben. Die jüngsten Fortschrittebei der Entwicklung von photostabile Fluoreszenzfarbstoffe können durch Konjugieren der Antikörper von Interesse verwendet werden Farbstoffe geeignet, dass während der Messungen nicht extensiv bleichen. Zusätzlich erlaubt dies für die Detektion von langsam diffundierenden Einheiten, die ein gemeinsames Merkmal der Proteine ​​in Zellmembranen exprimiert wird. Das Analyseverfahren Molekülkonzentration und Diffusionsparameter aus den erzeugten Autokorrelationskurven zu extrahieren, wird markiert. Zusammenfassend ist ein Basisprotokoll für die FCS-Messungen vorgesehen sind; sie kann durch Immunologen mit einem Verständnis für die konfokale Mikroskopie, aber mit keiner anderen bisherigen Erfahrungen von Techniken zur Messung von dynamischen Parametern, wie Molekulardiffusionsraten folgen.

Einleitung

Viele Immunzellen Funktionen basieren auf der molekularen Diffusion und Wechselwirkungen innerhalb Membranen. Biologische Membranen sind komplex und viele Faktoren, die für die Funktion von Immunzellen wichtig sein kann , um die Geschwindigkeit der Translationsdiffusion von Proteinen in Zellmembranen ¹ beeinflussen kann. Wir haben kürzlich gezeigt , dass die natürliche Killer (NK) Zellen, gehören , Lymphozyten des angeborenen Immunsystems, weisen differentielle Diffusion von beiden untersuchten Proteine an der Zellmembran in Abhängigkeit von dem Zustand der NK - Zell - Aktivierung ^2.

Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine Technik, die zur Quantifizierung molekularen Diffusionsraten innerhalb biologischer Membranen fähig ist. Es zeigt die durchschnittliche Diffusionsrate von fluoreszenz Moleküle in einem festen Volumen markiert, üblicherweise im Mittelpunkt eines konfokalen Mikroskops. Es basiert auf der Messung der Schwankungen in der Fluoreszenz, die auf Molekularbewegung auftreten inein System im stationären Zustand. FCS wurde zur Untersuchung der Diffusion von fluoreszierenden Farbstoffen und Proteinen sowohl in Lösung als auch in Lipidmembranen verwendet. Andere Ausgabeparameter die Diffusionsgeschwindigkeit zu beeinflussen auch indirekt werden kann auf diese Weise (zB Konformationsänderungen von Proteinen oder Wechselwirkungen von Molekülen auf Zellmembranen) untersuchten ^{3, 4.} FCS zeichnet sich im Vergleich zu anderen Verfahren aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, so dass die Möglichkeit zur Einzelmolekül-Detektion. Es funktioniert gut für die molekulare Konzentrationen im nanomolaren bis millimolaren Bereich, der für die endogene Expressionsniveaus der meisten Proteine ⁵ typisch ist. Weiterhin FCS kann eine Approximation der absolute Anzahl von Proteinen innerhalb des untersuchten Volumen geben, während die meisten anderen Techniken nur relative Informationen über die Proteinexpressionsniveaus ergeben. Andere Methoden molekularen Diffusionsraten zu messen, in Membranen Fluo umfassenzenz Erholung nach dem (FRAP), Einzelpartikelverfolgung (SPT), mehrere Pinhole FCS und Bildkorrelationsphotobleaching Methoden. FRAP und Bildkorrelationsverfahren sind ensemble Techniken, die im allgemeinen keine Informationen über die absolute Anzahl der Moleküle ¹⁰ geben. Im Vergleich zu SPT ist der Durchsatz von FCS höher in Bezug auf die Bevölkerungsdurchschnitt zu charakterisieren. Die Analyse ist auch weniger anspruchsvoll, da die durchschnittliche Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle innerhalb des Laserfokus wird gemessen, eher als die Geschwindigkeit der einzelnen Moleküle. Auch, es sei denn spezielle Mikroskope sind ¹¹ verfügbar, SPT können keine Informationen über Konzentrationen geben, da Standard - SPT Kennzeichnung sehr gering sein muss für die Identifizierung von einzelnen Molekülen zu ermöglichen. Auf der anderen Seite erfordert FCS die Moleküle untersucht, mobil zu sein. Es wird einfach keine vermeintlichen immobile Fraktionen oder Moleküle sehr langsam bewegen erkennen. Die Diffusionsgeschwindigkeit von Molekülen, diebefinden sich innerhalb der Fokus mehr als etwa ein Zehntel der Akquisitionszeit ^3, in FCS - Messungen werden ¹² nicht korrekt dargestellt. Daher ist es durch FCS aufgezeichnet Diffusionskoeffizienten sind in der Regel schneller als die Diffusionsraten von Techniken wie FRAP und SPT berichtet werden, wo die Nähe zu unbeweglich und sehr langsam Fraktionen als auch berücksichtigt werden. SPT wird auch eine detailliertere Beschreibung der Variabilität von Diffusionsraten innerhalb der molekularen Population als FCS geben.

FCS quantifiziert die Schwankung der Fluoreszenzintensität über die Zeit innerhalb des angeregten Volumens. Im Falle von Membran Messungen bedeutet dies zu der beleuchteten Fläche der Membran. In diesem Papier nutzen wir die Tatsache, dass solche Schwankungen durch Moleküle aufweisen Brownsche Diffusion induziert werden und somit in und aus dem Anregungsvolumen bewegt. Es gibt auch mehrere andere mögliche Quellen für die schwankungentionen im Fluoreszenzsignal, wie Blinken oder Gegenwart eines Triplett-Zustand in der Fluorophore, Umweltauswirkungen, bindungs ​​unbinding des Liganden, oder die Bewegung der gesamten Zellmembran. Diese vermeintliche Fehlerquellen müssen in Betracht gezogen werden , wenn ein FCS - Experiment , um die Gestaltung , um genau die Ergebnisse ^{12, 13} zu interpretieren. Typischerweise seitliche Diffusionsraten in biologischen Membranen sind gering durch Crowding und Interaktionen, sowohl zwischen den Membranproteinen und zwischen Proteinen und dem Zytoskelett. Historisch gesehen , wurde die Verwendung von FCS in Membranen somit durch das Fehlen von photostabilen Fluorophore behindert, die erforderlich sind , während der verlängerten Laufzeiten durch die Anregungsfokus ¹⁴ Bleichen zu vermeiden. Doch heute gibt es viele Möglichkeiten für geeignete photostabile Farbstoffe. Signifikante Verbesserungen in Detektoren und anderer Hardware ermöglicht auch die Detektion von fluoreszierenden ProteIns und Farbstoffe von geringer Helligkeit. Hierbei wird ein Basisprotokoll für die Anwendung von FCS murine primären Lymphozyten verwendet, wobei das Protein von Interesse mit einem fluoreszierend markierten Antikörper markiert ist, wird beschrieben. Ein Ansatz, um die Autokorrelationskurven, um zu passen den Diffusionskoeffizienten und die molekulare Dichte wird auch gezeigt, zu extrahieren. Das Protokoll zielt darauf ab, wird leicht gefolgt von Immunologen ohne vorherige Erfahrung von Techniken, um die Diffusion von Molekülen zu untersuchen. Es ist jedoch ein grundlegendes Verständnis für die konfokale Mikroskopie erwartet (um diese grundlegende Verständnis gewinnen, siehe Referenz ^15). Dieses Protokoll kann relativ leicht auf andere Suspensionszellen adaptiert werden, die beide Zelllinien und Primärzellen. Für erfahrene Anwender FCS, verfeinerte Analysemethoden existieren, von denen einige in der Diskussion beschrieben werden.

Protokoll

1. Die Färbung für FCS

1. Isolieren murinen NK - Zellen aus der Milz - Lymphozyten unter Verwendung von magnetischen Kügelchen Kennzeichnung, gemäß dem Protokoll des Herstellers ^16. Verwenden Sie 2-3 x 10 ⁵ Zellen pro Probe für die folgenden Schritte.
   HINWEIS: negative Selektion Verwenden Sie die Zielzellpopulation zu bereichern, sie unberührt bleiben, so dass die Zellen allein mit primären Antikörpern markiert werden können. Siehe Referenz ² für detailliertere Informationen über die Zellisolierung von Mäusen ^2.
2. Für murine Zellen Fc-Rezeptoren exprimieren, blockieren die Fc-Rezeptoren mit dem Antikörper Klon 2.4G2 bei 5 ug / ul in 25 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 1% fötales Rinderserum (FBS) pro Probe. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur.
3. Herstellung der Antikörpermischung.
   1. Verwenden Antikörper direkt mit einem Foto stabilen Fluorophor konjugiert. Wenn zwei Antikörper gegen zwei verschiedene ProteineVerwendung Fluorophore verwendet, die gut getrennten Emissionsspektren haben die Übersprechen zu minimieren (zB angeregt durch die 488 und 633 Laser ^2, später im Protokoll bezeichnet als die "grünen" und "roten" Laser und Fluorophore bzw. ).
      HINWEIS: Wenn eine kommerzielle markierte Antikörper mit photostabilen Fluorophore nicht für die ausgewählten Biomarkern zur Verfügung stehen, Konjugat unmarkierten Antikörper gegen die Fluorophore gemäß den Anweisungen des Herstellers. Siehe Werkstoff - Tabelle für die in dieser Studie verwendeten Antikörper.
   2. Bereiten ein Antikörpergemisch von fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen das Protein oder Proteine ​​von Interesse in PBS + 1% FBS verdünnt. Fügen Sie die Antikörpermischung an jeder Probe auf ein Endvolumen von 50 & mgr; l pro Probe. Inkubieren auf Eis für 45 min im Dunkeln.
      HINWEIS: Optimieren der Konzentration der Antikörper im Voraus, um sicherzustellen, dass der Antikörper mit einer sättigenden Konzentration verwendet wird, typischerweise1-10 & mgr; g / ml.
4. Nach der Inkubation die Zellen werden durch 250 ul PBS Zugabe und sie bei 150 × g für 3 min zentrifugiert werden. Überstand verwerfen.
5. Wiederholen Sie Schritt 1.4.
6. Resuspendieren der Zellen in 200 & mgr; l PBS + 1% FBS. Halten Sie sich auf Eis und im Dunkeln, bis die Erfassung.
   HINWEIS: Murine NK-Zellen können für bis zu 10 Stunden auf Eis gehalten werden.

2. Herstellung von Mikroskop-Objektträger Kammerdeckgläser

HINWEIS: Verwenden Sie chambered Abdeckglas Dias oder Gerichte mit der Deckglasdicke, dass das Mikroskop für optimiert wurde, entweder # 1 oder # 1.5. Wenn das Mikroskop nicht für eine bestimmte Dicke ausgerichtet ist, oder wenn es nicht bekannt ist, muss das Mikroskop Kragenring für die aktuelle Dicke Abdeckglas ¹⁷ optimiert werden.

1. Verdünnte poly-L-Lysin mit destilliertem Wasser in einem Verhältnis von 1:10. Mit 200 & mgr; l verdünntes poly-L-Lysin in die Kammern und inkubiert für 20 min.
2. Entferne dasdie Kammer der Luft trocknen poly-L-Lysin durch Aspiration und lassen, indem sie es ohne Deckel bei Raumtemperatur für mindestens 20-30 min verlassen.

3. Starten des FCS-System

Hinweis: Dieses Protokoll bezieht sich auf ein spezifisches Mikroskopsystem und Software (siehe Materialien / Reagenzien Table), obwohl auch andere Konfigurationen Mikroskopie und Software - Pakete verwendet werden können.

1. Schalten Sie den konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit dem FCS-Korrelator. Öffnen Sie die Software im "Expertenmodus". Wählen Sie das 40-fache Wassertauchobjektiv.
2. Unter dem Reiter, drücken Sie "Acquire" die "Config" und "Scan" Tasten , um die "Configuration Control" zu öffnen und die "Scan Control" Fenster (Fenster A und B in Abbildung 1, respectively). Im Rahmen der "Confocor" Registerkarte, drücken Sie "Messen" zu öffnen Sie die "Messung" Fenster (Fenster C in Abbildung 1).
3. Erstellen Sie einen Ordner mit dem FCS zu speichernMessungen. Starten Sie eine neue Bilddatenbank von "Neu" unter der Registerkarte "Datei" klicken.
4. Mit Hilfe der "Laser" Taste, schalten Sie die Halogenlampe und die entsprechenden Laser zur Anregung der Fluorophore (zum Beispiel 488 nm für die "grüne" Anregungslaser und 633 nm Anregung für die "roten" Anregungslaser).
5. Wählen Sie geeignete Anregungs- und Emissionsfiltern und die entsprechenden Detektoren aktivieren.
   1. Geben Sie die Einstellungen für die Bilderfassung, einschließlich der Anregungslaser, Anregungs- und Emissionsfilter, Lichtpfad und Detektoren verwendet werden, in der "Configuration Control" -Fenster.
   2. In ähnlicher Weise geben Sie die entsprechenden Einstellungen für die FCS-Messungen in der "Messung" Fenster, unter dem "System Configuration" Tab. Verwenden Sie als ähnliche Einstellungen wie möglich für die Bildgebung und FCS.
   3. Aktivieren Sie die Detektionskanäle für FCS-Aufnahmen von den "Ch1" Feld für die grüne channe Überprüfungl und "Ch2" für den roten Kanal in der "Messung" Fenster.
      HINWEIS: Die Einstellungen sollten für den Fluorophor (en) verwendet, wie in einem Standard-konfokalen Abbildungsexperiment optimiert werden. In nachfolgenden Experimenten können die gleichen FCS Einstellungen durch Öffnen eines alten FCS-Datei wieder verwendet werden, mit dem "Confocor" Pull-Down-Menü am oberen Rand der Benutzeroberfläche, und wählen Sie "Datei öffnen". Drücken Sie "Wiederverwendung" in der entstehenden Erfassungsfenster. In ähnlicher Weise können die Einstellungen der Bildaufnahme durch eine gespeicherte Bild zu öffnen und geladen werden Drücken von "Wiederverwendung".
6. Warten Sie, bis der Laser vor der Durchführung FCS Messungen stabil ist. Dies kann bis zu 30 Minuten für Gaslaser nehmen, während Diodenlaser schneller stabilisieren. Stellen Sie die Pinhole während des Wartens.

4. Pinhole Anpassung

1. Bereiten 0,2-0,5 uM Lösungen von Fluorophoren oder Fluoreszenzfarbstoffe in die Anregungs- und Emissionsspektren der Etiketten auf den Antikörpern entsprechen. DasFluorophore müssen Diffusionskoeffizienten ¹⁸ haben ^{bekannt, 19.}
2. Setzen Sie einen 50 ul Tropfen der Lösung mit dem Fluorophor durch den grünen Laser in der Mitte eines gut in einem Kammerdeckgläser Dia erregt. Ein Tropfen destilliertes Wasser auf dem Wasser Ziel 40X und den Schlitten zu positionieren. Drücken Sie die "Vis" Taste sichtbares Licht zu starten und verwenden Sie das Okular zu finden und konzentrieren sich auf die Fluorophore Tropfen.
   HINWEIS: Verwenden Sie den gleichen Schlitten wie für die spätere Zellmessungen, da vermeintliche leichte Variationen in Glasdicke zwischen den Folien des Mikroskops Ausrichtung beeinflussen können.
3. Setzen Sie den Fokus auch im Inneren des Flüssigkeitstropfen (10-100 & mgr; m von unten).
4. In der "Messung" Fenster wählen Sie den "Erwerb" aus. Drücken Sie auf "Aktuelle Position" unter den "Positionen" (Fenster C in Abbildung 1).
5. Zurück zum "System Konfiguration" im gleichen Fenster. Stellen Sie einen hohen power für den grünen Laser.
   HINWEIS: Eine hohe Laserleistung bezieht sich auf die Sättigungsleistung (dh das Fluoreszenzsignal nicht linear erhöht , wenn die Laserleistung weiter erhöht wird ). Etwa 1 mW von Systemeinstellungen Leistung, oder 5-10% der max Laserleistung ist in der Regel genug.
6. Testen Sie die Stabilität des Signals durch Drücken der Taste "Start". Es öffnet sich ein separates Fenster mit dem Zeitverlauf und Autokorrelation Kurve für die aktuelle Messung angezeigt wird. Überprüfen Sie, ob das Fluoreszenzsignal hoch ist, über die Zeit stabil ist, und zeigt Schwankungen im kHz statt Hz-Bereich.
7. Wählen Sie den "O einstellen" in der "Messung" Fenster. Überprüfen Sie, ob die richtige Erfassungskanal (Ch1 oder Ch2) ausgewählt ist. Drücken Sie "AutoAdjust X." Wenn die resultierende Kurve nicht ein deutliches Maximum ergibt, ist oder die maximale am Rand ist, markieren Sie die "grob" und drücken "AutoAdjust X" wieder. Wenn der resultierende Bildschirm in der x-Richtung beendet ist, tun, um die samich für Y von "AutoAdjust Y." drücken
8. De-select "grob" und wechseln zwischen Anpassung X und Y durch "AutoAdjust" drücken, bis beide klare Maxima haben und die Werte ändern sich nicht zwischen den Messungen.
9. Wenn Zellen mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren markiert sind, zu einer Kammer bewegen, wo roten Fluorophor-Lösung hinzugefügt wurde. Wählen Sie eine hohe Laserleistung für den roten Laser und wiederholen Sie die Schritte 4,6-4,8 für den roten Anregungs- und Detektionskanal.
   HINWEIS: Wenn X und Y-Werte zwischen den Kanälen in Systemen abweichen, wo nur ein Pinhole für beide Detektionskanäle verwendet wird, Zwischenwerte auswählen und auf OK drücken, um die Änderungen zu übernehmen. Hier für den 488 nm-Laser mit Maxima bei X = 79 und Y = 189 und der 633-nm-Laser mit Maxima bei X = 80 und Y = 188, Werte X = 80 und Y = 189, wurden ausgewählt. Die Kombination der 488 nm und 633 nm-Laser zur Anregung der beiden mit Fluorophoren markierte Antikörper angeregt durch 488 nm oder 633 nm ist eine gute Wahl, da dieRisiko für Übersprechen, wenn die Emissionsspektren ² nicht überlappen minimiert.

5. Messen Sie die Transitzeit der Freien Fluorophore

Hinweis: Durch die Durchgangszeit durch den Fokus (Taud) eines Fluorophors mit einem bekannten Diffusionskoeffizienten, die Größe des Detektionsvolumens zu bestimmen, und damit der Bereich der Zellmembran, die im Fokus ist, berechnet werden kann. Die Berechnung der Taud wird in Schritt 7.2 beschrieben.

1. Mit den gleichen Lösungen für die Pinhole - Einstellung verwendet, stellen Sie die Erfassungszeit auf 30 Sekunden x 2 Wiederholungen unter der "Erwerb" Reiter in der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster C).
2. Starten Sie eine Messung durch einen Klick auf "Start" in der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster B).
   1. Durchführen einer Laserleistung Serie für jeden Anregungslaser und dem entsprechenden Fluorophors in der Lösung bei oder nahe Ausgangssättigende Kraft und für jede Messung um die Hälfte zu verringern. Ändern Sie die Laserleistung in der "Systemkonfiguration" -Register der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster C). Drücken Sie die Schaltfläche "Start" eine Messung zu starten.
      Hinweis: Geben Sie die Laserleistung für die kommenden Zellmessungen im unteren Bereich (zB Messung bei 16, 8, 4 und 2 & mgr; W Leistung, vor dem Objektiv) ^20. System Lasereinstellungen sind im allgemeinen höher als die Ausgangs Anregungs- und variieren weitgehend in Abhängigkeit von dem Mikroskop und der Qualität der Ausrichtung. In diesem System entspricht die obige Leistungsbereich auf etwa 60-500 & mgr; W von Systemeinstellungen Macht. Es wird empfohlen, einen Leistungsmesser verwenden, um die Leistung vor dem Ziel zum ersten Mal ein neues Mikroskop verwendet wird, zu messen. Die aktuelle maximale Leistung des Lasers wird unter der Schaltfläche "Info" der "Messung" Fenster gefunden.
   2. Schreiben Sie die Zählungen pro Mol nach untencule (CPM, Einheit: kHz) aus jeder Laserleistungsmessung.
   3. Wenn zwei Detektionskanäle verwendet werden, überprüfen Sie die Fenster, um die Autokorrelationskurve für Übersprechen anzeigt. Verwenden, um eine Lösung nur grüne Fluorophore enthält, die in dem roten Detektionskanal detektiert FCS Autokorrelation zu messen und eine Lösung mit nur rote Fluorophore Detektion im grünen Detektionskanal zu beurteilen. Als Faustregel gilt: Halten Sie die CPM von der "falschen" Fluorophor unter 5% des spezifischen Signals von der richtigen Fluorophors detektiert.
   4. Überprüfen Sie, ob die Werte verwendet, linear mit der Laserleistung zu skalieren. Sättigung von CPM bei der höchsten Laserleistung (dh etwas niedrigere Werte als die von einer linearen Beziehung erwartet) ist akzeptabel.
      HINWEIS: CPM für die höchste Laserleistung gut sein für fast alle Mikroskopsysteme und gemeinsame Fluorophore und kann deutlich höher sein für empfindliche Systeme über 10 sollten. Das erste Mal, wenn ein neu konjugierte fluoreszierende Antikörper verwendet wird, führen Sie eineFCS-Messung des Antikörpers diffundieren frei in Lösung, um die erwarteten CPM zu quantifizieren. Vor der Messung coat die Meßkammer mit 200 & mgr; l Poly-L-Lysin mit Polyethylenglycol gepfropft (verdünnt auf 0,5 mg / ml in PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und ermöglichen die Kammer an der Luft trocknen. Speichern Sie die Stammlösung im Kühlschrank (bis zu 2 Wochen) und das Pulver Lager in den Gefrierschrank. Am Mikroskop, verdünnte den Antikörper auf 1-10 & mgr; g / ml in PBS. Führen Sie die Schritte 4,2-4,4 und 6,7 in diesem Protokoll. Wenn die Oberfläche nicht mit einer Antihaft-Lösung beschichtet wird, Antikörper mit der Glasoberfläche in Wechselwirkung treten und sich schnell aus der Lösung abgereichert werden.

6. Zellmessungen

1. Hinzufügen 125 ul der Zellen in PBS + 1% FCS aus dem Antikörper-markierte Zellsuspension (Schritt 1.5) und 150 & mgr; l transparent Rpmi 1640 (RPMI) in eine Vertiefung eines 8-Well-Kammerdeckgläser Folie. Leave die Zellen im Dunkeln bei Messtemperatur für mindestens 20 min vor der FCS-Messungen zu starten.
   Hinweis: Dies ist, damit die Zellen an den Boden der Vertiefungen und äquilibrieren die Zellen und Lösung auf die Messtemperatur absetzen und befestigen.
2. Im "Scan Control" Fenster (Abbildung 1, Fenster B), stellen Sie Zoom 1 und einen schnellen XY - Scan starten , indem Sie den "Fast XY" Taste drücken. Ändern Sie die Laserleistung so, dass es so gering wie möglich ist, während die Zellen noch deutlich sichtbar sind. Zentrieren des Bildes auf einer runden Zelle der durchschnittlichen Helligkeit, wobei die Membran klar definiert ist und es gibt kein fluoreszierendes Signal im Cytoplasma. Zoom in, bis die Zelle größte Teil des Bildes abdeckt.
3. Wählen Sie eine neue Zelle, wenn die aktuelle Zelle bewegt oder Displays Ranken, Profile oder extrem hellen Flecken. Halten Sie die gleiche Zoom und Laserleistung für alle im gleichen Experiment erfassten Zellen.
   HINWEIS: Eine zerzauste Membran kann auch ein Zeichen der kommenden apo seinPtosis.
4. Konzentrieren Sie sich auf der Oberseite der Zellmembran. In der "Erwerb" -Register der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster C), wählen Sie eine Position für die FCS - Messung durch Aktivierung "Fadenkreuz" . Alternativ wählen Sie die Registerkarte "LSM-Bild", das wollte Messfleck in der LSM-Bild zu markieren, und drücken Sie "Position hinzufügen."
   HINWEIS: Die Oberseite der Zellmembran nicht durch fluoreszierende Antikörper oder Fluorophore unspezifisch an die Poly-L-lysin gebunden beeinflusst werden. Allerdings ist es wichtig, festzustellen, dass die Zelle nicht während der Messung bewegen (die Ergebnisse zu sehen).
5. In der "Erwerb" -Register der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster C), stellen Sie die Anzahl der Wiederholungen zu 6-10, mit dem "Measure Time" bei 10 Sekunden pro Wiederholung eingestellt.
6. Zurück zur "Systemkonfiguration" -Register der "Messung" Fenster. Stellen Sie die Laserleistung für die FCS-Messung unter dem "LAser "Taste. Vor dem Ziel, verwenden Low - Power für Messungen Zelle, im Bereich zwischen 1 und 10 & mgr; W ^20.
   HINWEIS: Die empfohlenen Werte sind ein Kompromiss zwischen Signalerkennung und Lichtschäden an Zellen. Siehe Schritt 5.2.1 Hinweis den Prozentsatz der Laserleistung diese Werte entsprechen.
7. Starten Sie eine FCS-Messung von "Start" in der "Messung" Fenster (Fenster C) drücken. Wenn die Zelle Bleichmittel signifikant zu Beginn der Messung, wie durch einen Abfall in der Intensität Spur detektiert um mehr als 30% in den ersten 10 sec (ein Beispiel ist in 3A, untere Tafel dargestellt) bewegen und in eine andere Zelle unteren die Laserleistung für zukünftige Messungen.
   1. Wenn das Signal verloren geht, stellen Sie den Fokus in der Z-Richtung. Nachdem die Messung abgeschlossen ist, verwenden Sie die "Scan Control" Fenster (Abbildung 1, Fenster B) zu überprüfen , dass die Zelle noch zentriert ist und dass die Zellmembran gemessen. Wenn the Zelle bewegt hat, um die Messung zu verwerfen.
   2. In der Autokorrelationsfenster , in dem die Messung angezeigt wird, löschen Sie manuell einzelne Wiederholungen , die das Zoomen Manöver enthalten, Bleichen, große Cluster oder andere Artefakte (siehe Beispiele in Abbildung 3). Tun Sie dies durch Markieren sie der rechten Maustaste, und wählen Sie "Löschen". Speichern Sie die letzte Datei in .fcs Format. Sparen Sie mindestens vier Wiederholungen pro Zelle.
8. Gegebenenfalls ein Bild der Zelle an dem Mittelabschnitt (mit dem gesamten Umfang der Membran sichtbar) unter Verwendung des "Scan Control" Fenster erfassen. Nehmen Sie das Bild nach der FCS-Messung Bleichen zu vermeiden. Drücken Sie die "Single", um die Bildaufnahme zu starten.
9. Bei der Verwendung von "Add-Position" für den FCS Fokus Positionierung, klicken Sie auf "Entfernen Position", bevor in die nächste Zelle weitergehen.
10. Wechseln Sie zu einem neuen Teilmenge der Zellsuspension nach maximal 2 Stunden der Messung die Zellen lebensfähig zu halten throughout das Experiment.

7. FCS-Analyse

1. Öffnen Sie die .fcs Dateien in einer Software mit Kurvenanpassung Fähigkeit (siehe Materialien / Reagenzien Tabelle für die Software in diesem Protokoll verwendet).
   HINWEIS: Die FCS-Software, die mit dem Mikroskop kommt, ist ein guter Ort, um sich mit Grundbeschlag, aber zusätzliche Software ist notwendig, zweidimensionale Membrandiffusion zu passen.
2. Zuerst bestimmen die Größe des Anregungsvolumen durch die freie Fluorophor Messungen analysiert. Setzen Sie eine 3-dimensionale freie Diffusionskurve zu den Autokorrelation Kurven ^21.
   (Gl. 1)
   HINWEIS: Definition der Parameter: N die mittlere Anzahl von fluoreszierenden Einheiten im Fokusvolumen, τ (Tau): Korrelationszeit, τ _D (Taud): mittlere Verweilzeit im Fokusvolumen, T 1: Wahrscheinlichkeit für die Fluorophore zu sein in die Triplett-Zustand, τ T: Relaxationszeit für den Singulett-Triplett - Zustandsübergänge, S: Verhältnis von Höhe Durchmesser für das Fokusvolumen zu Breite.
   1. Auszug Taud, die Laufzeit für Moleküle, die den Fokus zu übertragen.
   2. Verwenden der beobachteten Taud und veröffentlichte Diffusionskoeffizienten (D) von Fluorophoren für die Kalibrierung verwendet , ^{18, 19} , die Pinhole Radius (ω) zu berechnen.
      (Gl. 2)
3. Analyse der Autokorrelationskurven auf Zellmembranen.
   1. Um den Teil der Kurve zu visualisieren molekularen Diffusion darstellt, wählen Sie den Zeitrahmen beginnt vor dem steilsten Neigung der Autokorrelationskurve und endet nach der Kurve Konvergenzen bei 1 (zB 0,001 bis 5 sec für Maus - Oberflächenrezeptoren, siehe Abbildung 4).
   2. Erzeugen Sie eine durchschnittliche Autokorrelation Kurve der einzelnen Wiederholungen gespeichert in Schritt 6.7.2.
   3. Passen ein 2-dimensionales Membrandiffusionskurve an jede Autokorrelationskurve gemittelt unter Verwendung von Gleichung 3 ^3.
      (Gl. 3)
      HINWEIS: Wichtige Ausgangsparameter sind wie folgt: N die durchschnittliche Anzahl der Moleküle im angeregten Membranbereich befinden. Neu berechnen zu Dichte (N / & mgr; m ^2). τ _D (Taud): mittlere Verweilzeit im Schwerpunktbereich, begrenzt durch die Zweidimensionalität der Membran (en). Neuberechnen der mittleren Verweilzeit zu einem Diffusionskoeffizienten (& mgr; m ² / s) über die ermittelte pinhole Radius (ω) und Gleichung 2 T1 ist die Wahrscheinlichkeit für die Fluorophore in dem Triplett - Zustand zu sein. Die Helligkeit (CPM) wird durch Division der durchschnittlichen Gesamtintensität der Messung durch N. berechnet
   4. Wenn eine gute Passform nicht beim ersten Versuch erreicht wird, ändern Sie die Startwerte und / oder die oberen und unteren Grenzwerte für die Variablen bis this erzielt wird.
      HINWEIS: Typische oberen Untergrenzen für die Proteindiffusionsraten in primären Zellmembranen sind 10-500 ms für Taud, 0-100% für T1, und 0,1 bis 5 ms für TauT1. Wählen Werte für den Einbau in der Mitte dieser Intervalle beginnen. Der Teil der Kurve , die Fluoreszenzfluktuationen von Diffusions abgeleitet wird typischerweise liegt zwischen 1 ms und 1 s (siehe Abbildung 4). In Abhängigkeit von dem Fluorophor kann es manchmal ein zweiter Prozess vorhanden sein, in kürzeren Zeitskalen Anlass zu Autokorrelation geben als die Diffusionsparameter. Dies wird durch eine vorübergehende Dunkelzustand (Triplett) oder blinkt verursacht (wie oft für fluoreszierende Proteine ​​auftreten). Ein Triplett-Zustand wird in der Gleichung berücksichtigt 3 und das präsentierte Modell sollte damit auch eine gute Passung in diesen Situationen bereitzustellen.

Ergebnisse

Ein typisches Ergebnis wird eine Autokorrelationskurve mit einer Durchlaufzeit in dem Bereich von 10 msec bis 400 msec für Membranproteine ​​erzeugen. Die Anzahl der Moleküle können zwischen 0,5 bis etwa 200 pro & mgr; m ² für endogen exprimierte Proteine variieren. Prüfen Sie sorgfältig, dass die CPM ist nicht geringer als erwartet. Dies kann bedeuten, dass es einen Einfluss des Hintergrundsignals. Als Daumenregel gilt, das CPM-Signal auf Zellen, die für die Analyse angen...

Diskussion

Dieses Protokoll für FCS kann für die Bewertung der molekularen Dynamik von Oberflächenmolekülen auf allen Arten von Immunzellen (murine, menschliche oder andere Arten) verwendet werden. FCS Maßnahmen räumlich-zeitliche Molekulardynamik bis auf Einzelmolekülauflösung in lebenden Zellen. Die molekulare Dichte sowie die Diffusionsgeschwindigkeit und clustering Dynamik der Proteine ​​von Interesse, aus den Autokorrelationskurven extrahiert werden.

Die Fluoreszenzmarkierung ist von zentraler Bed...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MACS NK Cell Isolation Kit Maus II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negative Selektion von NK-Zellen
Fötales Rinderserum	Sigma-Adlrich	F7524	Hitzeinaktiviertes
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	-		Hergestellt im Haus
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Transparentes Medium
Antikörperklon 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	Zur Blockierung von Fc-Rezeptoren.
Anti-Ly49A-Antikörper			Monoklonaler Antikörper, der im eigenen Haus hergestellt und im Haus mit Alexa Fluor 647
Klon JR9.318
Anti-H-2Dd-Antikörper	BD Pharmingen	558915	im Haus konjugiert mit MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Fluoreszenzfarbstoff für die Antikörperkonjugation.
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich	P8920	Verdünnt in destilliertem Wasser (1,10)
Poly-L-Lysin (20 kDa), gepfropft mit Polyethylenglykol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3,5]-PEG(2)	Verdünnt in PBS (pH 7,4) auf 0,5 mg/ml.
Rhodamin 110 chlorid	Sigma-Aldrich	432202	Bekannter Diffusionskoeffizient: 3,3 &; 10− 10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientsp;	A20006	Bekannter Diffusionskoeffizient: 4,4 x 10− 10 m2/sec 20
Konfokalmikroskop	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab mit Kurvenanpassungs-Toolbox	Matlab	Version R2013b
Nunc Lab-Tek Kammer-Deckglas	Thermowissenschaftlich	155411	8 Vertiefungen, 1,0 Borosilikatboden