Strukturelle Informationen vom Einzelmolekül-FRET-Experimente unter Verwendung des Fast Nano-Positionierungssystem

Summary

Wir stellen den Aufbau und das experimentelle Verfahren vor, um smFRET-Daten aus großen Donor-Akzeptor-Netzwerken mit einem TIRF-Mikroskop zu erhalten. Die Schritt-für-Schritt-Analyse dieser Messungen mit der Bayes'schen Inferenzsoftware Fast-NPS liefert durch die Anwendung angepasster Farbstoffmodelle hochaufgelöste Strukturinformationen.

Abstract

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) kann verwendet werden, um strukturelle Informationen über biomolekulare Komplexe in Echtzeit zu erhalten. Dabei werden mehrere smFRET-Messungen verwendet, um eine unbekannte Farbstoffposition innerhalb eines Proteinkomplexes mittels Trilateration zu lokalisieren. Um quantitative Informationen zu erhalten, verwendet das Nano-Positioning System (NPS) die probabilistische Datenanalyse, um Strukturinformationen aus der Röntgenkristallographie mit Einzelmolekül-Fluoreszenzdaten zu kombinieren, um nicht nur die wahrscheinlichste Position, sondern die vollständige dreidimensionale Wahrscheinlichkeitsverteilung, die als posterior bezeichnet wird, zu berechnen, die die experimentelle Unsicherheit anzeigt. Das Konzept wurde für die Analyse von smFRET-Netzwerken verallgemeinert, die zahlreiche Farbstoffmoleküle enthalten. Die neueste Version von NPS, Fast-NPS, verfügt über einen neuen Algorithmus, der die Bayes'sche Parameterschätzung auf der Grundlage von Markov-Chain-Monte-Carlo-Sampling und paralleler Temperierung verwendet und die Analyse großer smFRET-Netzwerke in vergleichsweise kurzer Zeit ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht Fast-NPS die Berechnung des posterioren Wertes, indem für jeden Farbstoff eines von fünf verschiedenen Modellen ausgewählt wird, die das unterschiedliche räumliche und Orientierungsverhalten der Farbstoffmoleküle aufgrund ihrer lokalen Umgebung berücksichtigen.

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zum Abrufen von smFRET-Daten und zum Anwenden des Fast-NPS. Wir geben eine detaillierte Anleitung für die Erfassung der drei Eingangsparameter von Fast-NPS: die smFRET-Werte, sowie die Quantenausbeute und Anisotropie der Farbstoffmoleküle. In jüngster Zeit wurde der NPS verwendet, um die Architektur eines archaealen offenen Promotor-Komplexes zu verdeutlichen. Diese Daten werden verwendet, um den Einfluss der fünf verschiedenen Farbstoffmodelle auf die posteriore Verteilung zu demonstrieren.

Introduction

die Struktur eines Biomoleküls Bestimmung ist eine wichtige Voraussetzung für ihre Funktion zu verstehen. Zwei etablierte Methoden zur Strukturbestimmung sind Kryo-Elektronenmikroskopie und Röntgenkristallographie ^{1, 2.} Heute bieten beide Methoden hochauflösende Strukturinformationen mit einer Auflösung bis in den Ångström-Ebene. Diese beiden Methoden wurden ausführlich zu erläutern, die die Struktur großer Biomoleküle wie Protein-Komplexe verwendet. Obwohl die bestehenden Methoden ständig in den letzten Jahrzehnten verbessert worden sind, stellt die Komplexität biologischer Strukturen wie vor eine große Herausforderung für die Strukturbiologie, insbesondere dann , wenn große, dynamische und transiente Komplexe ³ untersucht.

Um die Dynamik makromolekularer Komplexe und die Struktur-Funktions-Beziehung insbesondere Einzelmolekülmethoden haben prov zu studierenided nützliche Informationen ^4. Mehrere neue Strategien wurden auf den Erwerb von strukturellen und dynamischen Informationen entwickelt eine orthogonale Ansatz bereitstellt. Beispiele dafür sind hohe Geschwindigkeit AFM ^5, mechanische Manipulation ^6, Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie ⁷ sowie Einzelmolekül - Förster - Resonanzenergietransfer (smFRET) ^{8, 9.} Da schon früh FRET wurde auf der Längenskala von Biomakromolekülen ¹⁰ ein molekulares Lineal, aufgrund der Abstandsabhängigkeit bezeichnet.

Eine besonders interessante Anwendung von smFRET ist die Abstandsinformationen aus smFRET Messungen verwenden zu schließen Struktur ^{11 Informationen, 12, 13, 14, 15} >, ^{16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23.} Aufgrund der hohen Zeitauflösung von smFRET kann die Position der beweglichen Teile einer Proteinstruktur lokalisiert werden. Um jedoch quantitative Informationen aus smFRET Daten wichtig Korrekturparameter über die Farbstoffmoleküle zu extrahieren , müssen während der Messung ²⁴ bestimmt werden. Mit diesen Korrekturfaktoren kann der FRET - Effizienz E _FRET berechnet werden unter Verwendung der Formel

.

wo I _A und I _D Abbildung 2). Die β-factor entfallen Übersprechens, um das Austreten von Donoremission in das Akzeptor-Kanal und wird berechnet durch

wo ich _A und I _'D sind die Fluoreszenzintensitäten des Spenders und das Akzeptor - Molekül nach Foto Bleichen des Akzeptor - Molekül.

Die γ-Faktor korrigiert die Differenz der relativen Detektionswirkungsgrade in den beiden Kanälen sowie die Unterschiede in der Fluoreszenzquantenausbeute des Donors und dem Akzeptor-Farbstoff. Es wird von jedem einzelnen Zeitverlauf berechnet durch

Beachten Sie, dass diese Beschreibung direkte Anregung des Akzeptor-Molekül vernachlässigt, was manchmal wichtig wird und müssten für so gut korrigiert werden. Für diese Korrekturfaktoren bestimmt , ist es sinnvoll , sowohl die Spender als auch als Akzeptor in einem alternierenden Schema ²⁵ , um zwischen den photophysikalischen Veränderungen und Strukturdynamik zu differenzieren zu erregen.

Um quantitative smFRET Effizienz nicht nur erhalten , sondern auch quantitative Strukturinformationen, die Nano-Positioning System (NPS) wurde im Jahr 2008 ²⁶ eingeführt. Der Name wurde aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem satellitengestützten Global Positioning System (GPS) ausgewählt. Der NPS ist ein Hybrid-Technik kombiniert smFRET und Röntgenkristallographie Daten zur Lokalisierung von unbekannten Farbstoff Positionen in Biomakromoleülkomplexen. Die crystal Struktur dient als Referenzrahmen und die smFRET Ergebnisse werden verwendet , um Entfernungsinformationen zwischen einer unbekannten Fluorophor Position (Antenne) und einer von der Kristallstruktur (Satellit) bekannt erhalten. In aufeinanderfolgenden Experimenten wurden die Abstände zwischen der Antenne und mehreren Satelliten gemessen werden und die Position der Antenne mittels einer statistisch rigorose Analyse Schema bestimmt wird basierend auf Bayesian Parameterschätzung. Als Ergebnis wird nicht nur die wahrscheinlichste Position der Antenne berechnet, aber die komplette 3D Unsicherheitsverteilung, der sogenannte posteriore, glaubwürdige Volumina visualisiert. Außerdem wurde NPS für die Analyse von vollständigen smFRET Netze ²⁷ zu ermöglichen erweitert.

Die NPS verwendet wurde eine Reihe von wichtigen Fragen in eukaryotischen Transkription zu lösen, nämlich den Verlauf der vorgeschalteten DNA, die nicht-Matrizen-DNA und dem naszierenden mRNA in der RNA Polymerase II Elongation co^{12 mplex, 28,} auch die Wirkung von Transkriptionsinitiationsfaktoren zeigen ²⁶ und die dynamische Architektur eines offenen Promotorkomplex ^29. Darüber hinaus wurde die NPS verwendet , um die Struktur der Archaea - RNA Polymerase offenen Komplex ³⁰ und insbesondere die Position der Transkriptionsinitiationsfaktor TFE zu erläutern, die als Transkriptions - Elongationsfaktor Spt4 / 5 ³¹ kompetitiv an derselben Stelle bindet.

Seitdem haben sich eine Reihe von smFRET basierend strukturelle Ansätze veröffentlicht ^{15, 18, 21, 23.} Wenn verschiedene smFRET basierten Strukturmethoden vergleicht, wird deutlich, daß die scheinbare Genauigkeit des Verfahrens auf die besondere Wahl der Farbstoff Modellen in hohem Maße abhängig ist. Man sollte beachten, dassFarbstoffmoleküle Verhalten unterschiedlichen räumlichen und Orientierungs abhängig von ihrer lokalen Umgebung aufweisen.

Zu diesem Zweck wurde Schnell NPS ³² eingeführt. Schnell-NPS nutzt eine fortschrittliche Sampling-Algorithmus drastisch die Rechenzeiten zu reduzieren. Des Weiteren, Fast-NPS ermöglicht man eine Strukturanalyse durchzuführen und für jedes Farbstoffmolekül kann der Benutzer aus einem Satz von fünf verschiedenen Farbstoff Modelle wählen, die als nächstes beschrieben wird. Die konservativste Modell, genannt klassisch, geht davon aus, dass der Farbstoff nur eine, sondern unbekannt einnimmt, Stellung. In dieser Position kann das Fluorophor frei drehbar innerhalb eines Kegels, dessen Größe von seiner jeweiligen (zeitabhängige) Fluoreszenzanisotropie bestimmt wird. Die Ausrichtung des Kegels ist nicht bekannt, was zu großen Unsicherheiten führt, wenn gemessen smFRET Effizienzen in Abständen umwandelt. In dieser Hinsicht ist das Modell konservativ, da er auf die kleinste Genauigkeit im Vergleich zu anderen Farbstoffmodus führenls. Nur für sehr kurze Entfernungen sollten die durch das klassische Modell führen zu einer deutlich falsche Positionsbestimmung getroffenen Annahmen. Für typische smFRET Werten wird die richtige Position stets in der vergleichsweise großen glaubhafte umschlossene Volumen.

Da jedoch eine höhere Genauigkeit erwünscht ist, ist es wichtig, alternative Farbstoffmodelle zu entwickeln und zu testen, was die Genauigkeit zu verbessern, könnte helfen. Wenn der Farbstoff sehr viel schneller als seine inhärente Fluoreszenzlebensdauer dreht, die sogenannte ISO - Modells angewendet werden kann. Hier wird der Orientierungsfaktor & kgr; ² (benötigt für die Berechnung der charakteristischen isotropen Förster - Radius ) Auf 2/3 gesetzt. Als Ergebnis sind die berechneten glaubhafte Volumina fast zwei Größenordnungen kleiner als im klassischen Modell ³² im Vergleich zu denen. In dem Fall, dass das Fluorophor in einer Umgebung gefunden wird, die nicht nur schnell reori ermöglichtsentation, sondern zusätzlich schnelle Bewegung über seine gesamte zugängliche Volumen, das meanpos-iso - Modell verwendet werden soll. In diesem Modell nimmt der Farbstoff effektiv nur eine mittlere Position, wobei die räumliche Mittelung ¹⁵ durch ein Polynom Entfernungsumwandlungs berücksichtigt wird. Dieses Modell gilt , wenn beispielsweise die (allgemein hydrophob) Farbstoff an einen hydrophilen Bereich angebracht ist, beispielsweise der DNA. Anwendung des meanpos-iso - Modell führt zu einer weiteren Reduzierung der Größe der glaubwürdige Volumen um einen Faktor von etwa zwei. Jedoch ist ein Farbstoff an ein Protein gebunden könnte reversibel an mehrere hydrophobe Stellen in seiner sterisch zugänglichen Volumen (AV) binden. Ein Fluorophore , die zwischen diesen Bereichen sofort schaltet, aber innerhalb einer Region Bewegung freie Rotation und schnell lokalisiert erfährt man am besten durch die var-meanpos-iso - Modell beschrieben. Für eine ähnliche Situation , in der der Farbstoff nicht frei , die var-meanpos Modell gilt zu drehen. Mehr d etails über diese Modelle finden Sie in unseren kürzlich erschienenen Publikation ^32.

Diese Modelle bieten ein umfangreiches Repertoire an speziell Konto für die verschiedenen Umgebungen ein Farbstoff auftreten können und deren Anwendung optimiert weise seine Lokalisierungsgenauigkeit. In der Fast-NPS kann jedes Farbstoffmolekül an eine bestimmte Position an einem einzelnen Modell zugeordnet werden, so dass FRET-Partner verschiedene Modelle haben dürfen. Dies ermöglicht unbegrenzt und in der Nähe zur Natur Modellierung. Allerdings ist es wichtig, dass eine strenge statistische Tests durchführt, um sicherzustellen, dass das Ergebnis durch das endgültige Modell Kombination erhalten wird, ist immer noch in Übereinstimmung mit den experimentellen Daten. Diese Tests werden in der Fast-NPS-Software enthalten.

Um eine schnelle-NPS auf experimentelle Daten anzuwenden, um die Messung von (nur) drei Eingangsparameter benötigt. Zunächst wird der Farbstoff-Paar spezifische isotropen Förster Radien (/54782/54782eq5.jpg "/>) Ermittelt werden müssen. Daher ist die Quantenausbeute (QY) des Donor-Farbstoff kann die Donor-Fluoreszenz-Emissionsspektren und die Akzeptor-Absorptionsspektren gemessen werden müssen. Können diese Messungen durchgeführt in bulk, ein Standard - Spektrometer und einer Standardfluoreszenzspektrometer verwendet wird . Für jedes Paar der R ₀ wird dann das Freeware PhotochemCAD berechnet und kann in dem NPS - Analyse verwendet werden. Darüber hinaus können die (zeitaufgelöste) Fluoreszenz Anisotropien der Farbstoffmoleküle benötigen erhalten unter Verwendung einer Polarisation (und Zeit) empfindlichen Fluoreszenzspektrometer. Allerdings sind die wichtigsten Eingangsparameter für Fast-NPS sind die smFRET Effizienzen auf einem Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie Einrichtung, wie zum Beispiel ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop (TIRFM) gemessen werden .

Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt - Protokoll für smFRET Daten zu erhalten und die Anwendung Schnell-NPS (Abbildung 1).

Protocol

1. Voraussetzungen und Laborgeräte

HINWEIS: Die Montage der Messkammer ist in Abbildung 3 dargestellt. Das Sandwich-Konstruktion der Messkammer umfasst drei Hauptkomponenten: ein Quarzglas (fused silica) gleiten, ein Dichtungsfilm und einem Deckglas, das die Strömungskammer abdichtet. Die Messkammer wird auf eine kundenspezifische Probenhalter montiert. Die Abmessungen der Probenkammer und dem Metallhalter sind ausgerichtet auf einem Standard-Mikroskopie Quarzglasschieber (76 mm x 26 mm) passen.

1. Cut Quarz Dias Glas mit einem Diamantbohrer (0,75 mm) an den Positionen angegeben in Abbildung 4 verwendet wird . Das Design der Quarzglas gleitet asymmetrisch ist, um zwischen den beiden Seiten jeder Folie zu unterscheiden.
   HINWEIS: Die Quarz Folien können nach der Messung wieder verwendet werden, bis die Oberfläche zerkratzt wird.
2. Um die Kammern montieren, verwenden Sie maßgeschneiderte Halter Metallprobe , wie in Abbildung 5 dargestellt </ Strong>. Die Probenhalter enthalten zwei Fäden (M4), um einen Einlass und einen Auslassschlauch für die Strömungskammer zu verbinden. Darüber hinaus verwenden Gewinde (M3) in die Probenkammer auf die Metallhalterung sowie Gewinde (M3) zur Befestigung des Prismenhalter auf der unteren Hälfte des Metallhalters zu fixieren.
3. Führen Sie die smFRET Messungen an einem Prisma Typ Totalreflexions - Fluoreszenzmikroskop (TIRFM) (Abbildung 6).
   HINWEIS: Die TIRFM verfügt über drei Laser: A grün (532 nm, Nd: YAG-Laser) und einem roten Laser (643 nm, Diodenlaser) zur Anregung von Donor und Akzeptor-Farbstoffmoleküle sowie einen blauen Laser (491 nm , diodengepumpten Festkörperlaser) zum Bleichen der Hintergrund fluoreszierende Verunreinigungen auf der Probenkammer vor der Messung smFRET. Die drei Laserstrahlen räumlich zusammengefasst und können über einen akustooptischen abstimmbaren Filter (AOTF) ausgewählt werden. Das Fluoreszenzlicht durch ein Objektiv hoher Apertur gesammelt wird, aufgeteilt in einen Spender und ein akzeptierenoder Kanal durch einen dichroitischen Spiegel und projiziert auf zwei EM-CCD-Kameras. Die Probenkammer ist mit einem Mikrometer Stufe eine Bewegung in x- und y-Richtung mit zwei Schrittmotoren angebracht. Ein dritter Piezomotor zusammen mit einem IR-Laser verwendet und einen positionsempfindlichen Detektor ein Autofokus-System aufzubauen optimalen Fokus während des gesamten Experiments zu gewährleisten.
   1. Verwenden Sie abwechselnd Laseranregung (ALEX) , wenn die Dynamik in den FRET Zeit Trajektorien ²⁵ beobachtet werden. Solche Dynamik kann entweder durch Konformationsänderungen innerhalb der Moleküle oder durch Schwankungen in Akzeptor Helligkeit und Akzeptor Blinzeln verursacht werden.
      HINWEIS: ALEX ermöglicht die Unterscheidung zwischen diesen beiden möglichen Ursachen und verhindert Fehlinterpretation der dynamischen FRET Trajektorien. Jedoch aus Gründen der Einfachheit wird das Protokollteil auf die Analyse der Filme ohne ALEX genommen beschränkt.
      Achtung: Laser der Klasse 3B in der Einzelmolekül-Fluoreszenz-Setup verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass eine angemessene laser Sicherheitsvorkehrungen nach den örtlichen behördlichen Vorschriften, getroffen worden sind, bevor das System betrieben wird.
4. Führen Sie die Absorptionsmessung zur Bestimmung der Quantenausbeute auf einem UV-VIS-Spektrometer (siehe Materialien und Methoden).
5. Die Messung des Donors Fluoreszenzemissionsspektrum, das Akzeptor-Absorptionsspektrum und der Fluoreszenzanisotropie auf einem Fluoreszenz-Spektrometer (siehe Materialien und Methoden).
6. Bereiten Probenkammern gemäß veröffentlichten Verfahren ^33. Alternativ beschriebene Verfahren in ^[34] verwendet werden kann.
7. Etikett untersuchten Proben mit einem Donor-Akzeptor-Farbstoffmolekül Paar geeignet für smFRET und sicherzustellen, daß es eine Biotin-Einheit für die Immobilisierung auf der Oberfläche der Probenkammer.
   HINWEIS: Um eine unbekannte Antenne Farbstoffposition mit dem Fast-NPS-Software verschiedene Proben Konstrukte benötigt werden, zu lokalisieren. Jedes Konstrukt needs ein Etikett an der unbekannten Antennenfarbstoffposition und ein Etikett an einer Satellitenposition aus der Kristallstruktur bekannt zu haben. Mindestens drei verschiedene Konstrukte mit Farbstoffen auf die Antennenposition angebracht und drei verschiedene Satellitenpositionen sind für genaue Ergebnisse erforderlich. Messungen zwischen Antennen sowie zwischen den Satelliten sind auch nützlich, um die Genauigkeit zu verbessern, jedoch erfordert dieser Austausch von Farbstoffmolekülen, die korrekt in der Analyse eingegeben werden muss.

2. Montage der Strömungskammern in einem Custom-Halter

1. Ziehen Silikonschlauch (0,8 mm ID, 2,4 mm OD) in hohle Registerkarte Schrauben (M4) und schneiden Sie den Schlauch an beiden Enden gerade einen Überhang von 1 cm auf beiden Seiten verlassen durch eine scharfe Rasierklinge. Stellen Sie den Überhang des Schlauchs zu etwa 2 mm auf einer Seite der Lasche Schraube.
2. Montieren Sie die Flusskammer in den Probenhalter in einer Weise, dass die Löcher in der Quarzglas-Schlitten, die Fäden in dem Probenhalter passen. SpannenEintritts- und Austritts Schrauben sanft um sicherzustellen, dass der Einlass und Auslass der Probenkammer noch durchdringbar sind. Leicht anziehen Halter die vier Schrauben des Acrylglases die Position der Strömungskammer zu beheben.
3. Cut Silikonschlauch (0,58 mm ID, 0,96 mm AD) in 20 cm lange Stücke schneiden. Einfügen eines der Stücke mit dem Einlass und dem Auslass Schraube der Messkammer. Schließen Sie die Ein- und Auslaufschlauch durch eine Klammer verwendet wird.
   HINWEIS: Die zusammengesetzten Probenkammern können für bis zu zwei Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.

3. smFRET Messung am TIRF-Mikroskop

1. Verwenden Sie eine Spritze, die die Probenkammer mit 500 & mgr; l PBS zu waschen. Luftblasen aus Eingabe der Probenkammer zu jeder Zeit zu verhindern, indem ein Tröpfchen am Ende der Einlassleitung zu schaffen, bevor zu einer anderen Pufferlösung verändert.
2. Spülen Sie die Probenkammer mit 100 & mgr; l Neutravidin (0,5 mg / ml in PBS) Lösung, Inkubation 15 min bei Raumtemperatur.
3. Waschenaus der Neutravidin Lösung mit 500 & mgr; l PBS.
4. Schrauben Sie die Metallhalterung für das Prisma auf die Probenkammer.
5. Montieren Sie die Probenkammer auf den Mikrometer Stufe des TIRF-Mikroskop. Achten Sie darauf, die Probenkammer horizontal so gerade wie möglich vor dem Ziel zu montieren während des Scannens Prozesses zu vermeiden Defokussierung.
6. Starten Sie die Software, um die EM-CCD-Kameras und die Software zum Steuern der piezo-Motoren der Stufe zu steuern.
7. Stellen Sie den Fokus des Mikroskopobjektivs um den Überlegungen der IR-Laser suchen.
8. Stellen Sie das Prisma (PS991, n = 1,52) auf der Oberseite des Metallprismenhalter. Stellen Sie die seitliche Position des Prismas, um sicherzustellen, dass die Laserstrahlen treffen das Prisma dann einen Klebstoff verwenden und Inkubation mit UV-Licht für 5 min.
   HINWEIS: Montiert Prisma kann durch die Reinigung wiederverwendet werden.
9. In der Kamera-Software klicken Sie auf "Setup-Acquisition" und definieren Sie die folgenden Erfassungsparameter: 100 ms integratIonen-Zeit, 401 Bilder / Film (grün-Kamera), 400 Bilder / Film (rot-Kamera), gewinnen Elektronen-Vervielfacher 225, Vorverstärker Verstärkung 5x und Ausleserate 3 MHz bei 14 Bit.
10. Erstellen Sie einen Ordner auf der lokalen Festplatte für die Messung. Wählen Sie den gewünschten Namen für die Messdateien, zB Jahr-Monat-Tag. In der Software gehen Einstellungen auf die "Auto-Save" Reiter, aktivieren Sie "Auto-Speichern" und das Dateiformat * SIF für Filmerfassung wählen. Wählen Sie den Ordner auf der Festplatte. Verwenden Sie den Namen des Ordners als filestem.
11. Aktivieren Sie die "AutoIncrement" Funktion (Set-Startwert auf 1). Aktivieren Sie die Befestigung eines Betreibers an den Dateinamen. Verwenden Sie "DON" und "ACC" für Spender und Akzeptorkanal sind. Wählen Sie "_" als Trennzeichen.
12. In der Kamera-Software, klicken Sie auf "Video" das Live-Bild der Kamera und Bleichhintergrundfluoreszenz zu starten durch Abtasten der Probenkammer mit maximaler Laserintensität aller drei Laser (comnierten ≈3,000 W / cm ² für 10 s pro Bildfeld).
13. Schalten Sie den blauen Laser. Verringern die Intensität des grünen Laser auf etwa 200 W / cm ² und auf etwa 40 mW / cm ² für den roten Laser , wenn abwechselnde Laseranregung (Alex) verwendet wird.
14. Verdünnen Sie die biotinylierte fluoreszierende Probe auf eine Konzentration von 50 bis 100 pM. Last 100 & mgr; l der Lösung. Die Probe wird auf der Kammeroberfläche immobilisiert bei der Bindung.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht in die Kammer zu überlasten. Benachbarte Moleküle müssen voneinander getrennt werden.
15. Bei Bedarf laden, um die Kammer zusätzlich 100 ul einer 2x konzentrierteren Probe.
16. Verschließen Sie den Ein- und Auslaufschlauch der Messkammer mit Klemmen nach dem Laden abgeschlossen ist.
17. Schalten Sie alle Laser und verwenden Sie die Piezomotoren, um die Strömungskammer zwei Sichtfelder bewegen weiter.
18. In der Kamera-Software klicken Sie auf "Take Signal" Filmaufnahme zu starten und Schalterauf dem Laser zur gleichen Zeit. Stellen Sie sicher, dass mehr als 80% der Moleküle durch das Ende des Films gebleicht werden, indem die Laserleistung eingestellt wird.
19. Wiederholen Sie die Schritte 3.17 und 3.18 für die gesamte vorgebleichten Probenkammerbereich.

4. Erwerb der Transformation Map ( "beadmap")

1. Bereiten Sie eine Flusskammer als 1.1 in den Abschnitten beschrieben, 1,2 und 2.
2. Verwenden Sie Avidinbeschichtete fluoreszierende Multispektraldaten Kügelchen, die Fluoreszenzemission im Donator und dem Akzeptor-Kanal zeigen. Vortex die Aktie für 1 min, dann 50 ul der in 50 & mgr; l ddH ₂ O Vortex erneut für 1 min, beschallen 1-2 min, dann verwirbeln weitere 10 s Lager verdünnen.
3. Führen Sie die Schritte beschrieben für smFRET Messungen (Abschnitt 3,5-3,10).
4. Last 100 & mgr; l (1 Kammervolumen) der 1: 2 verdünnt fluoreszierende Kügelchen in die Strömungskammer. Warten, 10 min für die fluoreszierenden Kügelchen an die Oberfläche zu binden.
5. Verwenden Sie die Aufnahmeparameter in 3.9 aber chanFilm ge Länge 26 (grün-Kamera) und 25 (rot-Kamera) und dem Elektronenvervielfacher Verstärkung 10.
6. Eingestellt , die Intensität des grünen Lasers auf einen Wert von 20 W / cm ^2.
7. Nehmen Sie einen Film auf einem Sichtfeld mit etwa 50 bis 100 Perlen.

5. Die Verarbeitung und Analyse von Daten smFRET

1. Verwenden Sie die benutzerdefinierte geschriebene Software SM FRET für die Analyse der beadmap (siehe Materialien und Methoden) und die erworbenen Filme. Starten Sie das Programm viewPlot1.m.
2. Klicken Sie auf Analyse | Batch-Analyse, deaktivieren Sie die Option "ALEX", wenn es nicht benutzt worden ist. Für die beste Leistung, die Schwelle für Spitzensuche "hoch" wählen. Drücke OK".
3. Wählen Sie "NEIN", wenn, wenn ein beadmap bereits analysiert wurde gefragt. Durchsuchen Sie den Ordner mit dem erworbenen beadmap und wählen Sie die * SIF-Datei (mit einem Doppelklick darauf) enthält. Im nächsten Dialogfenster klicken Sie auf "OK".
   HINWEIS: Wenn ein beadmap wurde bereits in einer früheren Maßnahme analysiertment, wählen Sie in den richtigen Ordner und einen Doppelklick auf die beadmap * .map Datei "JA" hier und wählen Sie die gespeicherte beadmap durch das Surfen. Fahren Sie mit Schritt 5.8.
4. Wählen Sie zwei einzelne Perlen in gegenüberliegenden Ecken des Sichtfeldes positioniert. Die Pixelintensitäten sind farbcodiert, von dunkelblau (niedrige Intensität) bis dunkelrot (hohe Intensität).
5. Klicken Sie auf die Mitte des ersten Wulst. Wenn das Zentrum des Moleküls eindeutig durch die Farbcodierung lokalisiert werden kann, wählen Sie "JA" oder auch "Nein" klicken und ein anderes Molekül Paar wählen.
6. Positionieren Sie den Mauszeiger auf das Pixel zeigt die maximale Intensität und drücken Sie "HALTEN". Wiederholen Sie den Vorgang mit dem zweiten Kanal.
7. Klicken Sie auf das Molekül in der gegenüberliegenden Ecke und wiederholen Sie die Schritte 5.5 und 5.6.
   HINWEIS: Die relative Pixelverschiebung der beiden Kanäle wird im Befehlsfenster und die Transformation der Karte angezeigt wird, automatisch als * .map-Datei in den Ordner mit der beadmap * SIF-Datei gespeichert <./ Li>
8. Um die Spender und Akzeptor-Filme laden (* SIF) für die "Batch-Analyse", zu dem Ordner, alle Filme auswählen, die analysiert werden soll, und klicken Sie auf "OK". Im nächsten Dialogfenster klicken Sie auf "OK".
   HINWEIS: Die Batch-Analyse abgeschlossen ist, wenn die letzte Spur im Fenster beginnt mit Befehl angezeigt "Beendet wird analysiert ...". Die detektierten Moleküle werden in einem neuen Fenster angezeigt werden, die auch die relative Verschiebung des Spenders anzeigt, und die Akzeptor-Kanal aus der Transformationszuordnung bestimmt.
9. So laden Sie die batched Film-Dateien klicken Sie auf Datei | Laden. Deaktivieren Sie die Option "ALEX", wenn es nicht benutzt wurde. Stellen Sie die Smooth auf 10 und klicken Sie auf "OK". Wählen Sie den Ordner mit den * .ttr Dateien und klicken Sie auf "Alle wählen" und "OK" im nächsten Kontextmenü enthält.
10. Wenn die angezeigte Spur , die charakteristischen smFRET Phasen (Abbildung 2) drücken Sie auf die Schaltfläche mit Umschaltfunktion verfügt "Nicht ausgewählt" und erstewählen Sie den Zeitpunkt des Beginns des FRET-Ereignis durch die Zeile mit der Maus-Cursor zu bewegen und die linke Maustaste klicken. Als nächstes wählen den Zeitpunkt des Bleich des Akzeptor-Molekül und schließlich zum Zeitpunkt der Bleiche des Donatormolekül.
11. Im nächsten Fenster wird der FRET-Effizienz in blau dargestellt. die Spur drücken Sie die Schaltfläche "Ja" wählen, andernfalls "Nein". Um wieder Zugriff auf eine Zeitkurve, die die "Zurück" klicken.
12. Wiederholen Sie den Vorgang bis zum letzten Molekül des Films.
13. "| Save File" Nach der Analyse durch einen Klick auf das letzte Molekül in einem Film die ausgewählten Spuren speichern. Speichern Sie die ausgewählten Spuren im selben Ordner wie die * SIF-Dateien.
14. Wiederholen Sie die Schritte 5,10-5,13 für alle erworbenen Filme.
15. Führen Sie das Programm combine_fret_results.m. Wählen Sie den Ordner mit den * .res Dateien enthält, und die alle * .FRETonly_trace Dateien. Speichern Sie die Molekül-weise FRET und rahmenweise FRET-Dateien als MW.dat undFRW.dat, respectively.
    HINWEIS: Die * .dat-Dateien werden als ASCII-Dateien gespeichert. Die FRW.dat Datei enthält sechs Spalten und eine Zeile für jeden FRET-Rahmen. Die sechste Spalte enthält den korrigierten rahmenweise FRET-Effizienz. Die MW.dat Datei enthält 21 Spalten und eine Zeile pro ausgewählt FRET-Molekül. Die dritte Spalte enthält das Molekül weise FRET-Effizienz.

6. Anzeige smFRET Daten in Histogrammen

HINWEIS: Um die mittlere smFRET Effizienz aller aufgezeichneten Daten smFRET die rahmenweise Daten oder die Molekülweise Daten zu extrahieren sind in Histogrammen aufgetragen und analysiert unter Verwendung von Gaußschen passt zu (multiple) Spitzen. Im Folgenden verwendet das Protokoll eine kommerzielle Datenanalyse-Software (siehe Materialliste). Es kann jedoch jede andere verfügbare Software stattdessen verwendet werden.

1. Öffnen Sie eine Datenanalyse-Software (siehe Materialliste). Klicken Sie auf Datei | Import | mehrere ASCII. Wählen Sie den Ordner mit der FRW.dat-Datei enthält. Wählen Sie die Datei und drücken Sie "OK & #34 ;. Akzeptieren Sie die Eingabeoption mit "OK" ohne eine Änderung.
2. Wählen Sie die dritte Spalte C (Y), die die korrigierten FRET Effizienzen der rechten Maustaste auf die Spalte und wählen Sie Zeichnen Statistik | Histogramm. Im Histogramm - Fenster doppelklicken Sie auf die Spalten und deaktivieren Sie "automatische Binning" und wählen Sie die gewünschte bin-Größe, zB 0,05. Auch Anfangs- und Endwert wählen, zum Beispiel -0,025 und 1,025.
3. Wählen Sie die Spalten des Histogramms mit der linken Maustaste auf sie. Dann mit der rechten Maustaste und wählen Sie "Bin Arbeitsblatt gehen". Wählen Sie die "Counts" Spalte mit der linken Maustaste darauf klicken und dann mit der rechten Maustaste und wählen Sie Zeichnen | Spalte / Bar / Pie | Säule.
4. gehen Sie in der Spalte Balkendiagramm zur Analyse | Anpassung | Nonlinear Kurvenanpassung | Öffnen-Dialog. Wählen Sie "Gaussian" unter Function dann weiter mit dem "Parameter" Reiter. Deaktivieren Sie Auto Parameter Initialisierung. Befestigen Sie den Offset-Wert (y0) auf 0 Klicken Sie auf "Anpassen".
   Hinweis: die Anpassungsfunktion sowie das Fitting deSchwänze sind nun in der Spalte Plot angezeigt. Der "xc" Wert gibt das Zentrum der Anpassungsfunktion, das heißt die mittlere FRET - Effizienz, die für die NPS - Software als Eingangsparameter dient.

7. Die Messung der Quantenausbeute

1. Führen Quantenausbeute Bestimmung der relativen Methode ähnlich der von Würth et al beschriebenen Verfahren. ^35, unter Verwendung von Rhodamin - 101 in Ethanol gelöst (QY = 91,5%) als ein Standard.
2. Record Absorptionsspektren bei einem UV-VIS-Spektrometer unter Verwendung eines 80 & mgr; l Volumen in einer Absorptions Küvette von 1 cm Weglänge. Die Absorption bei der Wellenlänge, die zur Fluoreszenzanregung verwendet wird, muss 0,05 ≤ werden.
3. Nehmen Emissionsspektren auf einer Lampe kalibriert betrieben Spektrometer in Photonen-Zählmodus. Führen Sie die Messungen mit Glan-Thompson-Polarisatoren in der Anregung (0 °) und Emission (54,7 °) -Pfad (magic angle Bedingungen) unter Verwendung eines spectr al Bandbreite von etwa 5 nm und 2,5 nm für die Anregung und Emission Monochromator, respectively. Messen Proben nach ihnen zu einer Fluoreszenzküvette mit 3 mm Weglänge kümmert übertragen , die die Zählrate nicht 10 ⁶ s nicht überschreitet ^-1.
   1. Berechnen Quantenausbeute nach

wobei n und n _Std die Brechungsindizes des Lösungsmittels aus der Probe und dem Standard, respectively. f (λ) und f_Std (λ) die Fluoreszenzintensitäten der Probe und der Standard bei der Wellenlänge λ. A (λ _ex) und A ^std (λ _ex) die Absorption der Probe und Referenz bei der Anregungswellenlänge und Φ _std ist die Quantenausbeute des Standards.

le "> 8. Berechnung des isotropen Förster Radius

1. Berechnen Sie den isotropen Förster-Radius ( ) Aus dem Emissionsspektrum des Donor-Molekül, die Quantenausbeute des Donors und der Brechungsindex des Mediums, das Absorptionsspektrum des Akzeptor-Moleküls. Verwenden Sie die Freeware PhotochemCAD für die Berechnung der . Jedoch andere verfügbare Software kann stattdessen ³⁶ verwendet werden.

9. Messung der Anisotropien

1. Bestimmen steady-state Fluoreszenz Anisotropien von Aufzeichnungen von Fluoreszenzspektren mit verschiedenen Anregungs- / Emissions - Polarisator Einstellungen (V / V, V / H, H / V, H / H) ^36.
2. Berechne den G-Faktor, der für die Polarisationsartefakte des Instruments korrigiert, für jede Wellenlänge aus demVerhältnis

und es verwenden, die Anisotropie-Wert für jede Wellenlänge zu berechnen:

wo I _xy zeigt die Intensität für die Anregung Polarisation x und Emissions Polarisation y.

3. Der Mittelwert der Werte über den Emissions Spektralbereich die Steady-State-Fluoreszenzanisotropiemessungen zu berechnen.

10. Installation von Fast-NPS Software

1. Download von UCSF Chimera von http://www.cgl.ucsf.edu/chimera und der Installationsanleitung folgen.
2. Gehen Sie auf die Internetseite des "Institute of Biophysics"an der Universität Ulm: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Laden Sie die aktuelle Version von Fast-NPS und entpacken Sie es in einen Ordner Ihrer Wahl. Öffnen Sie den Unterordner "Redistributable" und installieren Sie das Visual C ++ Redistributable die für das System geeignet ist.

11. Zentrieren der PDB-Datei

1. Öffnen Sie die PDB-Datei (en) von Interesse in Chimera. Wählen Sie alle Atome des hochmolekularen Komplexes und berechnen die Koordinaten des Schwer (Tools | Strukturanalyse | Achsen / Flugzeuge / Zentroide | definieren Schwerpunkt ... | Ok).
2. Öffnen Sie die Antworten Log (Favoriten | Antworten Log) und die Transformation Tool (Extras | Bewegung | Trans Koordinaten). Geben Sie die Koordinaten des Schwer in der Antwort Log in das Textfeld "Shift" des Fensters Transformation Koordinaten angezeigt und ändern Sie das Zeichen für alle zu koordinieren. Drücken Sie auf "Übernehmen" und die Datei mit "Speichern PDB" speichern (Datei | Speichern PDB).

12. Einstellungbis die Position Priors

HINWEIS: Alle Werte sind in Angstrom betrachtet.

1. Starten Sie die Sprache für technische Berechnungen und ändern Sie den aktuellen Ordner in den lokalen Fast-NPS-Ordner. Geben Sie in das Befehlsfenster: FastNPS.
2. Erstellen Sie ein neues Job-Datei im Projektmanager (Projekt | Neu).
3. Richten Sie vor der Position (Tools | Modell Farbstoff vor).
4. Im Panel "vor Grundlagen", um die räumliche Auflösung der Position definieren, bevor durch seinen Wert eingeben (2 wird empfohlen).
5. Ausschließen das Innere des Makromoleküls durch das Kontrollkästchen aktivieren und auf der "Last PDB" klicken. Wählen und laden die zentrierte PDB-Datei, wie in Abschnitt 11 beschrieben.
6. Geben Sie den ungefähren Durchmesser (13 Å wird empfohlen, siehe Diskussion) des Farbstoffs durch seinen Wert eingeben.
7. Geben Sie einen Skelettierung Abstand, dh der Abstand das Farbstoffmolekül in das Makromolekül eindringen kann (2 Å wird empfohlen).
8. In demPanel "maximale Stand der Größe" geben Sie die minimalen und maximalen Koordinaten des vorherigen Position (empfohlen: x in [-150.150], y in [-150.150] und z in [-150.150]).
9. Wenn ein Satellit zu definieren, aktivieren Sie im Panel "Linker" die Koordinaten des Atoms (in der zentrierten PDB-Datei), an dem das Farbstoffmolekül gebunden ist die Checkbox "Befestigung über flexible Linker" im Panel "vor Grundlagen" und geben. Ferner geben die Länge und den Durchmesser des Linkers durch ihre Eingabe von Werten (13 Å und 4,5 Å empfohlen, siehe Diskussion). Im Falle einer Antenne diesen Punkt überspringen.
10. Drücken Sie die Taste "berechnen Volumes".
11. Speichern Sie die Position vor und exportieren es optional zur Visualisierung mit Software wie Chimera.

13. Definieren der Netzwerk-Geometrie

1. Öffnen Sie das definieren Messfenster (Modus | Geometrie bearbeiten).
2. Erstellen Sie einen neuen Farbstoffmolekül durch den Kolben drückenauf "Neu" im Panel "Dyes".
3. Legen Sie seine Fluoreszenzanisotropiemessungen (Abschnitt 9) durch Eingabe eines Wertes und eine Farbstoff Modell im Dropdown-Menü "Dye-Modell" wählen.
4. Drücken Sie die Taste "Laden", wählen Sie die entsprechende Position vor und überprüfen Sie das Kontrollkästchen Aktivieren des Farbstoffs. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Farbstoffe, dh für alle Antennen sowie für alle Satelliten.
5. Nachdem alle Farbstoffe zu schaffen, definieren die Messungen. Erstellen Sie eine neue Messung von "Neu" im Panel "Messungen" klicken.
6. Wählen Sie ihre FRET-Partner in den Dropdown-Menüs "Dye1" und "Farbstoff F2" weiter unten.
7. Geben Sie die smFRET Effizienz mit Fehler und den isotropen Förster Radius dieses Farbstoffpaar.
8. Schließlich überprüfen Sie die Kontrollkästchen Aktivieren der Messung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Messungen.
   HINWEIS: Oft das Netz wird immer komplexer, so dass der Benutzer verwirrt könnten. Um Prevent Fehler, überprüfen Sie das Netzwerk visuell durch den "Check Network" Taste drücken. Die Abbildung zeigt die aktivierten Farbstoffe und zeigt Messungen über Leitungen miteinander verbinden, die FRET-Farbstoffe.

14. Berechnung

1. Öffnen Sie das Berechnungsfenster (Mode | Berechnung).
2. Wenn jeder Farbstoff in dem Netzwerk ein bestimmtes Modell zugewiesen hat, wählen Sie "Benutzerdefiniert" und die Berechnung erfolgt durch "Berechnung" drücken. Um alle Farbstoffe, die in der gleichen Modell haben, wählen Sie eine der fünf Modelle (klassisch, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso und var-meanpos) und fahren weiter.
   HINWEIS: Das Befehlsfenster den Fortschritt der Berechnung anzeigt. Schnell-NPS wird dies mit einem Pop-up-Nachricht, wenn die Berechnung abgeschlossen ist.

15. Visualisierung der Ergebnisse

1. Um die Glaubwürdigkeit Volumina der Farbstoffe zu exportieren, öffnen Sie die Ansicht Ergebnisfenster (Modell | Ergebnisse anzeigen).
2. Export Farbstoffdichten:
   1. Exporteinzeln oder alle gleichzeitig färbt. Um einen einzigen Farbstoff wählen sie im Panel "angezeigt Dyes" und drücken Sie "Export Dichte" zu exportieren. Geben Sie eine Auflösung (2 wird empfohlen) und wählen Sie für den Export einen Dateityp. Auf der rechten Seite ist die Dichte angesehen und einige seiner mathematischen Eigenschaften gezeigt.
   2. Um alle Farbstoffe gleichzeitig drücken "Batch Export" zu exportieren.
3. Öffnen Sie die resultierende Dichte-Dateien in Chimera.

16. Konsistenzprüfung von ausgesuchter Modellkombination

1. Öffnen Sie die Ansicht Ergebnisfenster (Modell | Ergebnisse anzeigen). Wenn in dem Panel "Berechnung Info" das Textfeld "Konsistenz" zeigt einen Wert von weniger als 90% das aktuelle Modell repräsentiert nicht die gemessene smFRET Effizienzen ausreichend und ist damit unvereinbar.
2. Im Falle einer Unstimmigkeit drücken Sie die Taste "Detaillierte Konsistenz". Suchen Sie nach den Messungen, die einen Wert von unter 90% aufweisen. Wenn ein oder mehrere Farbstoffs überwiegend in diesen Messungen beteiligt sind, ihre Modelle sind wahrscheinlich die Inkonsistenz zu verursachen. Betrachten wir verschiedene Farbstoffmodelle für diese Farbstoffe und erneut ausführen, die Fast-NPS-Berechnung.

Results

Transcription ist der erste Schritt in der Genexpression in allen Organismen. In Archaea, Transkription wird durch einen einzelnen RNA-Polymerase (RNAP) durchgeführt. Im Vergleich zu Eukaryoten trägt der Archaea RNAP eine auffallende strukturelle Ähnlichkeit mit ihren eukaryotischen Kollegen während eine einfachere Transkriptionsmaschinerie hat. Somit kann Archaea als Modellsystem verwendet werden, um eukaryotische Transkriptionsinitiations durch RNA-Polymerase II (Pol II) studieren. Vor kurzem hat die gesamte Architektur der Archaea-RNA-Polymerase offenen Komplex wurde von Einzelmolekül-FRET und NPS bestimmt. Die Daten von NPS-Analyse verwendet wurde, ein Modell des gesamten Archaea offenen Promotorkomplex zu bauen, die nützliche Einblicke in den Mechanismus der Initiation der Transkription zur Verfügung stellt.

Um diese Struktur zu verdeutlichen, wurden smFRET Effizienzen zwischen unbekannten Antennenfarbstoffmoleküle gemessen im offenen Promotor com befindetplex und mehrere bekannte Satelliten - Farbstoffmoleküle , die an fünf Referenzstandorte in der RNAP aufgenommen wurden, deren Positionen aus kristallographischen Strukturen bekannt sind (PDB-ID: 2WAQ) ^37. Die Antennenfarbstoffe wurden auf der nicht-Matrizen-DNA, um entweder an verschiedenen Positionen angebracht, TFB, TBP oder TFE. Der komplette Netzwerk in dieser Studie verwendet wurde, bestand aus mehr als 60 gemessenen Abstände.

7 zeigt das Modell des kompletten Archaea offenen Promotorkomplex aus dem NPS - Analyse gebaut. Es umfasst die doppelsträngigen Promotor DNA (hell- und dunkelblau), die RNA-Polymerase (grau) und die Transkriptionsinitiationsfaktoren TBP (lila), TFB (grün) und TFE (gelb). Das Modell ist mit den Ergebnissen aus der NPS-Analyse überlagert, die glaubwürdige Bände, die das klassische Modell (A) berechnet wurden, dem ISO-Modell (B), der meanpos-iso-Modell (C), der var-meanpos-iso-Modell (D) und die var-meanpos Modell (E).

Abbildung 1: Workflow der Erfassung und Verarbeitung der Parameter für die Fast-NPS Berechnung benötigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Beispielhafte Fluoreszenzintensität Zeitspur eines smFRET Ereignis. Die Fluoreszenzintensitäten des Spenders (grün) und dem Akzeptor-Molekül (rot) für die drei charakteristischen Phasen zeigt, nämlich I: smFRET, II: Donor-Fluoreszenz nach Acceptor Photobleaching, III: Hintergrundfluoreszenz nach Spender Photobleaching.g2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Strömungskammer für smFRET Experimente. Die Strömungskammer ist mit Acrylglashalter auf einem angepassten Metallhalterung montiert. Das Sandwich-Konstruktion der Strömungskammer besteht aus einem Quarzglas (fused silica) mit zwei Löchern zur Befestigung gleiten Eintritts- und Austrittsrohr, eine Siegelfolie und Deckglas, das die Strömungskammer schließt. Das Prisma für TIRF-Beleuchtung auf die untere Hälfte der Strömungskammer montiert. Hohl Registerkarte Schrauben stellen die Ein- und Auslässe für die Strömungskammer. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Figur 4: Herstellung des Quarzglasschieber und dem Dichtungsfilm. Mechanisches Ziehen des Schiebers Quarzglas, die die Positionen der Löcher (angegeben in Millimeter). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Mechanische Zeichnung der Strömungskammer. Die Maßnahmen für die Aluminium-Prismenhalter, Acrylglashalter und Aluminium Einbaurahmen sind in Millimeter angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6: Schematische Darstellung der für smFRET Experimente verwendet TIRF - Setup Prisma-Typ ist . Abkürzungen für optische Komponenten: A, Blende; DM, dichroitische Spiegel; F, Emissionsfilter; L, Linse; M, Spiegel; O, Ziel; P, Prisma; PSD, positionsempfindlichen Photodiode; S, Probe; PS, Positioniertischs; T, Teleskop. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7: Simulationsergebnisse der verschiedenen Modellannahmen. Alle Bilder zeigen die Archaea-RNA-Polymerase (PDB-ID: 2WAQ, Ansicht von oben) zusammen mit dem Modell für die Promotor-DNA (tDNA und ntDNA in Blau und Cyan, beziehungsweise), TBP (lila), TFB (grün) und TFE (gelb)in der Archaea öffnen Komplex ^30. Die glaubhafte Volumina werden für die NPS Simulationsergebnisse von (A) das klassische Modell, (B) das ISO - Modell, (C) die meanpos-iso - Modell, (D) das Modell var-meanpos-iso lagert und (E) var -meanpos Modell. Alle Bände sind bei 68% Glaubwürdigkeit gezeigt. Die klassische und die var-meanpos Netzwerke stehen im Einklang mit den smFRET Daten. Im Gegensatz dazu Netzwerken, in denen für alle Farbstoffe die iso, meanpos-iso oder die var-meanpos-iso-Modell wird mit den gemessenen Daten inkonsistent gewählt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Wir präsentieren das Setup und experimentelle Verfahren zur genauen FRET Effizienzen zwischen Farbstoffen gebunden über flexible Linker an Biomakromolekülen, dh Nukleinsäuren und / oder Proteinen bestimmen.

Um präzise Messungen smFRET (Abschnitt 3) zu gewährleisten, ist es wichtig, die Luft aus der Strömungskammer jederzeit während der Messung auszuschließen. Darüber hinaus stellen Sie sicher nicht mit Fluorophore die Strömungskammer zu überlasten. Die Fluorophore müssen klar korrekte Analyse, um sicherzustellen, getrennt werden. Als smFRET Paare, die aus der Analyse ausgeschlossen haben nicht Bleichen des Spenders zeigen werden, stellen Sie sicher, dass> 80% der Moleküle in dem Sichtfeld am Ende des Films gebleicht werden. Zur Berücksichtigung von Inhomogenitäten in der Probe der β-Faktor und der γ-Faktor, die Übersprechen und relative Nachweiseffizienz des Spenders und Akzeptorkanal Korrektur bzw. werden für jede berechnete FRET einzeln koppeln.

Die Kameraeinstellungen (Integrationszeit, Elektronen-Vervielfacher zu gewinnen, in Abschnitt 3.9 beschrieben Vorverstärker Verstärkung und Ausleserate) sollten auf Werte eingestellt werden, um das beste Kompromiss zwischen Signal-Rausch-Verhältnis, Dynamikbereich und Zeitauflösung zu geben. Sie müssen für verschiedene Experimente neu eingestellt werden oder wenn unterschiedliche Hardware verwendet wird. Die Anzahlen von Frames müssen hoch genug sein, um sicherzustellen, dass die meisten der Donatormoleküle bleach innerhalb der Beobachtungszeit.

Für die Messungen auf dem Fluoreszenzspektrometer (§§ 7 bis 9) einen guten Kompromiss zwischen der Signalintensität und der spektralen Auflösung der aufgezeichneten Daten hat zu finden. Zu diesem Zweck sind die Schlitze in der Anregungs- und Emissions Weg des Fluoreszenz-Spektrometer müssen abhängig von dem Gerät verwendet werden, angepasst und die Probenkonzentration.

Darüber hinaus präsentieren wir die Fast-NPS-Analyseverfahren Strukturinformationen von transienten oder dynamischen macrom zu erhaltenMOLEKULARE Komplexe. NPS wurde den Pfad des Nicht-Template-DNA-Strang und die Position der Transkriptionsinitiationsfaktoren bei der archaealen RNA-Polymerase-Komplex offen zu offenbaren aufgetragen. Mit dem Netzwerk von mehr als 60 verschiedenen Entfernungsmessungen haben wir gezeigt, dass Schnell NPS, ausgestattet mit einem neu implementierten Sampling-Engine (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. in Vorbereitung), reduziert die Zeit für die Analyse dieses komplexen smFRET Netzwerk ≈2 Grßenordnungen erforderlich, da ²⁷ zu dem ursprünglichen globalen NPS - Methode verglichen. Die Robustheit des Algorithmus ist in einer Metropole-in-Gibbs-Sampler mit einem parallelen Temperierung Schema kombiniert verwurzelt. Schnell-NPS zeigt exakte Reproduzierbarkeit von Netzwerk - Ergebnisse und steht im Einklang mit den Ergebnissen früherer ³⁰ veröffentlicht.

Mehrere verschiedene Methoden wurden von smFRET Messungen Strukturinformationen zu schließen , veröffentlicht Aiming ¹¹ oben>, ^{12, 13, 14, 15, 16, 17, 18.} Alle diese Ansätze liefern nur eine spezifische Farbstoff-Modell. So Farbstoffe, die nicht erfüllen, die vom jeweiligen Modell getroffenen Annahmen nicht auf falsche Strukturinformationen verwendet oder führen werden. Fast-NPS, im Gegenteil, kann für jedes Farbstoffmolekül ein anderes Modell auszuwählen. Dies hilft, für unterschiedliche konformative Verhalten beider zu berücksichtigen, das Farbstoffmolekül selbst, sowie der Linker für seine Befestigung verwendet. Die lokalen molekularen Umgebung des Farbstoffmoleküls sowie ihre physikalischen Eigenschaften wird bestimmen, welches Modell am besten geeignet ist.

Für den analysierten smFRET Netzwerk des archaeal Initiationskomplex, eine isotrope Annahme für alle Farbstoffmolekülen führt zu einer drastischen Abnahme in die Größe der glaubhafte Volumen als dem klassischen Modell verglichen. In Kombination mit einer dynamischen Position für alle Farbstoffmoleküle im Durchschnitt den Durchschnitt aller glaubhafte Volumengrößen (bei 95%) reduziert sich auf weniger als 0,5 nm ^3. Jedoch sind diese Farbstoffmolekül Zähne nicht mehr mit ihren smFRET Messungen, was darauf hinweist, dass die Annahmen führen zu falschen Strukturinformationen gemacht. Im Gegensatz dazu sind die Seitenzähne im klassischen Modell bestimmt in Übereinstimmung mit den ermittelten smFRET Effizienz.

Da die Annahme von isotropen und / oder dynamische Position für alle Farbstoffe mit durchschnittlich führen zu Inkonsistenzen, Fast-NPS Farbstoffmolekül priors, in dem ermöglicht jeder Farbstoff eine der fünf Modelle zugeordnet werden können. Jedes Modell verwendet das gleiche Volumen zugänglich. Der Algorithmus für die Berechnung der Farbstoff AVs macht mehrere Annahmen. Zunächst wird die Raumform des Fluorophors wird durch eine Kugel angenähert. Somit nimmt ein Durchmesser-Konto in das wid des Fluorophorsth, Höhe und Dicke sollte (§ 12) verwendet werden. Ferner wird der Linker die Form durch einen flexiblen Stab angenähert. Die dargestellten Werte in § 12 wurden für den Farbstoff Alexa 647 über einen 12-C Linker gebunden berechnet. Bis heute ist es nicht möglich, genau eine priori bestimmen, welches Modell ist am besten geeignet, da eine experimentelle Geometrie und damit alle Modelle getestet werden sollte. In der Regel wird man das Modell zu wählen, das die kleinstmögliche Größe posterior ergibt, während noch im Einklang mit den Daten ist. Um zu testen, ob eine Auswahl an Modellen mit den smFRET Daten konsistent sind, berechnen wir sowohl die hintere und die Wahrscheinlichkeit. Konsistenz bedeutet, dass mehr als 90% der Proben aus dem hinteren gesammelt sind innerhalb des 95% Konfidenzintervalls der Wahrscheinlichkeit.

Während es, dass je niedriger die Anisotropie wahr ist, haben je geringer der Abstand Unsicherheit, in einem smFRET Netzwerk geometrische Anordnungen der Farbstoffmoleküle ebenfalls berücksichtigt werden. Somit wird, während representing Farbstoffmoleküle mit einem niedrigen Fluoreszenzanisotropiemessungen mit einem ISO-Modell eine typische erste Wahl ist, stellt der Konsistenzprüfung ein direkteres Mittel für den richtigen Farbstoff Modell auswählen. Die optimale Wahl der Farbstoff-Modelle können zu einer drastischen Erhöhung der Lokalisierungsgenauigkeit führen und zugleich das Netzwerk der Konsistenz mit seinen FRET Daten behalten.

Um es zusammenzufassen, Fast-NPS ermöglicht strukturelle und dynamische Informationen von großer makromolekularer Komplexe zu gewinnen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Strukturmethoden wie Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie diese hochflexible oder transiente Komplexe zur Überwachung ermöglicht und damit unser mechanistisches Verständnis komplexer biologischer Prozesse erheblich zu erweitern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flowchamber preparation
Kundenspezifischer Metall-Probenhalter	selbstgebaute	n/a
Quarzglas-Objektträger, 76  mm x 26  mm	Deckgläser aus technischem Glas	26007
, 60 mm x 24  mm	Marienfeld	101242
Waschmittel, Hellmanex II	Hellma	320.001
Reinstwasser aus Synergy UV	Millipore	2512600
Zepto Plasmareiniger	Diener	n/a
(3-aminopropyl)-triethoxysilan, p.a.	Sigma-Aldrich	A3648
Methoxy-PEG-Succinimidylvalerat, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	MPEG-SVA-5000-1g
biotinyliertes PEG-Succinimidylvalerat, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	BIOTIN-PEG-SVA-5000
Natriumbiocarbonat	Sigma-Aldrich	S5761 Sigma
Natriumcarbonat	Sigma-Aldrich	S2127 Sigma-Aldrich
Dichtungsfolie (Nescofilm)	Fisher Scientific	12981805
Tygon Flexible Silikonschläuche, 0,8  mm ID, 2,4  mm AD	Saint-Gobain Performance Plastics	720958
Fine-Bore Polyethylen Tubing, 0,58 mm ID, 0,96 mm OD (Smiths Medical)	Fisher Scientific	12665497
Neutravidin	Life Technologies	A2666<
Nd:YAG Laser, 532 nm	Newport Spectra-Physics	EXLSR-532-100-CDRH
diodengepumpter Festkörperlaser, 491 nm, Calypso	Cobolt	904010050
Diodenlaser 643 nm, iBeam smart	Toptica	iBEAM-SMART-640-S
, 532 RDC	Chroma	F33-540
dichroitischer Spiegel, 476 RDC	Chroma	F33-476z
akustooptischer abstimmbarer Filter	AA Opto-Elektronische	AOTFnC-VIS
plankonvexe Zylinderlinse, f = 75 mm	Thorlabs	LJ1703L1-A
plankonkav zylindrisch, f = -300  mm	Thorlabs
Prisma, PS 991	Thorlabs	PS991
Fokussierscheibe, f = 75  mm	Thorlabs	LA1608-B
Spritzenpumpe, PHD 2000	Harvard Apparatur	70-2002
2 Schrittmotoren, Z812B	Thorlabs	Z812B
piezoelektrischer Aktuator, PE4	Thorlabs	PE4
IR Diodenlaser	Edmund Optics	CPS808	Teil des Autofokus-Systems
dichroitischer Spiegel, 775 DCXR	Chroma	775 DCXR
Positionsdetektor (PSD), PDP90A	Thorlabs	PDP90A	Teil des Wasserimmersionsobjektivs des Autofokussystems
, Plan Apo 60X WI, NA 1.2	Nikon		MRD07601
dichroitischer Spiegel, 645 DCXR	Chroma	645 DCXR	Teil des
Emissionsweg-Emissionsfilters, 3RD550-510	Omega Optical	3RD550-510	grüner Kanal der Emissionsfilter des Emissionspfads
, 3RD660-760	Omega Optical	3RD660-760	roter Kanal in der EMCCD-Kamera des Emissionspfads
, iXon+ DU897EBV	Andor	AND-20-00032
EMCCD-Kamera, iXon3 DU897D-BV	Andor	AND-20-000141<
Varian 50	Cary		UV-VIS-Spektrometer
Fluorolog2	SPEX		Fluoreszenzspektrometer
Solis (V4.15)	Andor		Steuerungssoftware für die EM-CCD-Kamera
Apt user utility  (V1.022)	Thorlabs		Steuerungssoftware für die Piezomotoren
Norland Optical Adhesive 68	Thorlabs		Kleber
PC-AFN-0.8 Nilrot	Kisker Biotech		avidinbeschichtete fluoreszierende Multispec-Kügelchen
Matlab	Mathworks		technische Rechensprache für custon geschriebene Software
Origin (V9.0)	Originlab		wissenschaftliche Grafik- und Datenanalysesoftware
Hellma 105-202-15-40	Hellma	105-202-15-40	Absorptionsküvette von 1  cm Schichtdicke
Hellma 105-251-15-40	Hellma	105-251-15-40	Fluoreszenzküvette mit 3 mm Schichtdicke