Summary
Det övergripande målet med detta protokoll är att noggrant anpassa magnetisk resonanstomografi (MRT) bildvolymer med histologi sektioner via skapa anpassade 3D-tryckt hjärnhållare och slicer lådor.
Protocol
Alla djurhantering och förfaranden som beskrivs häri utfördes i enlighet med ett protokoll som godkänts av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke Djurvård och användning kommittén. Hjärnor samlades in från vit silkesapa (Callithrix jacchus) inducerade att utveckla EAE. 11 Hjärnor lagrades i 10% formalin under mellan 3 veckor och ett år efter eutanasi genom transcardial perfusion av 4% paraformaldehyd.
1. Postmortem MRI Förberedelse och Acquisition
- marmoset hjärna
- Förbereda en arbetsstation med bomullsgasväv, ett 50 ml centrifugrör, små spatlar, ~ 30 ml av en fluorerad olja, paraffin, och silkesapa hjärnan.
- Fyll röret med den fluorerade oljan och gasväv till 20 ml-märket. Komprimera gasväv för att avlägsna luftbubblor längs vägen.
- Försiktigt torr formalin från ytan av hjärnan med en pappershandduk. Sätt hjärnan med främre stolpen mot botten avröret. Noggrant säkra hjärnan i röret med hjälp av mer gasbinda runt sidorna för att fixera positionen. Se kompletterande avsnitt 11 för en metod för att skapa en MR hjärna vagga för inställning av ytterligare MRT.
- Fylla resten av röret med gasväv och fluorerad olja. Försiktigt bort luftbubblor längs vägen. Fäst locket och försegla röret med paraffin.
- Markera locket i linje med den interhemispheric spricka. Linda röret i en pappershandduk och sätt in den i spolen med märket topp-center.
- Förvärva 2D snurra eko T2. Parametrarna ges i tabell 1.
- Öppna 10 anatomiska 150 mikron T2-weigted förvärv i Mipav och registrera den 6: e förvärvet.
OBS: Registrering är en optimerad automatisk registrering 3.5D algoritm med 9 frihetsgrader, fönster sinc interpolering, normaliserad korskorrelationskostnadsfunktion, med Powells ringer Brent sökalgoritm. Rotationer samplade från 106; till -10 ° med grova rotationer uppräkning 5 grader och fina rotationer uppräkning 1 °. Då genomsnitt registrerade bilder: hjälpprogram, bild kalkylator-Bulk bilder, Average.
- Mänsklig hjärna
- Separera hjärnan från hjärnstammen med hjälp av ett snitt i höjd med mitthjärnan. 10 halvkloten kan också separeras med ett snitt ner mittlinjen.
- Placera framhjärnan i ett cylindriskt rör med en hemisfärisk kupol i en ände och en pip i den andra änden.
- Fyll röret med en fluorerad olja genom pipen. Avlägsna luftbubblor med hjälp av skonsam sugkraft för ~ 30 minuter genom pipen.
- Förvärva 3D T1-MPRAGE. Parametrarna ges i tabell 1.
2. Extrahera hjärnans yta: Mipav 7,2
- Öppna MRI i den koronala orientering.
- Välj Algoritmer, Transformation verktyg, Trans, Sampla. Välj Användardefinierad storlek och sampla till isotropic voxlar: 0,1 x 0,1 x 0,1 mm. Spara resampled MRT som Brain_MRI_Resampled. Human: Sampla att isotropiska voxlar 0,3 x 0,3 x 0,3 mm.
- Välj Algoritmer, Filter (rumslig), reduktion Nonlinear buller. Använda standardinställningarna, klicka på OK.
- Välj Visar uppslagstabell och klicka på den dubbla tröskel knappen. Dra skjutreglaget på grafen för att täcka hela hjärnan.
- Välj Algoritmer, segmentering, Threshold, Threshold använder min / max. Mata in värdet ligger i det nedre vänstra hörnet av intensitetskurvan (strax under skalan) i "nedre gräns" rutan. Välj "binär" i för typ utgångsbilden och avmarkera "invertera tröskel."
- Välj Algoritmer, morfologiska, Fyll hål. Kontrollera "Process i 2.5D."
- Eftersom detta är en MRI av hela hjärnan, det finns några tomma utrymmet mellan bakhjäman och cortex som behöver fyllas. Mänskliga hjärnan: hoppa över detta steg.
- Använda linje VOI, dra i en förbindelsemellan hindbrain och cortex på båda sidor av hjärnan vid den mest laterala punkt. Fortsätt med detta genom hjärnan.
- Välj VOI, VOI konvertering, Allt för binär mask. Välj Verktyg, Bild räknare. Välj eller från operatören rullgardinsmenyn och välj hjärnan masken. Välj "Främja målbilden typ"
- Välj Algoritmer, morfologiska, Fyll hål. Kontrollera "Process i 2.5D"
- Spara den binära masken som Brain_Model.nii.
- Välj Algoritmer, Utdrag yta (marsch kuber). Välj maskbilden, Spara som Brain_Model.ply.
3. Val av snittlägen: Mipav 7,2
- Identifiera vävnad av intresse eller startposition. Beräkna den avsedda plattjocklek. I silkesapa hjärna, räknar 30 MRI skivor per avsnitt, och 5 MRI skivor per bladgapet, skapar 3 mm sektioner med 0,5 mm blad luckor, vilket resulterar i ~ 3,5 mm plattor. Mänskliga hjärnan: 20 MRI skivor per avsnitt, och fyra MR slglass per bladgapet skapar 6 mm sektioner med 1,2 mm blad luckor, vilket resulterar i ~ 7,2 mm plattor.
- Vid platsen för den första bladgapet, klicka på "box VOI" och sedan rita en ruta över hjärnan. Klicka insidan av rutan för att markera det. Kopiera och klistra in konturen för varje MRI skiva motsvarar bladgapet.
- Hoppa framåt med antalet MRI skivor som motsvarar snittjockleken och kopiera och klistra in kontur som motsvarar nästa bladgapet. Upprepa denna process genom hjärnan.
- Välj VOI, VOI Konvertering, Allt för binär mask. Spara som Blade_Gaps.nii.
- Välj Algoritmer, Extract Surface (marsch kuber), mask bild, Blade_Gaps.ply.
4. Skapa MRI Blade Karta: Mipav 7,2
- Öppna Brain_MRI_Resampled och Blade_Gaps.nii bilder.
- Med Blade_Gaps.nii bilden vald väljer Verktyg, Bild Math. Välj Främja bildtyp och föröka sig.Ange 10.000 som värdet.
- Välj Verktyg, Bild Calculator. Välj Lägg till och välj sedan Brain_MRI_Resampled bild från bildlistrutan. Välj Främja målbilden typ.
- Spara bilden som Brain_BladeMap.nii.
- Genom att klicka på Triplanar uppfattning kan de platser där hjärnan kommer att skivade ses i tre ortogonala vyer.
5. Importera hjärna och Blade Gap Ytor: Netfabb Professional
- Välj del, Lägg del. Välj filerna Brain_Model.ply och Blade_Gaps.ply
- Välj hjärnan och klicka på reparation läge. Reparation läge:
- Klicka på knappen skal val, och klicka sedan på hjärnan.
- Klicka på knappen växla val att välja andra maskor. Klicka på Ta bort för att ta bort de andra maskor.
- Klicka på Verkställ Reparation och ta bort den gamla delen.
- Högerklicka på hjärnan. Välj drag. Klicka påursprung knappen till. Registrera XYZ parametrar som visas. Dessa parametrar översättnings behövs för att bibehålla bladpositionering inrättades Mipav. Klicka på Översätt. stäng sedan fönstret. (Klicka inte på översätter mer än en gång. Det kommer att översätta igen med samma parametrar.)
- Välj Blade_Gaps modell. Högerklicka på sidan och välj Flytta. Ange XYZ värden som registrerats tidigare i XYZ parametrar rutor. Klicka nu Översätt och stänga fönstret.
- Välj Brain_Model modell och klicka på reparation läge. Reparation läge:
- Klicka på knappen skal val, och klicka sedan på hjärnan.
- Högerklicka och välj Smooth trianglar. Ange 4-5 iterationer. Ta Förhindra volymkrympning. Mänskliga hjärnan: 1-2 iterationer.
- Högerklicka och välj sedan Förminska Trianglar. Ange 200000 i målet triangel räkna och klicka Utför.
- Klicka på Automatisk reparation, Standard reparation. Klicka sedan på Verkställ Reparation
- Högerklicka, Byt namn. Byt namn på den utjämnade hjärnan som Smoothed_Brain_Model.
- Välj Smoothed_Brain_Model. Högerklicka, export, STL.
6. Redigering Brain konturer: Meshmixer
- Importera Smoothed_Brain_Model in Meshmixer.
- Använd skulptera och markeringsverktygen för att göra justeringar nätet. Redigeringar inkluderar:
- Använd Sculpting verktyg Robust slät. Jämna det område som motsvarar linjen vois. Mänskliga hjärnan: hoppa över detta steg.
- Jämna till ytan av barken som kommer vara vänd nedåt i lådan.
- Släta ut små divots som kan ha skapats i ingrepp och redigeringsprocessen.
- Välj Analys, inspektör, Autorepair alla.
- Exportera Smoothed_Brain_Model som Smoothed_Edited_Brain_Model.
7. Skapa hjärnan Slicer Box: Netfabb Professional
- Välj del, Lägg del. Välj file Smoothed_Edited_Brain_Model.
- Välj del, Lägg del. Välj sedan STL-fil Brain Slicer Parts_Marmoset och klicka på Öppna. Mänskliga hjärnan: Brain Slicer Parts_Human (Supplemental kodfiler).
- Högerklicka på sidan och välj Extended, snäckor delar. Välj varje del för sig och högerklicka för att byta namn på dem. (Om du klickar på ögat bredvid ett objekt döljer det eller gör det synligt.) Byt namn på stora rutan Main, den lilla rutan Sub, och skär rutan Box_Cutout, Hexagon form Blade_Holder_Main, den lilla platt låda Mikrotom Blade, och halvt röret objekt Cradle. Mänskliga hjärnan: ingen Blade_Holder_Main, Mikrotom Blade, eller vagga.
- Göm huvud, Sub, Blade, Blade_Holder_Main, Mikrotom Blade, och Cradle och använda shift-select för att markera alla sex och Box_Cutout. Endast den Box_Cutout och Smoothed_Edited_Brain_Model ska vara synliga, men Smoothed_Edited_Brain_Model bör inte väljas.
- Klicka och dra valda delar för att justera rutan position i förhållande till hjärnan.
- Placera hjärnan i mitten av lådan. Postion hjärnan tillräckligt djupt i rutan till vara tätt gripas, men inte alltför djupt för att skapa överhäng som förhindrar korrekt placering.
- En gång placerad, kan hjärnan rutan kontur testas för överhäng. Välj Box_Cutout och Smoothed_Edited_Brain_Model. Välj Boolean Operation.
- Klicka på Smoothed_Edited_Brain_Model att slå röd.
- Välj Boolean subtraktion, och tillämpningen av de beräkningar.
- Kontrollera hjärnan rutan för överhäng som skulle förhindra hjärnvävnad från att på ett säkert sätt placeras i lådan. Om dessa överhäng är närvarande, justera hjärnan så det är mindre djupt inne i lådan. Om hjärnan är vid det önskade djupet och överhängär närvarande, se kompletterande avsnitt 10 för en lösning för att ta bort överhängen.
- Välj Blade_Gaps modell. Högerklicka, välj Flytta. Anteckna läget Z-värdet och stäng sedan fönstret. Detta kommer att vara fallet för de mest bakre bladgapet.
- Välj Blade STL som kom från hjärnan Slicer delar. Högerklicka, välj Flytta.
- Välj Absolut översättning. Ange Z-värde från 7,8. För x- och y-värden anger motsvarande värdet från den aktuella positionen parameterrutorna
- Välj STL Blade. Högerklicka, klicka Duplicera.
- Kontrollera Ordna delar. Ange det totala antalet blad i det totala antalet. Ange samma nummer i Z räkna rutan. Ange plattan tjocklek i Z-gap. Klicka på Duplicera. Om plattan tjocklek varierades, kommer bladen att behöva placeras enskilt. Duplicera varje nytt blad från föregående (flyttar från bakre till främre)med z gap lika med snittjocklek för den delen.
- Placera mikrotomen Blade delar på exakt samma intervall som bladen i skärorganet genom att upprepa steg 7,9 och 7,10 för Mikrotom Blade. Mänskliga hjärnan: hoppa över detta steg.
- Välj Mikrotom Blade tillsammans med Blade_Holder_Main del och välj Boolean Operation.
- Markera alla blad i Mikrotom Blade för att markera dem rött. Klicka på Boolean subtraktion, och tillämpningen av de beräkningar.
- Välj Reparera läge. Utför en utökad reparation. Välj tillämpa reparera och ta bort den gamla delen.
- Byt namn på en del bladhållaren. Exportera del som STL.
- Shift-select Smoothed_Edited_Brain_Model, alla Blade modeller som skapats i föregående steg, och under och Main. Klicka på boolesk operation.
- Gör alla delar utom huvud red av siglecting dem och klicka på pilen under den gröna rutan för att flytta dem till rött.
- Välj Boolean subtraktion och välj sedan tillämpa beräkningar.
- Klicka på reparation läge. Reparation läge:
- Markera kryssrutan för överhäng och vassa spetsar. Dessa kan jämnas i Netfabb eller Meshmixer.
- Klicka på Automatisk reparation utökad reparation. Applicera sedan reparation och ta bort den gamla delen
- Högerklicka på den reparerade hjärnan rutan och döp om den Brain Slicer Box. Export som en STL.
8. Skriva hjärnan Slicer Box på Ultimaker 2
- Marmoset Brain: Cura
- Importera Brain Slicer Box till Cura.
- Välj Rotera och dra cirkeln för att rotera lådan så det är platt på sängen.
- Justera utskriftsinställningarna: 0,1 mm tjockt lager upplösning, 50% fyllnadsdensitet, Raft.
- Välj Spara verktygsbanan till SD-kort. (Tryckt tid ~ 12 timmar.)
- Import Bladhållare itill Cura och rotera det så att spåren är på sidorna och hexagon ansikte är i XZ eller YZ-planet.
- Duplicera objektet.
- Justera utskriftsinställningarna: 0,2 mm tjockt lager upplösning, 20% fyllnadsdensitet, brädden.
- Välj Spara verktygsbanan till SD-kort. (Tryckt tid ~ 3 h)
- Human Brain: Cura
- Importera Brain Slicer Box till Cura och rotera som i 8.1.2.
- Justera utskriftsinställningar: 0,2 mm tjockt lager upplösning, 30-35% fyllnadsdensitet, Raft.
- Välj Spara verktygsbanan till SD-kort. (Tryckt tid ~ 70 h för enstaka halvklotet rutan.)
- På Ultimaker 2
- Applicera ett tunt lager av limstift lim att bygga platta.
- Sätt in SD-kortet. Välj ut och välj delen.
9. Skär hjärnan
- marmoset hjärna
- Förbered en arbetsstation med den fasta hjärnan, hjärnan slicer, två bladhållare, Eggen blad, 1 ml fluorolja, flat pincett, skyddshandskar och bädda kassetter.
- Placera nya Eggen bladen i spåren på bladhållarna. Se till den fasade kanten på varje blad är vänd i samma riktning. Skyddshandskar vid hantering av mikrotomen blad.
- Ta bort hjärnan från formalin och försiktigt torka.
- Placera hjärnan i skivaren. Några droppar av fluorerad olja kan appliceras på hjärnan och slicer för att möjliggöra enkel positionering. Se till att hjärnan är stadigt på plats.
- Placera knivhållarna med bladen i motsvarande blad slots.
- Tryck ned knivhållarna stadigt och tillämpa långsam tryckbalansen att skära igenom hjärnan.
- Ta bort varje platta, en i taget, med början från den främre delen av hjärnan. Det hjälper till att avlägsna mikrotomen bladet framför en platta innan du tar bort plattan själv. Ägna stor uppmärksamhet åt den främre / bakre orientering varje platta.
- Ta bilder av den främre end bakre ytan hos varje platta. De bakre plattor kommer sannolikt att innehålla separata delar, så var uppmärksam på orienteringen av bitarna för inbäddning. Placera varje platta i en inbäddning kassett och sätta dem alla i en 10% formalinlösning.
- Mänsklig hjärna
- Noggrant testa passning av hjärnan i rutan.
- Skiva hjärnan börjar från ena änden med hjälp av en vinklad snitt, långsamt men bestämt skivning. Skär hjärnan genom varje blad gap.
- Ta bort varje platta i taget, mycket uppmärksamma på antalet och främre / bakre orientering varje platta.
- Ta bilder av den främre och bakre ytan av varje platta. Placera plattor i förseglade 10% formalin påsar. Vävnad block kommer att skäras från plattor och placeras i kassetter för inbäddning.
10. Ta bort Överhäng i Brain Box (Kompletterande avsnitt)
- Dra ut skivor: Meshmixer
- Importera Smoothed_Edited_Brain_Model.
- Välj Redigera Gör skivor. I Make skivor:
- Välj Stacked 3D, Z anger 1-2 mm tjocklek. Klicka Compute. När skivorna laddas klickar du på Acceptera.
- Välj 1 eller 2 skivor med stora omkrets nära botten av hjärnbarken. Dessa skivor bör vara lägre än under rutan.
- Exportera var och en av dessa skivor som Brain_Slice_ #.
- Utvidgat skivor upp för att ta bort överhäng: Netfabb Professional
- Importera Brain_Slice_ # skivor.
- Duplicera varje Brain_Slice_ # (avmarkera ordna delar om markerat).
- Högerklicka på en kopia av varje Brain_Slice_ # och välj Skala.
- Uncheck Fast skalningsfaktorn. Skala sedan upp hjärnan skiva i Y-riktningen, så att det kommer att nå samma nivå som den nedre delen av underrutan.
- Byta namn på dessa skivor Brain_Slice_Big_ #.
- Kontrollera Y läget of original Brain_Slice_ # genom att högerklicka på en del och välja drag. Anteckna Y-positionen för var och en av de ursprungliga Brain_Slice_ # skivor.
- Utför beräkningen: Brain_Slice_ # [y-position] - (Brain_Slice_Big_ # [y storlek] - Brain_Slice _ # [y storlek])
- Välj varje Brain_Slice_Big_ # individuellt, högerklicka och välj flytta.
- Ange det värde som beräknats från 10.2.6 i Y översättningsparameterrutan. För X och Z översättningsparametrar, mata in värdena i den aktuella positionen parameterrutorna. Välj Absolute Translation. Klicka på Översätt och stänga fönstret.
OBS! Brain_Slice_Big_ # skivor kommer att dras tillsammans med hjärnan och bladen när du gör lådan.
- Ange det värde som beräknats från 10.2.6 i Y översättningsparameterrutan. För X och Z översättningsparametrar, mata in värdena i den aktuella positionen parameterrutorna. Välj Absolute Translation. Klicka på Översätt och stänga fönstret.
11. Marmoset Brain MRI Cradle för ytterligare skanning
- Skapa hjärnan MRI Cradle
- Se till att den övre ytan av CrADLE är på samma höjd som Box_Cutout. Djupet och ställning i hjärnan i vaggan bör ställas in på samma sätt som det är för skivaren.
- Shift-Välj för att välja den Smoothed_Edited_Brain_Model och Cradle.
- Välj boolesk operation. Välj hjärnan för att markera den röd, välj Boolean subtraktion. Applicera sedan beräkningarna. (Välj även Brain_Slice_Big_ # skivor om tillämpligt.)
- Ange reparation läge för att avlägsna eventuella vassa spetsar i vaggan kontur som gjorts tidigare för skivaren. Välj Utökad reparation. Applicera reparation, och ta bort den gamla delen.
- Högerklicka för att byta namn på en del MRI Brain Cradle. Välj Export, STL.
- Skriva vaggan: Cura
- Importera MRI Brain Cradle till Cura och vrid den så att den plana delen med hjärnan utklipp är vänd uppåt.
- Justera utskriftsinställningarna: 0,1 mm tjockt lager upplösning, 100% fyllningsdensitet, Raft. <li> Välj Spara verktygsbanan till SD-kort. (Tryckt tid ~ 10 h)
- Skriv på Ultimaker 2 som beskrivs i 8.3.
- Försiktigt torr formalin från ytan av hjärnan med en pappershandduk.
- Placera hjärnan i vaggan såsom beskrivits för slicer.
- Skjut hjärnan och vagga i 50 ml centrifugrör. Fyll den till brädden med fluorerade olja.
- Tryck försiktigt på röret för att tillåta luftbubblor att fly från hjärnan. Sätt Cap in i den infällda av röret lock för att förhindra luftbubblor från att bildas där. Fäst locket och försegla röret med paraffin.
- Placera röret in i spolen så som tidigare beskrivits. 3D T2 * parametrar ges i tabell 1.
- Öppna 18 anatomiska 100 mikron T2 * -viktade förvärv i Mipav och registrera den 10: e förvärvet. Registreringsparametrar är desamma som i 1.1.7. Genomsnitt registrerade bilder: Utilities, bild kalkylator-Bulk bilder, Normal.
Representative Results
Arbetsflödet med denna metod sammanfattas i Figur 1. När hjärnan skivas, en visuell jämförelse mellan MR-bilder och bilder av ytliga ytorna på skivorna visar en god orientering match över flera plattor (Figur 2). Efter plattorna är inbäddade i paraffin, de sektioneras på en mikrotom och färgas. En mer noggrann jämförelse mellan den höga upplösningen obduktion MRI och de färgade histologi avsnitt visar en korrekt och konsekvent match över alla strukturer i silkesapa hjärnan (Figur 3).
I denna djurmodell av MS, djuren utveckla vita substansen lesioner spridda över hela cerebrala vit substans. Dessa skador kan upptäckas icke-invasivt genom att utföra MRI. Figur 4 visar förmågan hos denna teknik för att belysa den patologiska substratet av MRT-fynd. Små skador upptäckts på in vivo MRI kanspåras på både obduktion MRI och histologi. Såsom visas i de inlägg, är demyelinisering inom de lesioner en av huvudkomponenterna som driver MR-signalen förändring (hyperintensitet jämfört med omgivande vävnad). Histologi och döden MRI kan också visa skador missade på in vivo MRI (Figur 4).
Figur 1. Arbetsflöde för att skapa en silkesapa hjärna slicer rutan. Hjärnan är fixerad med formalin (A1) och en T2-viktad MRT förvärvas med isotropa voxlar av 150 fim per kant (A2). Bilderna bearbetas och tröskel att skapa en binär mask (A3). Ytan är sedan återges i 3D-modellering programvara (A4). Ett booleskt subtraktion mellan en skivare mall och hjärnan modellen skapar en digital modell av hjärnan skivare (B1). Hjärnan skivare rutan skrivs ut på en 3D-skrivare (B2). Hjärnan placeras sedan fast i skivaren rutan förskärning (B3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Från vänster till höger: In vivo MRI, obduktions MRI, och platta vävnads fotografi. Skivningsplan upprättades på grundval av obduktionen MR (B) och visuellt jämfört med motsvarande in vivo MRI skiva (A). Hjärnan skars sedan, och de resulterande plattorna befanns vara konsekvent (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Högupplöst obduktion MRI och histologiavsnitt matchning. Plattor inbäddades i paraffin, skars med en mikrotom i 4 | j, m sektioner och färgades med snabb blå och kresylviolett (B). Snitten sedan visuellt matchas med 100 | j, m T2 * viktade MRI baserat på hjärnstrukturer (A). Mer information om att förvärva den här bilden är i den kompletterande delen av protokollet och Tabell 1. hjärnstrukturer: (1) röd pil = inre kapseln, blå pil = tvärförbindelser i hjärnan; (2) röd pil = putamen, blå pil = optisk kanalen; (3) röd pil = caudatus, blå pil = hippocampus; (4) röd pil = corpus callosum, blå pil = cerebral akvedukt; (5) röd pil = sämre colliculi, blå pil = pyramidbanan. Den streckade rutan i B1 anger ett segment där, antingen under hjärnan skärning eller paraffininbäddning, orsakat ett fel en lätt vridning kring Y-axeln, vilket leder till obalans mellan den främre kommissuren till vänster. Klicka här för att se enstörre version av denna siffra.
Figur 4. Tracking lesioner från in vivo MRI till histologi avsnitt. In vivo MRI visade inga övertygande bevis för onormal hyperintensitet signal att föreslå lesioner i antingen optisk vägarna (A1). Emellertid visar den höga upplösningen postmortem MRI tydliga hyper intensiva linjer i båda optiska skrifter (A2). Den snabba blå / kresylviolett fläck av en 4 um histologi avsnitt visar att de hyper områden ses på ex vivo MR är demyelinerade (A3). I cerebral vita substansen, visar in vivo MRI subtila hyperintensitet bilateralt (B1, förstorad i inläggningar). De hyper områden är mer uppenbart på den högupplösta döden MRI (B2). LFB fläck av en 4 um histologi avsnitt visar att dessa områden demyelinerade (B3). Efter jämförelse med baslinjen in vivo MRI och en hemotoxylin-och-eosin fläck, var den högra sidan bestäms att vara en anatomisk abnormitet, inte en demyelinerad skada. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande kodfiler. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl: Klicka här för att ladda ner filen. Brain_Slicer_Parts_Human.stl: Klicka här för att ladda ner filen. Cap_Insert.stl: Klicka här för att ladda ner filen.
Discussion
Det protokoll som beskrivs här möjliggör en noggrann jämförelse mellan MRI och histologi avsnitt. Protokollet skall lämnas i ett enhetligt format som kan tillämpas på hjärnan hos människor eller små djur, såsom silkesapor eller gnagare. Skillnader som är specifika för stor (människa) och små (icke-mänskliga primater och gnagare) hjärnor markeras och i den medföljande videon och siffror vi visa att de i silkesapa. Även om tillvägagångssättet är okomplicerad, kräver metoden många steg samt användning av flera typer av programvara. Dessutom har flera frågor som kan påverka riktigheten i denna metod är viktigt att nämna.
Bildkvaliteten på den in vivo MRI är en viktig faktor. För att minimera skillnaden i bildupplösningen mellan MRI och digitaliserade histologiska bilder bör minsta möjliga MRI voxelstorlek användas. Detta koncept gäller även bildkvaliteten hos döden MRI. Medan den ökadeförvärvstiden i döden MRI tillåter mycket högre bildupplösning, preparatet kan införa bildartefakter såsom brännsignal avhopp i samband med luftbubblor. Dessa artefakter kan skymma områden av vävnad samt påverka dess kontur. Dessutom dimensioner vävnad på döden MRT är sannolikt att påverkas av fixeringsprocessen och varaktighet. Medan in vivo till ex vivo MR match kan vara nära approximeras genom att använda anatomiska landmärken i skiva geometri inställning under förvärv, skulle en icke-linjär registrering fortfarande vara nödvändigt för att uppnå en högre grad av noggrannhet i matchande dessa två MRI-bilder.
Utformningen av hjärnan hållaren och slicer är också ett avgörande steg. I skapandet av digital modell av hjärnan, är en utjämningsalgoritm appliceras som något förstorar modellen i förhållande till den fasta hjärnan. Detta möjliggör enkel införing av hjärnan i hållaren och skivare och minskar skarpa kanter i hållaren &# 39; s kontur. Men om modellen är för stor (t ex, med mer än 5%), hjärnan kan röra sig under postmortem MRI och / eller snittning. En annan viktig punkt är att anpassa utformningen av hjärnan modellen så att lillhjärnan är korrekt placerad inuti 3D tryckta objektet. Detta kan vara särskilt utmanande när lillhjärnan har skadats under hjärnan extraktion vid obduktion.
Vid utskrift hjärnan skivare och hållare, måste typen av 3D-skrivare också väljas med omsorg. Vissa multi-jet skrivare kräver efterbearbetning med hjälp av en ugn för att avlägsna stödmaterial. Även dessa skrivare kan producera föremål som är vattentäta och relativt mer hållbara än skrivbordet smält nedfall modellering (FDM) skrivare, att uppvärmningsprocessen ta stöd kan något tänja rutan, skapa blad luckor som inte är helt vinkelrät mot hjärnan kontur.
Hjärnan sektionering processen är en annan avgörande steg. Före skärning the hela hjärnan i plattor, är det viktigt att se till att hjärnan sitter tätt inne i hjärnan slicer: det bör inte finnas någon rörelse när ett lätt tryck appliceras på hjärnan. Detta kommer att göra det möjligt för bladen att skära igenom hjärnan på den exakta platsen bestäms av utredarna. En kontinuerlig, balanserat tryck bör tillämpas på både bladhållarna vid sågning. Beroende på skärpan av bladen och styvheten hos vävnaden, kan en liten tvärgående skärrörelse vara fördelaktigt för att upprätthålla plana snittytor.
Den paraffin inbäddning process kan också vara en källa till felaktig inriktning mellan MRI och histologi. Om plattan vävnaden inte sitter plant mot kassetten under inbäddning processen, kommer det att finnas en lutning mellan skärplanet av mikrotomen och ytan plats på plattan. Detta kommer att kräva att skära oanvändbara sektioner för att hitta en plan yta där all vävnad exponeras. Ett sätt att korrigera för lutningenär genom att ändra vinkeln på visualiseringsplanet på ytan med hög isotropa upplösning postmortem MRI. Detta är dock nästan omöjligt att utföra på in vivo MRI som vanligtvis förvärvas med anisotropisk upplösning (typiskt tjocka coronal skivor).
Slutligen kan vävnaden uppleva några deformation under formalin bindningstid och paraffininbäddning (krympning), såväl som under framställningen av bilder (falsning, sprickor, rynkor). En del av dessa deformationer kan korrigeras genom att sektionerna i ett vattenbad 4-5 pm innan du överför på diabilder. Andra deformationer kan delvis lösas genom att utföra deformerbara bild coregistration av histologiska digitaliserade bilderna till obduktion MRI-bilder. Ändå minimera deformationer med noggrann och kunnig praktiken är den mest effektiva metoden för att matcha MRI volymer till histologiska sektioner.
Sammanfattningsvis, den metod som införs här möjliggör investigators att korrekt bedöma den underliggande patologi MRT-fynd. Mer allmänt är det en lovande metod för att identifiera och / eller validera nya MRI biomarkörer för forskningsstudier som är riktade till särskilda patologiska processer, såsom inflammation eller remyelinisering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
| 38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
| Fomblin | Solvay Solexis | ||
| 50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
| Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
| Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
| Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
| Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
| ETOH | |||
| Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
| .75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
| Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
| Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
| Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
| Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
| Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
| Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |
References
- Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
- 't Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
- Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
- Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
- Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
- Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
- McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
- Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
- Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
- Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
- Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).
