Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Neuartige wissenschaftliche Durchbrüche, die zu Sprüngen im Verständnis der menschlichen Physiologie führen, gehen oft technologische Fortschritte voraus. Die fluoreszierende optische Kartierung ermöglicht beispielsweise die Untersuchung mehrerer physiologischer Parameter sowohl in Zellen als auch in Geweben. ^1,2 Es hat unser Verständnis dafür, wie die anatomische Struktur mit elektrophysiologischen Funktionen und Funktionsstörungen zusammenhängt, erheblich verbessert. Im Herzen bestehen die natürlichen Schrittmacher- und Leitungssysteme wie der Sinusknoten (SAN) und der atrioventrikuläre Übergang aus Knotenmyozyten, die von den umgebenden Vorhofmyozyten isoliert werden. ^3-5 Eine solche Organisation schafft komplexe dreidimensionale Strukturen mit speziellen elektrischen Eigenschaften. Sowohl der strukturelle als auch der funktionelle Umbau dieser Schrittmacherstrukturen bilden signifikante elektrophysiologische Heterogenitäten. ^6,7 Das Verständnis des Mechanismus, der zugrunde liegt, wie solche Heterogenitäten zu SAN-Dysfunktionen und atrialer Arrhythmogenese führen, wird der klinischen Behandlung dieser Erkrankungen von großem Nutzen sein. Es erfordert eine Technik, um die Ausbreitung elektrischer Signale auf Gewebeebene zu visualisieren, wie z. B. optisches Mapping.

Kürzlich haben sich häufende Beweise den Fortschritt der optischen Kartierung in Studien der atrialen Elektrophysiologie und Pathologie bewiesen. ² Neuartige und rigorose Studien sind jedoch auf die genaue Interpretation der experimentellen Daten angewiesen, deren Gültigkeit und Stabilität auf sorgfältigen Versuchsprotokollen beruhen. Genetisch veränderte Mäuse werden in großem Umfang als Tiermodelle für menschliche Krankheiten wie das Sick-Sinus-Syndrom, Herzschrittmacheranomalien und Vorhofarrhythmien verwendet. ^6,8-11 Somit bietet eine Kombination aus fluoreszierender optischer Kartierung mit transgenen Mausmodellen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung kardialer elektrischer Anomalien, die mit verschiedenen Pathologien verbunden sind. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für die hochauflösende optische Kartierung des Maus-SAN und des Atriums vor. Konkret diskutieren und vergleichen wir verschiedene Farbladeansätze, Zeiteffekte auf das Farbbleichen und die Herzfrequenzstabilität während des Experiments.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Veröffentlichung Nr. 80-23) durchgeführt. Alle Methoden und Protokolle in diesen Studien verwendet wurden von der University of Wisconsin Animal Care und Verwenden Protokoll Ausschuss nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren veröffentlicht von NIH (Veröffentlichung Nr 85-23, überarbeitet 1996) genehmigt. Alle Tiere in dieser Studie verwendeten erhielt humane Pflege im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Herzentfernung und Langendorff-Perfusion

1. Vor der Herzisolierung, warm Tyrode-Lösung auf 37 ° C durch ein Wasserbad und einen Wassermantel verwendet wird.
2. Anesthetize die Maus mit 5% Isofluran / 95% O _2.
3. Stellen Sie sicher, angemessene Höhe der Anästhesie durch den Verlust der Schmerzreflex zu überprüfen.
4. Führen Sie Thorakotomie. Öffnen Sie die Brust durch die Verwendung gekrümmter 5,5 "Mayo Schere und 5,5" Kelly hämostatische fürCEPS ein 1 cm an der Vorderseite des Brustkorbs zu schneid machen.
   1. Schnell extrahieren das Herz aus der Brust (innerhalb von 30 Sekunden). Verwenden Sie 4 "gekrümmten Iris Zange das Lungengewebe zu greifen und die Lunge, Thymus und Herz ausgeschnitten zusammen mit dem Herzbeutel mit 4.3" Iris Schere. Nicht direkt das Herz zu greifen.
   2. Waschen Sie es in oxygeniertem (95% O _2/5% CO _2), konstanter Temperatur (36,8 ± 0,4 ° C) modifizierte Tyrode-Lösung. Verwenden Sie die folgende Lösungszusammensetzung (in mM): 128,2 NaCl, 4,7 KCl, 1,19 NaH ₂ PO _4, 1,05 MgCl _2, 1,3 CaCl _2, 20,0 NaHCO ₃ und 11,1 Glukose (pH 7,35 ± 0,05).
5. Während in der gleichen Lösung getaucht, identifizieren die Lunge, Thymus und Fettgewebe. sezieren sie vorsichtig aus dem Herzen. Verwenden gebogen 3 "Vannas-Tübingen Schere und 4.3" # 5 Pinzette.
6. Dann die Aorta identifizieren und kanülieren es auf einem maßgeschneiderten 21 G Kanüle. Verwenden Sie zwei gekrümmten 4.3 "# 5B Kraftps.
7. gleichzeitig perfundieren nach Kanülierung (durch die Kanüle mit einer Strömungsgeschwindigkeit von ~ 5 ml / min, das auf der Grundlage der Aortendruck eingestellt werden sollte, siehe unten) und superfuse (in dem Bad bei einer Strömungsgeschwindigkeit von ~ 50 ml / min) das Herz mit erwärmtem und Tyrode-Lösung während des gesamten Experiments filtriert. Übergeben Sie die Perfusionslösung durch eine in-line 11 & mgr; m Nylonfilter zur Verstopfung der koronaren Zirkulation verhindern.
8. Verwendung eines Druckwandlers (oder ein Manometer) verbunden ist über ein 3-Wege-Hahn Luer Lock mit dem Perfusionsleitung, überwachen den Aortendruck und halten es zwischen 60 und 80 mmHg. Passen Sie Ihre Geschwindigkeit Perfusion bei Bedarf die Aortendrucks in diesem Bereich zu halten.

2. Optische Kartierung des SAN aus dem Langendorff-perfundierten ganzes Herz

1. Instrumentierung
   1. Legen Sie das Herz horizontal und stecken die Herzspitze an den silikonbeschichteten Boden der Kammer mit 0,1 mm Durchmesser Stifte prevent Strom-induzierte Bewegung während des Experiments. ¹²
   2. Legen Sie eine kleine (0,012 "ID x .005") Silikonschlauch in den linken Ventrikel (LV) über die Lungenvenen, die linken Vorhofs (LA) und die Mitralklappe (MV). Befestigen Sie das Rohr durch ein Seidenfaden (4-0) mit dem klingender Bindegewebe.
   3. Positionieren Sie das Herz mit seiner hinteren Seite nach oben (Abbildung 1A, linkes Feld).
   4. Pin der Kante des RA Anhängsel (RAA) mit dem Silizium Boden der Kammer unter Verwendung von 0,1 mm Durchmesser minutien Pins. Stellen Sie das Niveau, um die hintere Fläche des RA flach zu machen und ermöglichen es der Kamera Fokusebene befinden. Dies wird optischen Messungen aus der maximalen Fläche des Atriums ermöglichen.
   5. Noose superior (SVC) und inferior (IVC) Hohlvene durch einen Seidenfaden (4-0), strecken und stecken Sie das andere Ende des Fadens auf dem Boden einer silikonbeschichteten Kammer (siehe 3A). Stellen Sie sicher, dass die Nähte nicht blockieren dieoptische Sehfeld.
   6. Legen Sie die maßgeschneiderte Stimulationselektrode, die auf dem Rand des RAA. Elektroden herzustellen, zu verwenden Silizium 0,25 mm Durchmesser Silberdrähte mit 0,5 mm Abstand zwischen den Elektroden und frei von Silizium für eine Länge von 1 mm an der Stimulations Ende beschichtet. Dann werden zwei EKG-12 mm-Nadel legen (29-Gauge) monopolaren Elektroden in der Nähe der Basis des rechten und linken Ventrikels. Platzieren Sie den Boden EKG-Elektrode in der Nähe der Spitze der Ventrikel.
2. Die Färbung
   1. Da beide Fluoreszenzfarbstoffe und elektromechanische Entkupplungsgleise blebbistatin lichtempfindlich sind, führen alle Verfahren unten in einem dunklen Raum beschrieben. Erste spannungsempfindlichen Farbstoff RH-237 oder Di-4-ANNEPS als Stammlösung, 1,25 mg / ml in Dimethylsulfoxid (2,5 mM) herzustellen, aliquoten es (30 & mgr; l pro Stück) und speichern Sie die Aliquots bei -20 ° C.
   2. Verdünnen 5-10 ul Farbstoff-Stammlösung in 1 ml erwärmt (37 ° C) Tyrode-Lösung und dann spritzen sie in die Koronarperfusion Linieüber einen Zeitraum von 5-7 min ein Inline-Luer-Injektionsanschluss verwenden.
   3. Bereiten Sie blebbistatin als Stammlösung (2 mg / ml in Dimethylsulfoxid, 6,8 mM) im Voraus und lagern bei 4 ° C.
   4. Nach 20 min Stabilisierung, 0,5 ml erwärmter (37 ° C) blebbistatin im Perfusat und 0,1 ml blebbistatin in 1 ml erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung verdünnt. Dann spritzen in die Koronarperfusion Linie über einen Zeitraum von 5-7 min unter Verwendung eines in-line Luer Injektionsöffnung.

3. Optische Kartierung des SAN aus dem isolierten Atrial Vorbereitung

1. Instrumentierung
   1. Für die isolierten Vorhof Vorbereitung, zu isolieren und das Herz kanülieren wie in den Schritten 1.1-1.5 für Ganz Herz Vorbereitung oben beschrieben.
   2. Präparieren Sie die Ventrikel weg von der vorderen Seite. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 1 für weitere Einzelheiten.
   3. Öffnen Sie die RA durch Schneiden durch die tricuspid vaLVE (TV) entlang der TV-SVC-Achse. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 2 für weitere Einzelheiten.
   4. Schneiden Sie den medialen Teil des Crista terminalis die RAA zu öffnen. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 3.
   5. Öffnen Sie die vordere atriale freie Wand durch einen Schnitt von der Mittellinie des vorigen Schnitt # 3 an den Rand des rechten unteren Ecke des RAA Durchführung, glätten und stecken die atriale freie Wand auf dem Boden eines silikonbeschichteten Kammer. Siehe die Richtung , die durch den hohlen Pfeil in 1A gezeigt ist , schneiden # 4. Bewahren Sie einen Rand von ventrikulären Gewebe für Pinning die Vorbereitung Schäden an den Vorhöfen zu verhindern.
   6. In ähnlicher Weise offen LA durch entlang der MV-oberen Ecke des LA Anhängsel (LAA) durch den MV zu schneiden.
   7. Zum Öffnen des LAA, aus der Mitte des geöffneten LAA geschnitten, durch die vordere atriale freie Wand, bis in der Nähe eines mittleren Rand des LAA.
   8. Öffnen Sie die vordere atriale freie Wand aloin die gleiche Richtung ng, dann abflachen und an der Unterseite eines Sylgard beschichtet Kammer fixieren.
   9. entfernen teilweise die interatrial septalen Gewebe. Dadurch wird eine Streuung des optischen Signals von Gewebe zu reduzieren, die nicht im Fokus ist. Daher sind sowohl die LA und RA sowie die SAN und atrioventrikuläre Übergang (AVJ) zugänglich sind , in dieser Zubereitung (1B).
   10. Heben die Endzubereitung von etwa 0,5 mm von der Unterseite des Silizium-beschichteten Kammer auf, um zu ermöglichen Superfusions sowohl epikardialen und endokardialen Oberflächen.
   11. Superfuse die Herstellung mit erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung bei einer konstanten Rate von ~ 12 ml / min für eine gezielte Strömung in der Nähe der SVC und ~ 30 ml / min für ein Bad Superfusions.
   12. Legen Sie die maßgeschneiderte Stimulations Ag / AgCl ₂ Elektrode (0,25 mm Durchmesser) am Rande des seziert RAA. Dann werden zwei EKG-12 mm-Nadel legen (29G) Elektroden (monopolare) in der Nähe des RAA und LAA sind. Legen Sie den Boden EKG wählenritt in der Nähe des AVJ.
2. Die Färbung
   1. Durchführen einer direkten Anwendung der spannungsempfindlichen Farbstoff (RH-237 oder di-4-ANNEPS). Hierzu 1-2 ul der Farbstoffstammlösung in 1 mm erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung verdünnt und lösen sich langsam die verdünnte Farbstoff auf der Oberfläche der Zubereitung durch eine 1 mm Pipette.
   2. Alternativ führen atrial Färbung mit dem spannungsempfindlichen Farbstoff durch eine koronare Perfusion des Langendorff perfundierten Herzen ähnlich der oben für die Vollherz Zubereitung beschrieben (Schritte 2.2.1-2.2.2).
      1. Nach der Koronarperfusion Färbung, isolieren die atriale Zubereitung wie beschrieben. Führen Färbung zusätzliche Oberfläche, wenn eine zufriedenstellende Fluoreszenzniveau zu erreichen benötigt. Schnellvorhof Isolation bleichen den Farbstoff nicht und wirkt sich nicht auf die Qualität der Färbung.
   3. Immobilisieren der Präparation mit dem elektromechanischen Entkoppler, blebbistatin. Verdünnen Sie 3-5 ul blebbistatin Stammlösung im wärmten (37 ° C) Tyrode-Lösung und lassen Sie langsam die verdünnte blebbistatin auf der Oberfläche der Zubereitung und der umgebenden Lösung. Da blebbistatin wurde Licht lichtempfindlich, ^13,14 Vermeiden Sie lange Aussetzung während der Herstellung und Färbung gezeigt werden.
   4. Führen Sie zusätzliche blebbistatin Anwendung so viel wie nötig Kontraktion zu unterdrücken. Normalerweise können bis zu 3 zusätzliche Anwendungen (3-5 & mgr; l pro jede Anwendung) kann die Bewegungsartefakt ausreichend, um genau zu rekonstruieren, SAN und Vorhofaktivierung zu unterdrücken.
   5. Fügen Sie weitere 0,5 ml erwärmt blebbistatin im Perfusat. Während dieser Prozedur unterbrechen die Superfusions für 30 sec die Farbstoff / blebbistatin zu färben das Vorhofgewebe zu ermöglichen.

4. Optische Mapping einrichten

HINWEIS:. Eine detaillierte Beschreibung des optischen Abbildungssystems wird an anderer Stelle ¹² vorgesehen ist

1. Verwenden Sie eine Kamera mit einem Temporal Auflösung von 2000 Bildern / s oder höher, und eine Reihe von Kondensorlinsen räumlichen Auflösung von 100 & mgr; m / Pixel oder höher zu erreichen. Dies ist erforderlich, SAN-Aktivierung und Vermehrung intranodal zu rekonstruieren.
2. Um Bewegungsartefakte aus der vibrierenden Lösung, fix ein kleines Deckglas auf der Oberfläche der Lösung über das Herz / isolierte atriale Vorbereitung reduzieren.
3. Verwenden Sie Anregungslicht (520 ± 45 nm Wellenlänge), die durch einen Konstantstrom, Low-Noise-Halogenlampe. Richten Sie die gefilterten Lichtstrahl auf die Herstellung durch ein flexibles gegabelten Lichtleiter verwendet wird.
4. Filtern Sie die emittierte Fluoreszenz durch ein Langpassfilter (> 715 nm). Sammeln, zu digitalisieren und das erworbene Fluoreszenzsignal auf einem Computer mit Software, die von der Kamera-Herstellers zu speichern.

5. Datenverarbeitung

Hinweis: Das optische Abbildungsdaten gesammelt und als eine Reihe von Matrizen von Fluoreszenzintensität bei verschiedenen Zeitpunkten gespeichert. Jedes Pixel represengen ein Maß für die Fluoreszenzintensität von einer bestimmten Stelle auf der Gewebepräparation zu einem bestimmten Zeitpunkt gesammelt. Die Hintergrundfluoreszenz wird automatisch pro Pixel entfernt zur besseren Visualisierung von Fluoreszenzänderungen durch Membranspannungsänderungen erzeugt zu ermöglichen und umgekehrt mit Aktionspotentiale (APs) von Mikroelektroden-Systeme gemessen entsprechen. Informationen über die verschiedenen Schritte bei der Verarbeitung von optischen Bilddaten, einschließlich Bildsegmentierung, räumliche Filterung, zeitliche Filterung und Basisliniendrift Entfernung, in der Schwerpunktprüfung zur Verfügung gestellt. ¹⁵

1. Manuell oder durch den speziellen Algorithmus (beispielsweise eine Schwellwertbildung oder Kantendetektion) ¹⁵ Gewebegrenzen , um zu bestimmen, Erstellen einer binären Maske von 1 (eingeschlossen Pixel) und 0 (ausgeschlossen Pixel) und die Maske in der Sequenz zu jedem Rahmen. Dieser Prozess erzeugt ein binäres Bild, das Bereiche von Interesse für die weitere Verarbeitung hervorhebt.
2. Zur Verbesserung der Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Optschen Daten, filtern die Signale innerhalb der ausgewählten Bereiche von Interesse. Hierzu verwenden räumliche (dh Mittelung von benachbarten fluoreszierenden Bildpunkte , wie durch einen gewünschten Faltungs bin oder kernel definiert, beispielsweise 3 x 3 oder, für verrauschte Daten, 5 x 5) und / oder zeitliche Filterung (beispielsweise Butterworth, Chebyshev - Typ 1, Chebyshev - Typ 2, Elliptic etc.) (Abbildung 2). Halten Sie die Möglichkeit, gefiltert induzierten Artefakte im Auge, wenn die Daten zu interpretieren. Weitere Informationen finden Sie Bewertung. ¹⁵
3. Entfernen Drift der Basislinie in optischen Aufnahmen bei Bedarf (durch Hochpassfilterung oder Polynomanpassung zum ursprünglichen Signal verwendet wird) und dann normalisiert jedes Pixelsignal von 0 (minimaler Fluoreszenz) bis 1 (maximale Fluoreszenz).
4. Wählen eines Zeitfensters, das die Aktivierungszeiten aller Pixel für einen einzelnen AP Ausbreitungs umfasst. Zuordnen jedes Pixel seine Aktivierungszeit als die Zeit der maximalen Aufwärtshub Derivat (dF / dt _max, wobei F fluorescen istce Intensität). Unter Verwendung aller Pixelaktivierungszeiten, rekonstruieren die isochronen Aktivierungskarte. Jedes isochron zeigt somit die Pixel zur gleichen Zeit aktiviert.
5. Um die AP Dauer (APD) Verbreitungskarte rekonstruieren, für jedes Pixel die Dauer zwischen der Aktivierungszeit und der Zeit auf einer bestimmten Ebene der Repolarisation berechnen (beispielsweise bei 80% der Repolarisation, APD _80). Mit allen APD Pixelwerte, rekonstruieren die APD Verteilung isochronen Karte. Jedes isochron zeigt somit die Pixel mit der gleichen APD.
6. Um die Leitungsgeschwindigkeit für AP Ausbreitung berechnen, passen eine Oberfläche der Vorbereitung auf die Aktivierungszeit-Daten berechnet in 5.4. Verwenden Sie hierzu Polynomfläche Anprobe oder lokale Glättungskerns Oberfläche und dann Geschwindigkeit lokale Leitungsvektoren aus dem Gradienten der angepassten Oberfläche berechnen.
7. Um die Repolarisation Karte zu erstellen, so dass jedes Pixel seine Repolarisation Zeit zuweisen, wie das Maximum der zweiten Ableitung definiert (d ² F / dt2) des optischen Signals am Ende des OAP, oder die Zeit von 90% Repolarisation.

Optische Kartierung des Intact SAN aus dem Langendorff-Herz perfundiert
Ein typisches Beispiel für eine RA Aktivierungskonturkarte für spontane Sinusrhythmus rekonstruiert wird in Figur 3 für eine Langendorff perfundierten Herzen der Maus gezeigt. Die frühe Aktivierungspunkt innerhalb des intercaval Region in der Nähe des SVC befindet , wo die SAN ist anatomisch definiert. 3,16 Zwei RA Aktivierung Umrißkarten bei 1,0 und 0,5 ms Abtastrate erfasst werden in 3B gezeigt.

Um SAN Funktion bewerten wir die SAN - Recovery - Zeit (SANRT) gemessen. 9 Nach dem RAA - Stimulation für mindestens 1 min bei 10 bis 12 Hz, wurde die elektrische Stimulation gestoppt und SANRT wurde als das Zeitintervall zwischen dem letzten erfassten AP berechnet und die erste spontane AP (3C). Die SANRT wurde auf die Herzfrequenz korrigiert (dh SANRT <sub> c) durch die Differenz zwischen dem SANRT Berechnung und der Basis - Zykluslänge. Außerdem wurde die Position des ersten Poststimulationsschrittmacher identifiziert. Für dieses Beispiel war die SANRTc etwa 49 msec.

Isolierte Atria und SAN - Aktivierung
Die Aktivierung der isolierten atrialen Zubereitung während der spontanen Sinusrhythmus ist in 4A gezeigt. Es entstand in der anatomisch definierten SAN in der Nähe der SVC mit einem breiten Wellenfront , die anisotrop in der gesamten RA, mit zwei Vorzugsleitungsrichtungen in der Nähe der oberen und unteren SAN Kanten und kompletten Block in die Septumsrichtung verteilt (in Aktivierungskarten in 4A markiert) . Die Aktivierungskarte auf 1 ms Abtastrate erworben zeigt einen weiten Bereich des frühen Aktivierung. Eine Erhöhung der Abtastrate auf 0,5 msec und 0,3 msec ermöglicht es uns, den genauen Bereich der Vorderschrittmacher Standort zu identifizieren. We beobachtet eine typische, stabile monofocal Position des führenden Schrittmacher Beat-to-Beat , die durch Glasmikroelektroden aus elektrophysiologisch vorher mit dem primären Schrittmacherbereich entsprach 17 und der optischen Abbildungs 8-11,18,19 sowie durch Immunmarkierung für connexin45 und HCN4 . 6,16

Wie zuvor gezeigt, besteht das SAN optische Aktionspotential eines Zweiphasensignals , das zwei getrennte Komponenten: den langsam ansteigenden SAN - Komponente und der schnell ansteigenden Aufwärtshub des atrialen Myokards (atrial Komponente) (4B) 20 Aufgrund der Lichtstreuung. Prozesse, OAP stellt eine gemittelte elektrische Aktivität von mehreren Schichten von Zellen innerhalb des Gewebes entstehen. Die Streu Tiefe und Breite wird durch eine Raumkonstante bestimmt, die durch Lichtstreuung und Absorptionseigenschaften bestimmt und kann auf 1,5-2 mm reichen. Aufgrund der SAN conduction Verzögerung geht die SAN AP immer atriale Aktivität während der physiologischen Aktivierung (4B). Um den Übergang von dem SAN zum Atrium berechnen (dh SAN Leitungszeit, SANCT) verwendeten wir entweder den Zeitpunkt , zu dem das Zweikomponenten - SAN - Signal 50% des SAN Komponentenamplitude erreicht hat , oder den ersten Peak der zwei-peak OAP ersten Ableitung (dF / dt). Die SANCT aus dem Bereich der frühesten SAN Aktivierung der RA betrug ~ 5 msec, ähnlich der von Glasmikroelektroden gemessen.

SAN - Erholzeit
In ähnlicher Weise wurde die SANRT in der isolierten Präparation atrial (4D) gemessen. Hierzu wurden atrial Präparationen bei 12 Hz durch eine Schrittmacherelektrode an der Ecke des RAA für mindestens 1 min. 9 In diesem Beispiel befindet geschrittenen war die SANRTc etwa 34 msec, die mit dem in der Langendorff perfundierten gemessen vergleichbar Herz (3C). Außerdem wurde die Position des ersten Poststimulationsschrittmacher identifiziert.

Herz - Rhythmus und Fluoreszenz - Signal Stabilität über die Zeit
Wenn die Operation und Farbstoffbeladung Verfahren in geeigneter Weise befolgt werden, sollte es keine wesentliche Änderung der physiologischen Eigenschaften des Atriums sein. In Figur 5 stellen wir den Herzrhythmus , gemessen vor und nach dem atrialen Isolierungsverfahren und während der 3 Stunden Perfusion. Keine wesentlichen Änderungen der Herzfrequenz wurden entweder während Atrium Isolierung oder nach Farbstoffbeladung beobachtet.

Obwohl arterielle Färbung eine grßere Menge an Farbstoff erfordern kann, wird die Stabilität des Fluoreszenzsignals in dem SAN Bereich Gewebe besser zu sein, indem dieses Ladeverfahren. In 6 stellen wir Signalintensitätsabfall im Laufe der Zeit sowohl für koronare und Oberflächenfärbung. in t er SAN Gewebe, IC 50 (die die Periode anzeigt , wenn die Signalintensität auf 50% gestorben) beträgt etwa 107 min nach koronarer Färbung, fast doppelt so lang wie die der Oberflächenfärbung.

Abb . 1: Die Isolierung der Maus Atrial Vorbereitung (A) Chirurgische Eingriffe durchgeführt Maus Vorhof Vorbereitung zu isolieren. Die hintere Ansicht des Herzens gezeigt. Alle Schnitte werden durch die gepunkteten roten Linien und gekennzeichnet durch Zahlen in der Reihenfolge durchgeführt gezeigt. Details finden Sie in Text. (B) Die schematische Darstellung der isolierten Maus - atrial Vorbereitung die wichtigsten anatomischen Merkmale zeigt, einschließlich der Trabekelstruktur der linken und rechten Vorhof Anhängsel sowie die Lage des sinuatrialer Knoten (SAN, mit einem grauen Oval beschriftet). Alle Abkürzungen werden in der Figur erläutert.tp_upload / 54773 / 54773fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2:. Roh und verarbeitet Signale aufgezeichnet bei 0,3, 0,5 und 1 ms / Frame - Raw - Signale werden von einem einzigen Pixel gesammelt. Nach 3 x 3 Binning werden die Signale gefiltert durch den Tiefpassbutter Algorithmus. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Whole-heart Optical Mapping des SAN (A) links, Foto einer typischen Präparation für die Abbildung des SAN von der intakten Herzen verwendet.. Das blaue Quadrat zeigt das optische Bereich derAnsicht (6 mm x 6 mm). Rechts, optische Sichtfeld durch die Kamera eingefangen und mit anatomischen Orientierungspunkten überlagert. SVC und IVC: obere und untere Hohlvene; RAA: rechtes Herzohr; RV und LV: rechten und linken Ventrikel; PVs: Lungenvenen. (B) Farbe Kontur Aktivierungskarten mit 1,0 ms erworben (links) und 0,5 ms (rechts) Abtastrate. Auf der rechten Seite jeder Karte, die entsprechende Farbe Zeitskala atriale Aktivierungszeit anzeigt (von der frühesten Aktivierungspunkt in blau dargestellt, auf die neueste Punkt Aktivierung in rot dargestellt) gezeigt. Die früheste atriale Aktivierungsstelle ist mit einem Stern markiert. (C) SAN Erholzeit (SANRT) , gemessen in der Ganz Herz Vorbereitung. Repräsentative Beispiele für die atriale Aktivierung Konturkarten für den letzten Stimulus rekonstruiert (S1) und zum ersten Post-Pacing Vorhofschlag (A1) für die Schläge auf dem repräsentativen OAP Spur oben ausgewählt gezeigt.Seiten der frühesten atriale Aktivierung sind mit einem Stern markiert. BCL:. Grundzykluslänge Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten (SAN) von der endokardialen Oberfläche des isolierten Atria (A) Fotografie einer typischen Maus SAN - Präparat (6 mm x 6 mm) und ihre entsprechenden Aktivierungs Umrißkarten. bei 1,0 ms, 0,5 ms und 0,3 ms Abtastraten erhalten. SAN und ein Nachbarblock Zone sind durch Pfeile dargestellt. Farbzeitskalen zeigen atriale Aktivierungszeit. Das Sternchen zeigt die Position des führenden Schrittmacher. RAA: rechtes Herzohr, SVC und INC: obere und untere Hohlvene, RV: rechte Ventrikel, AVJ: Atrio-ventricul ar Kreuzung, CT: Crista terminalis, IAS: inter-atriale Septum. (B) Mechanismus der Doppel Komponenten des OAP Aufnahme von der Maus SAN-Bereich. Details finden Sie in Text. . (C) OAPs vom Zentrum des SAN - Bereich aufgezeichnet (blau), die früheste atriale Erregungsstelle (grün) und die neuesten RA Aktivierungsstelle (rot) Einschübe: Übergang von Knoten zu Vorhofwellenform mit einer Gesamtleitungszeit gleich 5 msec. Vergleichen Sie es mit der Zeitverzögerung für die gesamte RA Aktivierung gleich 11 ms. (D) SAN Erholzeit (SANRT) in der isolierten Vorhof Vorbereitung gemessen. Repräsentative Beispiele für die atriale Aktivierung Konturkarten für den letzten Stimulus rekonstruiert (S1) und zum ersten Post-Pacing Vorhofschlag (A1) gezeigt. Ein Ort der frühesten atriale Aktivierung wird durch ein Sternchen gekennzeichnet. BCL - Grundzykluslänge.k "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Herz - Rhythmus vor und nach dem Atrial Isolierungsverfahren (A) und während der 3 Stunden Perfusion (B) gemessen. (A) spontane Schlagherzfrequenz angezeigt wird vor und nach der Vorhof Isolierung für zwei Arten von Vorhof Färbung: Oberflächenfärbung nach der Isolierung (keine vorherige Koronar - Färbung) und koronare Färbung vor Vorhof Isolation. (B) spontane Schlagherzrhythmusstabilität auf 3 Stunden Perfusion ist für nicht-gefärbten Vorhofpräparate gezeigt und für Fluoreszenzfarbstoff und blebbistatin gefärbten Vorhofpräparate. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6:. Signalintensität Decay im Laufe der Zeit sind die Intensitäten der Signale von beiden Lademethoden (koronare Belastung in rot angezeigt, und Oberflächenbelastung angegeben in blau) wurden gemessen und aufgetragen über die Zeit. Trabekel (TRAB), Sinusknoten (SAN), rechten Vorhof Anhängsel (RAA) und Koronarsinus (CS): Die Signalintensitäten wurden bei vier typische Stellen in den rechten Vorhof von einer 7 um 7-Pixelbereich gemittelt. IC 50 -Werte wurden dann berechnet und in allen Abklingkurven gekennzeichnet. Die Signalintensität Zerfall von beiden Lademethoden war ähnlich in TRAK und RAA. Die IC 50 der arteriellen Beladung in CS war etwa 20 min länger. Im SAN lag dieser Wert für die arterielle Laden fast zweifach größer im Vergleich zu Flächenbelastung, was zu einer besseren Stabilität des Farbstoffs in den SAN tiss ergab, dass arterielle Lademethoden zeigtue über die Zeit. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.