Summary
Detta protokoll / manuskript beskriver en strömlinjeformad process för framställning av sporopollenin exine kapslar (sek) från Mattlummer sporer och för lastning av hydrofila föreningar i dessa sekunder.
Abstract
Mikrokapslar som härrör från vegetabiliska sporer eller pollen ger en robust plattform för en mängd olika mikroinkapslingsapplikationer. Sporopollenin exine kapslar (SECS) erhålls när sporer eller pollen bearbetas för att avlägsna de inre sporoplasmic innehåll. De resulterande ihåliga mikrokapslar uppvisar en hög grad av micromeritic enhetlighet och behålla intrikata mikro funktioner som är relaterade till de särskilda växtarter. Häri visar vi en strömlinjeformad process för framställning av Sek från Mattlummer sporer och för lastning av hydrofila föreningar i dessa sek. Den nuvarande SEC isoleringsförfarandet har nyligen optimerad för att avsevärt minska bearbetningskrav som konventionellt används i SEC isolering, och för att säkerställa produktion av intakta mikrokapslar. Naturliga L. clavatum sporer avfettades med aceton, behandlades med fosforsyra, och i stor utsträckning tvättas för att avlägsna sporoplasmic innehåll. Aceton avfettning, har en enda behandlingssteg med användning av 85% fosforsyra visat sig avlägsna alla sporoplasmic innehåll. Genom att begränsa syra handläggningstiden till 30 timmar, är det möjligt att isolera rena sekunder och undvika SEC sprickbildning, som har visat sig förekomma med förlängd handläggningstid. Omfattande tvättning med vatten, utspädda syror, utspädda baser och lösningsmedel säkerställer att alla sporoplasmic material och kemiska rester på ett adekvat sätt avlägsnas. Vakuumlastningsteknik utnyttjas för att ladda ett modellprotein (bovinserumalbumin) som en representativ hydrofil förening. Vakuum laddning ger en enkel teknik för att ladda olika föreningar utan behov av starka lösningsmedel eller oönskade kemikalier som ofta krävs i andra mikroinkapslingsprotokoll. Baserat på dessa isolerings- och lastningsprotokoll Sek ge en lovande material för användning i en mängd olika mikroinkapslings tillämpningar, såsom läkemedel, livsmedel, kosmetika och personlig omvårdnad proddukter.
Introduction
Det finns ett stort intresse för naturliga växtbaserade kapslar erhållna från växt sporer och pollen för användning i mikroinkapslingsapplikationer. 1-15 I naturen, sporer och pollen ge skydd för känsliga genetiska material mot hårda miljöförhållanden. Den grundläggande strukturen av växt sporer och pollen innefattar typiskt ett yttre mantelskiktet (exine), en inre mantelskiktet (intine), och den inre cytoplasmatiska materialet. Den exine består av en kemiskt robust biopolymer 1,9,10,13,16 kallad sporopollenin och intine består huvudsakligen av cellulosamaterial. 16-18 Tomma kapslar kan isoleras genom olika förfaranden 7,9 för avlägsnande av cytoplasmiskt material , proteiner och den intine skiktet. 2,12,16 Dessa sporopollenin exine kapslar (sECS) tillhandahålla en övertygande alternativ till syntetiska inkapslingsmedel på grund av deras snäv storleksfördelning och enhetlig morfologi. 7,9,13,19,20 denutveckling av standardiserade processer för att få Sek från olika växtarter som Mattlummer, öppnar möjligheterna för ett brett spektrum av mikroinkapslings applikationer inom områdena drug delivery, livsmedel och kosmetika. 6,10-13,21
För att erhålla SECS, forskare först behandlas sporer och pollen med organiska lösningsmedel och återloppskokades i alkaliska lösningar för att avlägsna cytoplasmiska innehåll. 22-25 Emellertid var den kvarvarande kapselstrukturen bestäms att fortfarande innehålla cellulosa intine skiktet. För att ta bort denna, forskare undersökt användningen av långvarig sur hydrolys bearbetning med användning av saltsyra, varm svavelsyra, eller varm fosforsyra under flera dagar, 22 till 25 med fosforsyra bli den föredragna metoden för SEC intine borttagning. 2 dock pågående forskning genom åren har visat att olika sporer och pollen har olika grader av motståndskraft mot den hårda behandling av migthods vanligen används. 26,27 Vissa sporer och pollen är helt förstörd och förlora all strukturell integritet i starkt alkaliska lösningar, eller blir svårt skadade i starkt sura lösningar. 16 variabilitet i SEC svar på behandlingsbetingelser beror på subtila variationer i den kemiska struktur och exine morfologi sporopollenin exine material mellan arter. 28 på grund av variationen i robustheten sporopollenin exine kapslar (sek), är det nödvändigt att optimera förutsättningarna för varje art av sporbildande och pollen bearbetning.
Växt sporer från arten L. clavatum har blivit den mest studerade enskilda källan till sek. Det föreslås att detta är främst på grund av dess omfattande tillgänglighet, låg kostnad, monodispersitet och kemisk stabilitet 9,29 Sporerna kan lätt skördas och innehåller sporoplasmic innehåll i form av grupperingar av 1 -. 2 pm cellulära organeller och biomolecules. 11 L. clavatum sporer har använts som ett naturligt pulver smörjmedel, 30,31 en bas för kosmetika, 30 och i örtmedicin 32-36 för ett brett område av terapeutiska tillämpningar. De SECS erhållna från L. clavatum har visat sig vara mer motståndskraftig mot behandling än Sek från andra arter av sporer och pollen. 2 Efter behandling har de resulterande sekunder visat sig behålla sina intrikata microridge strukturer och hög morfologisk likformighet samtidigt som en stor inre hålrum för inkapsling. 7 studier indikerar att L. clavatum Sek kan användas för inkapsling av läkemedel, 10,13 vacciner, 11 proteiner, 7,14 celler, 8 oljor, 5-7,9 och kosttillskott. 5,15 Observerade SEC last effektivitet är relativt hög i jämförelse med konventionella inkapsling material. 7 Det finns också ett antal rapporterade fördelarSEC inkapsling såsom förmågan att maskera smak, 6,10 och ge en viss grad av naturligt skydd mot oxidation. 12 I befintliga undersökningar, den vanligaste SEC extraktionsmetod för L. clavatum bygger på fyra huvudsteg. Steg ett är lösningsmedelsåterloppskokning i aceton under upp till 12 h vid 50 ° C för att avfetta sporerna. 11 steg två är alkalisk återloppskokning i 6% kaliumhydroxid under upp till 12 h vid 120 ° C för att avlägsna cytoplasmiska och proteinhaltiga material. 11 steg tre är syra återloppskokning i 85% fosforsyra för upp till 7 dagar vid 180 ° C för att avlägsna cellulosa intine material. 11 Steg fyra är en omfattande tvättprocess med hjälp av vatten, lösningsmedel, syror och baser för att avlägsna alla återstående icke-exine material och kemikalierester.
De viktigaste målen för SEC utvinning i förhållande till inkapslings applikationer är att producera kapslar som är tom på cytoplasma material, gratis tillbakam potentiellt allergiframkallande proteiner, och morfologiskt intakta. 2,37 Men från en industriell tillverkningsperspektiv, är det också viktigt att överväga ytterligare ekonomiska och miljömässiga faktorer, såsom energieffektivitet, produktion varaktighet, säkerhet, och resulterande avfallet. När det gäller energieffektivitet, både höga temperaturer och långa handläggningstider påverkar produktionskostnaderna samt miljöpåverkan. Produktions varaktighet och handläggningstid är viktiga faktorer som påverkar bearbetning lönsamhet. Särskilt oroande är att hög temperatur fosforsyra behandling ökar säkerhetsfrågor och är känd för att resultera i frätande skalning vilket leder till betydande ökningar av infrastrukturunderhåll och förseningar i batch handläggningstider. 38-40 Där det är möjligt, vilket minimerar antalet steg som krävs kan leda att avsevärt minska det avfall som produceras. Emellertid den vanligen använda fyra-steg process för L. clavatum SEC extraktion har helt enkelt evolved från decennier av forskning och har haft lite faktiska processoptimering. Nyligen Mundargi et al., 41 gjorde ett betydande bidrag till det pågående arbetet inom detta område genom att systematiskt utvärdera och optimera en av de vanligaste rapporterade SEC utvinningstekniker.
I den första delen av denna studie: spor avfettning demonstreras med användning av aceton bearbetning vid 50 ° C under 6 h; sporoplasm och intine reningssteg demonstreras med användning av 85% fosforsyra behandling vid 70 ° C under 30 timmar; omfattande tvättning med vatten, lösningsmedel, syra och bas användes för att demonstrera avlägsnande av kvarvarande sporoplasmic innehåll; och SEC torkning demonstreras användning av konvektion torkning och vakuum ugnstorkning. I den tredje delen, är SEC vakuum loading demonstrerade användning av vakuum lastning av ett modellprotein, bovint serumalbumin (BSA), följt av BSA-laddade-SEC tvättning och lyofilisering. I den fjärde delen, fastställbaration av BSA inkapslingseffektiviteten demonstreras användning av centrifugering, ultraljudsbehandling med sond, och UV / Vis-spektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utvinning av Sporopollenin Exine kapslar (Sek) från L. clavatum sporer
Obs: SEC extraktion processen innebär en brandfarlig pulver (L. clavatum), varma frätande syror och brandfarliga lösningsmedel, därför lämplig personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, ansiktsmask, handskar, skyddsrock), godkänd riskbedömning av användning och bortskaffande av kemikalier genom auktoriserad laboratoriepersonal är viktigt.
- Spore Avfettning
- Förbereda en återlopps set-up i ett dragskåp med användning av en glas kondensor, vattencirkulationssystem, och vattenbadet (Figur 1).
- Väg upp 100 g L. clavatum sporer utan att skapa damm och på avstånd från alla antändningskällor.
Obs: Sporerna används här var kommersiellt erhållen (se Materials List). - Överförings sporer långsamt till en 1 L polytetrafluoretylen (PTFE) rundbottnad kolv med en magnetisk omrörningsstav.
- Tillsätt 500 ml aceton för att sporerna iPTFE kolven och skaka kolven försiktigt för att bilda en homogen suspension.
- Placera PTFE kolven i vattenbad vid 50 ° C och ansluta till återflödeskondensor.
- Utför återloppskokning i aceton under 6 h under omröring vid 200 varv per minut och låt sedan svalna vid RT.
- Filtrera suspensionen med användning av filterpapper under vakuum och samla in de avfettade sporer i stora (15 cm diameter) glaspetriskålar.
- Torka sporerna vid rumstemperatur (dragskåp) genom att täcka med aluminiumfolie med hål för lösningsmedelsindunstning.
- acidolys
- Förbered 85% (v / v) fosforsyra med avjoniserat (DI) vatten och överföra avfettade torra sporer till en 1 L PTFE kolv.
- Tillsätt 500 ml fosforsyra (85% v / v) till de avfettade sporer.
- Placera PTFE kolven i ett vattenbad inställt på 70 ° C och ansluta till återflödeskondensor.
- Utför mild återloppskokning (70 ° C) i fosforsyra under 30 timmar och låt sedansvalt vid rumstemperatur.
- Späd suspensionen med 500 ml varmt avjoniserat vatten och samla sekunder genom vakuumfiltrering med hjälp av filterpapper.
- Överföra SECS till en 3 L glasbägare för att utföra en serie av tvättningar.
- SEC Tvättning
- Placera 3 L glasbägare innehållande Sek i ett dragskåp.
- Tillsätt 800 ml varmt (50 ° C) avjoniserat vatten till de SECS under försiktig omröring under 10 min.
- Filtrera suspensionen genom användning av filterpapper och ett vakuumfiltrering set-up.
- Samla Sek i en ren 3 L glasbägare.
- Upprepa steg 1.3.1. till 1.3.4. fem gånger.
- Tillsätt 600 ml varm (45 ° C) aceton till Sek under försiktig omröring under 10 min.
- Samla sekunder genom filtrering under vakuum och överföra sekunder för att en ren 3 L glasbägare.
- Upprepa steg 1.3.6. och 1.3.7. med användning av 600 ml varmt (50 ° C) 2 M saltsyra.
- Upprepa steg 1.3.6. och 1.3.7. användning av 600 ml hot (50 ° C) 2 M natriumhydroxid.
- Upprepa steg 1.3.1 och 1.3.4 åtta gånger.
- Upprepa steg 1.3.6. och 1.3.7. användning av 600 ml varmt (45 ° C) aceton.
- Upprepa steg 1.3.6. och 1.3.7. användning av 600 ml varmt (45 ° C) etanol.
- Upprepa steg 1.3.6. och 1.3.7. med användning av 800 ml varmt (50 ° C) avjoniserat vatten.
- Överföra de rena SECS till sex stora glaspetriskålar och torka i ett dragskåp vid RT i 24 h för att avlägsna allt vatteninnehåll.
- Torka sek i en vakuumugn vid 60 ° C och 1 mbar vakuum under 10 h eller till konstant vikt.
- Samla torkade Sek och överför till en polypropylen flaska.
- Förvara Sek i ett torkskåp.
2. Karakterisering av SECS
- Utför svepelektronmikroskopanalys 41 med hjälp av sporer och Sek produceras i olika skeden.
- Utför elementaranalys 41 med hjälp av sporer och Sek produceras i olika skeden. Dry alla prover vid 60 ° C under minst en timme innan elementaranalys och beräkna proteinhalten med hjälp av procent kväve med en multiplikationsfaktor på 6,25. 11 Skaffa resultat med hjälp av trippelmätningar för varje prov.
- Genomför micromeritic egenskaper analys med hjälp av en dynamisk bildpartikel analysator. 41
- Skanna obearbetade, bearbetas och FITC-BSA-laddade sekunder med hjälp av konfokal laserskanning mikroskopi. 41
3. Biomacromolecule Inkapsling genom vakuum Loading Technique
- Förbereda 1,2 ml 125 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) lösning med användning av DI-vatten och överför till en 50 ml polypropylenrör.
- Väg 150 mg Sek och överföra till BSA-lösningen.
- Vortexa röret under 10 min för bildning av en homogen lösning.
- Täck röret med användning av filterpapper.
- Överföra röret till en frystorkare kolv och torka i 4 h med vakuum vid en mbar.
- Utför steg 3,1till 3,5. för tre oberoende satser.
- Uppsamla det BSA-laddade SECS och avlägsna agglomeraten genom att använda en mortel och mortelstöt.
- Överföra BSA-laddade secs till ett 50 ml rör och tillsätt 2 ml Dl-vatten för att avlägsna kvarvarande BSA.
- Samla SECS genom centrifugering vid 4704 x g under 5 min och kasta bort supernatanten.
- Upprepa tvättningen med avjoniserat vatten en gång.
- Täck röret med BSA-laddade sekunder med hjälp av filterpapper.
- Överför SECS till en frys (-20 ° C) och frysa under 1 timme.
- Frysa torka sekunder under 24 timmar och lagra i en frys tills vidare karakterisering.
- Framställa de placebo SECS utan BSA med användning av samma förfarande som i steg 3.1. till 3,13.
- Framställa de FITC-BSA-laddade secs med användning av samma förfarande som i steg 3.1. till 3,13.
4. Bestämning av inkapslingseffektivitet
- Väg 5 mg BSA-laddade sekunder i 2 ml polypropenrör.
- Lägga 1,4 ml fosfate-buffrad saltlösning pH 7,4 (PBS) och vortexblanda i 5 min.
- Probe sonikera suspensionen vid 40% amplitud under 3 cykler av 10 sek.
- Filtrera lösningen med en 0,45 um polyetersulfon (PES) filter.
- Utföra samma procedur som i steg 4.1. till 4,4. med användning av placebo SECS.
- Mät absorbansen vid 280 nm med användning placebo som en blank.
- Kvantifiera mängden BSA inkapslad med användning av en BSA-standardkurva (200 till 1000 | j, g / ml) i PBS. 42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strömlinjeformad Extraction Process för Sporopollenin Exine Kapslar
L. clavatum SEC extraktion uppnåddes genom tre huvudsteg: (1) Uttorkande användning av aceton; (2) acidolys med användning av fosforsyra 85% (volym / volym); och (3) Omfattande SEC tvätt med hjälp av lösningsmedel. Flödet av den strömlinjeformade SEC extraktionsprocessen presenteras i figur 1 A -. I korthet innefattar förfarandet ett avfettande steg med aceton återloppskokning under 6 h vid 50 ° C och avfettade sporer torkades sedan över natten i ett dragskåp för att avlägsna resterande aceton. De avfettade sporerna utsattes för acidolys med hjälp av fosforsyra under 30 timmar. Under acidolys majoriteten av sporoplasmic material löses upp och avlägsnas sedan under vakuumfiltreringssteget. I syfte att avlägsna resterande sporoplasmic material en omfattande serie tvättsteg med hjälp av lösningsmedel, syra, Bas, och vatten utförs. De SECS initialt torkades vid RT under 24 h och torkades ytterligare vid 60 ° C och 1 mbar vakuum under 10 h för att avlägsna kvarvarande lösningsmedel och fukt.
Såsom visas i figur 1, alla SEC extraktionssteg utförs i ett dragskåp med ett meddelande om fara. Under SEC utvinning, ca 70% massa förlust observeras på grund av avlägsnandet av sporoplasmic material och våra data är förenligt med befintliga rapporter om produktionen av rena och intakta sekunder. 7, 19,20,29 Den rationaliserade processen från det inledande avfettning steget till den slutliga produkten är klar i cirka 5 dagar och processen kan lätt skalas upp till en 1 kg sats i laboratorieskala med ordentliga säkerhetskontroller.
Inkapslingssteg använder Sek presenteras i Figur 1 J - M, dessa är fördelaktiga på grund av att enkla steg utan involving hårda organiska lösningsmedel eller kräver mekaniska skjuvkrafter. 7 Våra inkapslingsexperiment involverar 150 mg Sek och en buffertlösning volym tillräcklig för upptag av SECS. Belastningen i dessa sek begränsas av föreningens löslighet i utvalda vattenbaserade eller organiska lösningsmedel, och lastning kan åstadkommas genom vilken som helst av tre laddningsmetoder: passivt, komprimering och vakuum lastning. Men ger vakuum laddning relativt högre inkapsling av föreningar. 7, 19,20
Fysikaliskkemiska karakteriseringar av Sporopollenin Exine Kapslar
För att bestämma renhet av sek produceras med hjälp av rationaliserade processen visas i figur 1, var ytan och tvärsnitts morfologi, micromeritic egenskaper och grundämnessammansättningen behandlas vid olika skeden av utvinningsprocessen SEC. Såsom visas iFigur 2, SEM bilderna anger intakta sporer med en unik mikrostruktur, och före behandling, var micron skala sporoplasmic organ observerats i tvärsnittsbild. Med spor avfettning och alkalibehandling inga morfologiska och strukturella förändringar observerades bortsett från bristning av sporoplasmic organeller.
Figur 3 visar SEM bilder av SECS efter acidolys med användning av fosforsyra vid olika tidpunkter från 5 h till 30 h. Dessa resultat stöd som acidolys för upp till 30 timmar ger hela och rena Sek saknar sporoplasmic material. För att bekräfta resterande proteinhaltigt material, var CHN elementaranalys 29 utförs och data presenteras i figur 4. Dessa resultat ger en riktlinje för att välja den bästa behandlingen förutsättning för att uppnå rena och intakta sekunder. I fallet med avfettad och alkalibehandlade SECS, ingen väsentlig proteinhaltigtavverkning observeras. Men med acidolys med användning av fosforsyra, är majoriteten av protein material som avlägsnats i 30 timmar och ingen ytterligare minskning observeras med ökande processtiden upp till 120 timmar. Den elementära uppgifter överensstämmer med tidigare rapporter om utökad behandling av SECS 7,11 och med kommersiella sekunder.
Micromeritic egenskaper analyserades med dynamisk bild partikelanalys (DIPA) och resultaten presenteras i figur 5. Dessa resultat stöder den likformiga storleksfördelningen av SECS efter acidolys under upp till 30 h, med en storlek på 31,0 ± 2,2 | j, m. Däremot minskar SEC strukturell integritet med förlängd acidolys och börjar orsaka betydande fragmentering av sekunder utöver 30 tim behandlingsdurationer.
Figur 6 visar SEM och DIPA data för Sek framställda med endast acidolys probetning med användning av fosforsyra under 30 h. Dessa resultat bekräftar att efter avfettning steget, acidolys producerade rena och intakta SECS med en likformig storleksfördelning av 32,5 ± 2,7 ^ m. Acidolys enbart sekunder har en restproteinhalt av endast 0,15 ± 0,0%, som bestämdes i förhållande till innehåll% kväve, 11, som är jämförbart med sek produceras av alkali och acidolys behandling som diskuterats ovan och med tidigare rapporter. 7
Mikroinkapsling med hjälp Sporopollenin Exine Kapslar
För att demonstrera användningen av L. clavatum sekunder producerade med acidolys enbart process, har mikroinkapslingsexperiment utförs med hjälp av BSA som ett modellprotein. Lastningen in i SECS uppnåddes genom användning av en vakuumlastningsteknik med användning av 150 mg sek och 1,2 ml 125 mg / ml BSA. Figur 7 visar CLSM imåldrarna sekunder före och efter acidolys endast bearbetning och med FITC-BSA inkapsling. Data visar att obehandlade SECS uppvisar autofluorescens på grund av närvaron av sporoplasm beståndsdelar inuti spor hålighet. Men efter acidolys-bearbetning endast är alla sporoplasmic innehåll bort vilket resulterar i en tom inre hålrum. Slående, efter inkapsling av FITC-BSA, är grön fluorescens observeras inuti SECS, vilket bekräftar inkapslingen av modellprotein i SECS. 19,20,41
Vidare, för att undersöka de morfologiska förändringar och micromeritic egenskaper hos BSA-laddade Sek, SEM och DIPA analys utfördes och data presenteras i figur 8. SEM bilder bekräfta förekomsten av intakta och rena microridges efter BSA lastning. Därutöver har inga väsentliga förändringar observerades i diameter, cirkularitet, och bildformat efter BSA laddning i sek. Dessa data är consistent med tidigare rapporter om inkapsling av läkemedel med användning av sek. 7,10
För att kvantifiera mängden av inkapslat BSA, BSA heras från 5 mg BSA-laddade SECS, och data presenteras i tabell 1. Data indikerar 0,170 ± 0,01 g BSA lastning per gram SECS. Sammantaget SEM, DIPA, CLSM, och kvantifiering av BSA genom spektrografisk analys bekräftar lyckad inkapsling av BSA i L. clavatum sekunder och SEC morfologiska stabilitet.
Figur 1. Strömlinjeformad Extraction Process för L. clavatum Sporopollenin Exine Kapslar (SECS). (A) Obehandlade sporer. (B) Spore avfettning med användning av en återloppskokande set-up vid 50 ° C under 6 h. (C) Lösningsmedel filtrering och samla ion av avfettade sporer. (D) Torkning av avfettade sporer vid rumstemperatur. (E) Spore acidolys i PTFE-kolv med användning av 85% (volym / volym) fosforsyra vid 70 ° C under 30 h. (F) Syra filtrering med användning av vakuumfiltrering set-up. (G) SEC tvätt med hjälp av en serie av vatten, syra, bas, och lösningsmedel tvättsteg. (H) SEC torkning med hjälp av vakuumugn vid 60 ° C och ett mbar vakuum under 10 timmar. (i) Intakt, ren och torkades sek som slutprodukt. (J) Blandning av sECS och BSA-lösning. (K) Homogenisering av sECS och BSA-lösning. (L) Vakuum lastning av BSA i sECS. (M) BSA-laddade sECS. klicka här att se en större version av denna siffra.
54.768 / 54768fig2.jpg "/>
Figur 2. Svepelektronmikroskopanalys av L. clavatum Sporer under olika skeden av Pre-syrabehandling. (A) Obehandlade sporer visar sporoplasmic cellulära organeller och biomolekyler. (B) Aceton behandlade sporer visar sönderdelade sporoplasmic innehåll. (C) & (D) Alkali behandlade sporer som visar avlägsnande av sporoplasmic innehåll och rynkig inre cellulosa intine skiktet. Anpassad från 41 och används med tillstånd från vetenskapliga rapporter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Svepelektronmikroskopanalys av L. clavatum Sporer under olika skeden av syraBehandling 5-30 h (A - D). Respektive 5, 10, 20, och 30 tim syrabehandlade sporer som visar intakt yttre mikro och ren inre hålrum. Anpassad från 41 och används med tillstånd från vetenskapliga rapporter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Proteinhalten i sporer och Sporopollenin Exine kapslar (sek). Proteinhalten efter olika stadier av behandling. Data som representeras är ett genomsnitt av trippelmätningar med standardavvikelsen (n = 3). Anpassad från 41 och används med tillstånd från vetenskapliga rapporter. Klicka här för att se en större version of denna figur.
Figur 5. Dynamisk Imaging partikelanalys (DIPA) av sporer och Sporopollenin Exine kapslar (sek) i olika skeden av behandling kolumner (A - C). Är respektive före syrabehandling, syrabehandling, och intakta Sek. Tomter är representativa diagram över SEC diameter, cirkularitet, bildförhållande och kant lutning. Anpassad från 41 och används med tillstånd från vetenskapliga rapporter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Svepelektronmikroskopi (SEM) och Dynamisk Imaging Partikelanalys (DIPA) av 30 h Acidolysis endast Sporopollenin Exine kapslar (sek). (A) sekunder visar intakt yttre mikro och ren inre hålrum. (B) Representativa grafer över SEC diameter, cirkularitet, och proportioner. Anpassad från 41 och används med tillstånd från vetenskapliga rapporter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) Analys av Sporopollenin Exine kapslar (sek) före och efter behandling och BSA inkapsling. Den första raden visar obehandlade sporer visar sporoplasmic cellorganell och biomolekyler autofluorescens. Den andra raden visar 30 tim acidolys endast sekunder med en tom inre hålrum. Den tredje raden visar FITC-BSA laddadi 30 tim acidolys endast sekunder. (Skala barer är 10 mikrometer). Anpassad från 41 och används med tillstånd från vetenskapliga rapporter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Svepelektronmikroskopi (SEM) och Dynamic Imaging partikelanalys (DIPA) Karakterisering av BSA-laddade Sporopollenin Exine kapslar (sek). (A) SEM bilder av BSA-laddade sekunder. (B) Representativa diagram av BSA-laddade SEC diameter, cirkularitet, bildförhållande och kant lutning. Anpassad från 41 och används med tillstånd från vetenskapliga rapporter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Inkapsling bovinserumalbumin (BSA) i obehandlade sporer och SECS. Volym BSA-lösning som används för lastning per 150 mg parti "obehandlade sporer" eller "Sek". Data som representeras är ett genomsnitt av trefaldiga satser med standardavvikelsen (n = 3). Anpassad från 41 och används med tillstånd från vetenskapliga rapporter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta arbete, en systematisk analys av SEC extraktion från L. clavatum sporer presenteras och denna rapport visar att det är möjligt att framställa kapslar med högre kvalitet och samtidigt uppnå en betydande effektivisering av befintlig vanligt förekommande protokoll. 11 I motsats till det nuvarande protokollet kräver en hög processtemperatur (180 ° C) och en lång process varaktighet (7 dagar), 11 nuvarande SEC utvinning bearbetning optimering var främst inriktad på att minska temperaturen och varaktigheten av acidolys steg.
De avfettning och alkaliska behandlingar ger minimal avlägsnande av sporoplasmic material från sporer. Men acidolys från 5 h till 120 h bort maximibeloppet för sporoplasmic material. Resultaten indikerade att den totala varaktigheten och temperaturen bearbetning kunde drastiskt minskas från konventionella tekniker, 11 och att endast 30 h i måttlig temperatur (70° C) fosforsyra förutsatt de optimala kvalitetskapslar. Också, utöver 30 h acidolys, visade det sig att den SECS började spräcka och en signifikant ökning av partikelfragment observerades, vilket tyder på att ett helt parti av SECS kan uppvisar en minskning av den totala strukturella integriteten. Dessutom bör det noteras att L. clavatum anses innefatta förhållandevis robust sporopollenin, 2 och att de särskilda processbetingelser som är involverade i detta protokoll, såsom syrakoncentration, temperatur och / eller hydrolys varaktighet, kan behöva justeras för andra pollenarter.
Det visade sig att produktionen av sek genom acidolys enbart med hjälp av fosforsyra (85% v / v) under 30 h ger upphov till rena och intakta sekunder. 41 Data bekräftar att acidolys är det avgörande steget i SEC produktion. Slutligen har de syra endast secs används för inkapsling av BSA och en hög grad av belastning observerades. Lastningen wsom uppnås med tillämpning av ett vakuum, varvid inre SEC hålighet trycket ändras till kraftfullt dra BSA lösning i de tomma kapslar. Nanokanaler (dia 15 -. 20 nm), som tidigare har identifierats i de exine väggarna i L. clavatum, 7 låt lösningen att komma in i den stora inre kaviteten. Efter laddning, var kapslarna tvättades och torkades i en frystork för att ge ett friflytande pulver.
Storlek enhetlighet och morfologiska egenskaper är viktiga faktorer för att utvärdera kvaliteten på en framgångsrik inkapslingsmaterial. Den observerade storlek enhetlighet och intakta morfologi av BSA-laddade sekunder bekräftat potentialen användningen av acidolys endast behandlas sekunder för mikroinkapslingsapplikationer.
Dessa resultat är viktiga för storskalig industriell produktion av Sek och för att stimulera ett större intresse för de potentiella tillämpningar av sekunder i mikroinkapsling av läkemedel,proteiner, peptider, kosttillskott, nutraceuticals och kosmetika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lycopodium clavatum spores (s-type) | Sigma | 19108-500G-F | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153-50G | |
| FITC-conjugated BSA | Sigma | A9771-250MG | |
| Phosphoric acid (85% w/v) | Sigma | 438081-2.5L | |
| Hydrochloric acid | Sigma | V800202 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881-1KG | |
| Acetone | Sigma | V800022 | |
| Ethanol | AcME | C000356 | |
| Deionized water | Millipore purified water | ||
| Qualitative filter paper (grade No. 1, cotton cellulose) | |||
| Polystyrene microspheres (50 ± 1 µm) | Thermoscientific (CA, USA) | 4250A | |
| Vectashield | Vector labs (CA, USA) | H-1000 | |
| Sticky-slides, D 263 M Schott glass, No.1.5H (170 μm, 25 mm x 75 mm) unsterile glass slide | Ibidi GmbH (Munich, Germany) | 10812 | |
| Commercial Lycopodium SECs (L-type) | Polysciences, Inc. (PA, USA) | 16867-1 | |
| Heating plates | IKA, Germany | ||
| Scanning electron microscope | Jeol, Japan | JFC-1600 | |
| Elemental analyzer | Elementar, Germany | VarioEL III | |
| FlowCam: The benchtop system | Fluid Imaging Technologies, USA | FlowCamVS | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss, Germany | LSM710 | |
| Freeze dryer | Labconco, USA | ||
| UV Spectrometer | Boeco, Germany | S220 |
References
- Paunov, V. N., Mackenzie, G., Stoyanov, S. D. Sporopollenin micro-reactors for in-situ preparation, encapsulation and targeted delivery of active components. J. Mater. Chem. 17 (7), 609-612 (2007).
- Barrier, S. Physical and chemical properties of sporopollenin exine particles. Doctoral dissertation thesis. , University of Hull. (2008).
- Dosage Form. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. , US 7,608,270 B2 (2009).
- Lorch, M., et al. MRI contrast agent delivery using spore capsules: controlled release in blood plasma. Chem. Comm. (42), 6442-6444 (2009).
- Wakil, A., Mackenzie, G., Diego-Taboada, A., Bell, J. G., Atkin, S. L. Enhanced bioavailability of eicosapentaenoic acid from fish oil after encapsulation within plant spore exines as microcapsules. Lipids. 45 (7), 645-649 (2010).
- Barrier, S., et al. Sporopollenin exines: A novel natural taste masking material. LWT-Food Sci. Technol. 43 (1), 73-76 (2010).
- Barrier, S., et al. Viability of plant spore exine capsules for microencapsulation. J. Mater. Chem. 21 (4), 975-981 (2011).
- Hamad, S. A., Dyab, A. F., Stoyanov, S. D., Paunov, V. N. Encapsulation of living cells into sporopollenin microcapsules. J. Mater. Chem. 21 (44), 18018-18023 (2011).
- Diego-Taboada, A., et al. Sequestration of edible oil from emulsions using new single and double layered microcapsules from plant spores. J. Mater. Chem. 22 (19), 9767-9773 (2012).
- Diego-Taboada, A., et al. Protein free microcapsules obtained from plant spores as a model for drug delivery: Ibuprofen encapsulation, release and taste. Mater. Chem. B. 1 (5), 707-713 (2013).
- Atwe, S. U., Ma, Y., Gill, H. S. Pollen grains for oral vaccination. J. Control. Release. 194, 45-52 (2014).
- Mackenzie, G., Beckett, S., Atkin, S., Diego-Taboada, A., et al. Ch 24. Microencapsulation in the Food Industry: A Practical Implementation Guide. Gaonkar, A. G., et al. , Elsevier. 283-297 (2014).
- Diego-Taboada, A., Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. Hollow Pollen Shells to Enhance Drug Delivery. Pharmaceutics. 6 (1), 80-96 (2014).
- Ma, H., et al. Preparation of a novel rape pollen shell microencapsulation and its use for protein adsorption and pH-controlled release. J. Microencapsul. 31 (7), 667-673 (2014).
- Archibald, S. J., et al. How does iron interact with sporopollenin exine capsules? An X-ray absorption study including microfocus XANES and XRF imaging. J. Mater. Chem. B. 2 (8), 945-959 (2014).
- Southworth, D., et al. Ch 10. Microspores Evolution and Ontogeny: Evolution and Ontogeny. Blackmore, S., et al. , Academic Press. 193-212 (2013).
- Stanley, R. G., Linskens, H. F. Pollen: Biology, Biochemistry, Management. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. 307 (1974).
- Ariizumi, T., Toriyama, K. Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development. Annu. Rev. Plant Biol. 62, 437-460 (2011).
- Mundargi, R. C., et al. Natural Sunflower Pollen as a Drug Delivery Vehicle. Small. 12 (9), 1167-1173 (2015).
- Mundargi, R. C., et al. Lycopodium Spores: A Naturally Manufactured, Superrobust Biomaterial for Drug Delivery. Adv. Funct. Mater. 26 (4), 487-497 (2015).
- Topical Formulations Containing Sporopollenin. US Patent. Beckett, S. T., Atkin, S. L., Mackenzie, G. , WO2007012857A1 (2007).
- Zetzsche, F., Huggler, K. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen I. 1. Lycopodium clavatum L. Liebigs Ann. Chem. 461 (1), 89-109 (1928).
- Zetschke, F., Kaelin, O. Untersuchungen über die membran der sporen und pollen v. 4. Zur autoxydation der sporopollenine. Helv. Chim. Acta. 14 (1), 517-519 (1931).
- Zetzsche, F., Vicari, H. Untersuchungen über die Membran der Sporen und Pollen III. 2. Picea orientalis Pinus silvestris L., Corylus Avellana L. Helv. Chim. Acta. 14 (1), 62-67 (1931).
- Zetzsche, F., Kalt, P., Liechti, J., Ziegler, E. Zur Konstitution des Lycopodium-Sporonins, des Tasmanins und des Lange-Sporonins. XI. Mitteilung über die Membran der Sporen und Pollen. Journal für Praktische Chemie. 148 (9-10), 267-286 (1937).
- Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. Grana. 5 (2), 247-252 (1964).
- Shaw, G., Yeadon, A. Chemical studies on the constitution of some pollen and spore membranes. J. Chem. Soc. C Org. , 16-22 (1966).
- Domìnguez, E., Mercado, J. A., Quesada, M. A., Heredia, A. Pollen sporopollenin: degradation and structural elucidation. Sex. Plant Reprod. 12 (3), 171-178 (1999).
- Mundargi, R. C., Tan, E. L., Seo, J., Cho, N. J. Encapsulation and controlled release formulations of 5-fluorouracil from natural Lycopodium clavatum spores. J. Ind. Eng. Chem. 36, 102-108 (2016).
- Orhan, I., Küpeli, E., Şener, B., Yesilada, E. Appraisal of anti-inflammatory potential of the clubmoss, Lycopodium clavatum L. J. Ethnopharmacol. 109 (1), 146-150 (2007).
- Baytop, T. Therapy with medicinal plants in Turkey. , 2nd, Nobel Tip Kitabevleri Ltd. Istanbul. 334-335 (1999).
- Pathak, S., Banerjee, A., Paul, S., Khuda-Bukhsh, A. R. Protective potentials of a plant extract (Lycopodium clavatum) on mice chronically fed hepato-carcinogens. Indian J. Exp. Biol. 47 (7), 602-607 (2009).
- Ma, X., Gang, D. R.
- Bishayee, K., Chakraborty, D., Ghosh, S., Boujedaini, N., Khuda-Bukhsh, A. R. Lycopodine triggers apoptosis by modulating 5-lipoxygenase, and depolarizing mitochondrial membrane potential in androgen sensitive and refractory prostate cancer cells without modulating p53 activity: signaling cascade and drug-DNA interaction. Eur. J. Pharmacol. 698 (1), 110-121 (2013).
- Durdun, C., Papuc, C., Crivineanu, M., Nicorescu, V. Antioxidant potential of Lycopodium clavatum and Cnicus benedictus hydroethanolic extracts on stressed mice. Scientific Works-University of Agronomical Sciences and Veterinary Medicine, Bucharest Series C, Veterinary Medicine. 57 (3), 61-68 (2011).
- Banerjee, J., Biswas, S., Madhu, N. R., Karmakar, S. R., Biswas, S. J. A better understanding of pharmacological activities and uses of phytochemicals of Lycopodium clavatum: A review. J. Pharmacogn. Phytochem. 3 (1), 207-210 (2014).
- Mundargi, R. C., et al. Extraction of sporopollenin exine capsules from sunflower pollen grains. RSC Adv. 6 (20), 16533-16539 (2016).
- Modeling Polyethylene Fractionation Using the Statistical Associating Fluid Theory. Mathias, P. M., Chen, C. C., Walters, M. Proceedings of 3rd Joint China/USA Chemical Engineering Conference, Beijing, China, , (2000).
- El-Bayaa, A., Badawy, N., Gamal, A., Zidan, I., Mowafy, A. Purification of wet process phosphoric acid by decreasing iron and uranium using white silica sand. J. Hazar. Mater. 190 (1), 324-329 (2011).
- Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants. Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).
- Mundargi, R. C., et al. Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction. Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).
- Smith, B. C. Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy. , CRC press. 182 (2011).
