Eine Alternative und Validated Injektionsmethode für den Zugriff auf den subretinalen Raum über A Transcleral dorsalen Zugang

Summary

Subretinale Injektionen sind die gebräuchlichste Technik zur Verabreichung großer therapeutischer Wirkstoffe wie Proteine und viraler Vektoren an Photorezeptoren und das retinale Pigmentepithel. Eine alternative Methode bei Mäusen, die erfolgreich auf den subretinalen Raum mit minimalen Kollateralschäden und schnellen Erholungszeiten abzielt, wird hier beschrieben.

Abstract

Subretinale Injektionen wurden bei Mensch und Nager zu liefern therapeutische Interventionen von Proteinen, viralen Mitteln und Zellen zur Interphoto / subretinalen Fach, das direkte Exposition muss Photorezeptoren und die retinalen Pigmentepithel (RPE) erfolgreich eingesetzt. Subretinale Injektionen von Plasminogen sowie die jüngsten präklinischen und klinischen Studien haben die Sicherheit nachgewiesen und / oder Wirksamkeit von mit fortgeschrittenen Netzhauterkrankungen viralen Vektoren und Stammzellen an Einzelpersonen zu liefern. Mausmodelle von Netzhauterkrankungen, insbesondere erbliche Netzhautdystrophien, sind für diese Therapien zu testen. Die häufigste Injektionsverfahren bei Nagetieren ist klein transcornealen oder transcleral Einschnitte mit einem vorderen Ansatz zur Netzhaut zu verwenden. Mit diesem Ansatz dringt die Injektionsnadel die neurosensorische Netzhaut des zugrunde liegenden RPE und beim Einsetzen stören kann leicht nick die Linse, so dass Linsentrübung und Beeinträchtigung von nicht invasiver imaging. Zugriff auf den subretinalen Raum über einen transcleral vermeidet hinteren Ansatz, diese Probleme: die Nadel durchquert die Sklera etwa 0,5 mm von der Sehnerv, ohne Netzhautpenetration und vermeidet den Glas zu stören. Kollateralschaden ist nicht auf die beschränkt, die mit der Brenn Sclerotomie zugeordnet ist, und die Auswirkungen eines vorübergehenden, seröse Netzhautablösung. Die Einfachheit des Verfahrens minimiert Augenverletzung, sorgt für eine schnelle Netzhaut Wiederanheftung und Erholung, und hat eine niedrige Ausfallrate. Die minimale Schäden an der Netzhaut und RPE ermöglicht eine klare Beurteilung der Wirksamkeit und direkten Auswirkungen der therapeutischen Mittel selbst. Diese Handschrift beschreibt eine neue subretinalen Injektionstechnik, die verwendet werden können virale Vektoren, pharmakologische Mittel zu zielen, Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) -Zellen in den subretinalen Raum in Mäusen, die mit hoher Wirksamkeit, minimale Beschädigung und schnelle Wiederherstellung.

Introduction

Subretinale Injektionen sind das wichtigste Mittel der auf der Netzhaut von Mäusen zellulären und viralen Mittel liefern ihre Auswirkungen auf die Photorezeptoren zu studieren und die zugrunde liegenden RPE ^1,2. Die meisten subretinalen Injektionsprotokolle in Mäusen verwenden eine transcornealen oder eine transcleral Injektionsstelle anterioren zum Äquator (Abbildung 1). Dieser Ansatz kann in inhärenten Kollateralschäden führen , dass nicking und resultierende Trübung der Linse, Störung der Integrität des Glaskörpers, das Eindringen der neurosensorischen Netzhaut und Iris, Netzhautblutungen ^3-9, erhebliche Netzhautablösungen un....

Protocol

Tiere: Wildtyp C57BL / 6J-Mäuse an der Universität von Kalifornien gezüchtet in Los Angeles (UCLA). Alle Tiere wurden zwischen 11 bis 17 Wochen alt, und enthalten männlichen und weiblichen Mäusen. Alle Mäuse wurden in Gruppen gehalten, im 12:12 Hell / Dunkel - Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum gehalten. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der UCLA und der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt.

HINWEIS: Alle Medikamente und injizierbare Mittel sind United States Pharmacopeia (USP) Klasse.

1. Chirurgisc....

Results

Posterioren Ansatz transcleral subretinalen Injektionen wurden auf 31 gesunde Augen von 16 Wildtyp-Mäusen, die mit Injektionen von 0,3 & mgr; l (n = 18), 0,5 ul (n = 8) und 1,0 ul (n = 5) von 0,01% Fluorescein. Ein Auge war von der Injektion ausgeschlossen aufgrund einer vorbestehenden Hornhauttrübung, die strukturelle und funktionelle Analyse verhindert. Jedes injizierten Auge wird in diesem Bericht enthalten. Keine unbeabsichtigte Netzhautablösungen, Einstiche der neurosensorischen.......

Discussion

Subretinale Injektionen sind die Methode der Wahl für die Lieferung von viralen Vektoren und Stammzell-abgeleiteten Therapie für Photorezeptoren und den RPE in der Grundlagenforschung und der klinischen Behandlung zu manipulieren. Bei Patienten werden subretinalen Injektionen typischerweise mit einem vorderen Sclerotomie an der Pars plana, einen hinteren Kern Vitrektomie und das Eindringen der Netzhaut durch die Nadel mit direkter Visualisierung erfolgen. Wie bei den meisten Vitrektomie Verfahren ist es üblich, für die .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Spritze x 1
Hamilton Nadel 33 G, 1.0", 20 Grad, Spitze 3 (Edelstahl 304)	Hamilton	7803-05	Nadeln x 6
Vannas Gebogene Schere	Ted Pella, INC.	1347	5 mm Klinge
22,5 Grad Mikrochirurgie-Messer	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamin
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xylazin
Fluorescein 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0,9% Kochsalzlösung USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9% NaCl
Antibiotische Salbe	Akorn	NDC 17478-235-35	Augenwasser
Umwälzpumpe	Gaymar	TP-500 T/Pumpe	Bestellnummer 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Serie	Kommerzielle
Funduskamera	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Pinzette Typ 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2,5 % Phenylephrin	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Ophthalmic
IMARIS8	Bitplane		Version 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose  2,5%	Goniovisc	AX0401	Methylcellulose
Augentropfen (Spülen)	Bausch & Lomb		Kochsalzlösung
Mikroskop	Zeiss	Stemi 2000	Mikroskop
Lichtquelle	Fostec	P/N 20520	Lichtquelle