Eine Alternative und Validated Injektionsmethode für den Zugriff auf den subretinalen Raum über A Transcleral dorsalen Zugang

Summary

Subretinale Injektionen sind die gebräuchlichste Technik zur Verabreichung großer therapeutischer Wirkstoffe wie Proteine und viraler Vektoren an Photorezeptoren und das retinale Pigmentepithel. Eine alternative Methode bei Mäusen, die erfolgreich auf den subretinalen Raum mit minimalen Kollateralschäden und schnellen Erholungszeiten abzielt, wird hier beschrieben.

Abstract

Subretinale Injektionen wurden bei Mensch und Nager zu liefern therapeutische Interventionen von Proteinen, viralen Mitteln und Zellen zur Interphoto / subretinalen Fach, das direkte Exposition muss Photorezeptoren und die retinalen Pigmentepithel (RPE) erfolgreich eingesetzt. Subretinale Injektionen von Plasminogen sowie die jüngsten präklinischen und klinischen Studien haben die Sicherheit nachgewiesen und / oder Wirksamkeit von mit fortgeschrittenen Netzhauterkrankungen viralen Vektoren und Stammzellen an Einzelpersonen zu liefern. Mausmodelle von Netzhauterkrankungen, insbesondere erbliche Netzhautdystrophien, sind für diese Therapien zu testen. Die häufigste Injektionsverfahren bei Nagetieren ist klein transcornealen oder transcleral Einschnitte mit einem vorderen Ansatz zur Netzhaut zu verwenden. Mit diesem Ansatz dringt die Injektionsnadel die neurosensorische Netzhaut des zugrunde liegenden RPE und beim Einsetzen stören kann leicht nick die Linse, so dass Linsentrübung und Beeinträchtigung von nicht invasiver imaging. Zugriff auf den subretinalen Raum über einen transcleral vermeidet hinteren Ansatz, diese Probleme: die Nadel durchquert die Sklera etwa 0,5 mm von der Sehnerv, ohne Netzhautpenetration und vermeidet den Glas zu stören. Kollateralschaden ist nicht auf die beschränkt, die mit der Brenn Sclerotomie zugeordnet ist, und die Auswirkungen eines vorübergehenden, seröse Netzhautablösung. Die Einfachheit des Verfahrens minimiert Augenverletzung, sorgt für eine schnelle Netzhaut Wiederanheftung und Erholung, und hat eine niedrige Ausfallrate. Die minimale Schäden an der Netzhaut und RPE ermöglicht eine klare Beurteilung der Wirksamkeit und direkten Auswirkungen der therapeutischen Mittel selbst. Diese Handschrift beschreibt eine neue subretinalen Injektionstechnik, die verwendet werden können virale Vektoren, pharmakologische Mittel zu zielen, Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) -Zellen in den subretinalen Raum in Mäusen, die mit hoher Wirksamkeit, minimale Beschädigung und schnelle Wiederherstellung.

Introduction

Subretinale Injektionen sind das wichtigste Mittel der auf der Netzhaut von Mäusen zellulären und viralen Mittel liefern ihre Auswirkungen auf die Photorezeptoren zu studieren und die zugrunde liegenden RPE ^1,2. Die meisten subretinalen Injektionsprotokolle in Mäusen verwenden eine transcornealen oder eine transcleral Injektionsstelle anterioren zum Äquator (Abbildung 1). Dieser Ansatz kann in inhärenten Kollateralschäden führen , dass nicking und resultierende Trübung der Linse, Störung der Integrität des Glaskörpers, das Eindringen der neurosensorischen Netzhaut und Iris, Netzhautblutungen ^3-9, erhebliche Netzhautablösungen und dauerhafte subretinalen Ödem enthält. Experimentelle Manipulationen müssen diese Effekte um ^3,7,10,11 überwinden die Auswirkungen von therapeutischen Interventionen zu bewerten. Diese Studie enthält eine detaillierte Beschreibung und Validierung eines hinteren transcleral Injektionsverfahren, das diese Komplikationen vermeidet, minimiert Trauma und hat eine hohe Erfolgsquote der Unter TargetingRetina-Raum.

Einspritzungen den subretinalen Raum in Mäusen Targeting sind oft sehr schwierig durchzuführen und die meisten Forscher in denen eine hohe Frequenz von Fehlversuchen in dem der Vektor an eine falsche Stelle geliefert wird , oder es gibt signifikante Netzhautschäden, beispielsweise in einer vollständigen Netzhautablösung ^6. Die Anzahl der Augen von der Analyse ausgeschlossen, da der Einspritz Komplikationen typischerweise nicht in Maus-Studien berichtet, aber in unserer eigenen Erfahrungen und in Diskussion mit anderen Forschern, kann die Anzahl von Fehleinspritzungen so hoch wie 50% und variieren abhängig von der Erfahrung und Fähigkeiten der Ermittler, die Injektionen durchführt. Der Erfolg der Injektion wird typischerweise durch direkte Fundusabbildung und / oder optische Kohärenztomographie (OCT) ^7,9 beurteilt. Ein leicht zu beherrschen Verfahren mit hohen Erfolgsraten für subretinalen Injektionen in Mäuse können Experimente zu beschleunigen und die Kosten der präklinischen Studien von tre reduzierenatments für Netzhauterkrankungen, die Hauptursachen für Blindheit in den Vereinigten Staaten sind.

Der hintere, transcleral subretinalen Injektion hier beschriebene Technik ist eine Adaption von klinischen und präklinischen Protokolle ^9,12. Die nicht-invasive diagnostische in injizierten Mäusen Einschätzungen zeigen, mild und stark lokalisierte Schaden und es fehlt ihnen zusätzliche Sicherheiten Linse, Netzhaut und RPE Verletzung. Darüber hinaus mit relativ wenig Übung, ein Experimentator können diese Ergebnisse mit einer hohen Erfolgsquote erreichen (80 - 90% oder mehr), um dadurch die Kosten im Zusammenhang mit solchen Studien verbunden sind, reduziert. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um zelluläre, viralen oder pharmakologischen therapeutischen Interventionen zu Photorezeptoren und / oder RPE in präklinischen Studien zu liefern und zu leicht experimentellen Interventionen zu bewerten.

Protocol

Tiere: Wildtyp C57BL / 6J-Mäuse an der Universität von Kalifornien gezüchtet in Los Angeles (UCLA). Alle Tiere wurden zwischen 11 bis 17 Wochen alt, und enthalten männlichen und weiblichen Mäusen. Alle Mäuse wurden in Gruppen gehalten, im 12:12 Hell / Dunkel - Zyklus mit Futter und Wasser ad libitum gehalten. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der UCLA und der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research durchgeführt.

HINWEIS: Alle Medikamente und injizierbare Mittel sind United States Pharmacopeia (USP) Klasse.

1. Chirurgische Vorbereitung

1. Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 8 mg / kg Xylazin in einer Salzmischung. Verwalten Anästhesie bis zu einer Tiefe, so dass die Maus keinen Zeh Prise oder Hornhaut berühren Reflexe hat.
2. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei 37,0 ° C mit einem zirkulierenden Wasserpolster.
3. Dilate Schüler mit 2,5% Phenylephrin Auge dROPS und trimmen Whiskers Visualisierung zu erleichtern. Whiskers bieten erhebliche sensorischen Input an die Maus daher Whisker sollten nur den Teil, dass die Blöcke übersichtlichen Zugriff auf das Auge, und nicht auf der Basis des Whiskers entfernen trimmen. Unserer Erfahrung nach zeigen Mäuse normale Erholung nach diesem Verfahren. Methyl Auge Nehmen fällt Trockenheit zu verhindern und Anästhesie induzierte transiente Katarakt ¹³ zu minimieren.
4. Sterilisieren Instrumente vor der Operation (dh betadine und Ethanol oder heißen Kügelchen).
5. Bereiten Sie verdünnten Fluorescein (0,01% mit 0,9% Kochsalzlösung) in einer sterilen Umgebung (dh Biosicherheitsschrank) , wenn Visualisierung wird durchgeführt werden (siehe Abschnitt 3 unten).

2. Injektionsstelle Vorbereitung

1. Vorbereitung einer Spritze (beispielsweise 5 & mgr; l - Spritze) mit dem entsprechenden Injektionsvolumen (beispielsweise 0,3 bis 1,0 & mgr; l).
2. Bewegen Sie die Maus so das Auge nach oben zeigt und deutlich sichtbar in der dissecting Mikroskop.
3. kneifen Sie vorsichtig die zeitliche Bindehaut mit feiner Spitze Pinzette. Machen Sie einen umlaufenden Einschnitt von etwa 90 Grad mit gekrümmten Vannas Schere.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.3 mit der darunterliegenden Tenon-Kapsel.
5. Resezieren das umgebende Bindegewebe mit feinen Spitzen versehenen Zange während nasal den Globus drehen. Arbeiten an einer Injektionsstelle ca. 0,5 mm temporal der Sehnerv. Verwenden Sie große Sorgfalt zu vermeiden, dass die retro-orbitalen Sinus zu stören.

3. Sclerotomie und Subretinale Injection

HINWEIS: Es wird empfohlen, dass die Injektion von 0.01% Fluorescein in 0,9% Kochsalzlösung verwendet werden, mit der Visualisierung zu unterstützen, während dieser Prozedur erlernen. Die topographische Verteilung von Fluorescein kann effektiv mit Fundusaufnahmen dokumentiert werden (siehe Abschnitt 4 unten).

1. Machen Sie einen kleinen Skleraeinschnitt an der Injektionsstelle, indem Sie vorsichtig das Okular mit einem 22,5-Grad-ophthalmologischen Klinge kratzen. Dieser Schnitt should nur groß genug sein, die Spitze der Nadel zu ermöglichen, durch die Sklera zu passieren.
2. Legen Sie die abgeschrägte 33 G - Nadel (gewinkelt . 5 - 10 ° in die Sclerotomie mit der Kegel- und abgewinkelte parallel zur Netzhaut zugewandten Inject gewünschte Volumen (zB 0,3 bis 1,0 & mgr; l von 0,01% Fluorescein für Lernzwecke).
   HINWEIS: Sterilität der Spritze beizubehalten, indem gründlich mit aufeinanderfolgenden Waschungen mit einem geeigneten Lösungsmittel und DI-Wasser vor jeder Injektion reinigen.
3. Drücken Sie den Kolben langsam (über ~ 3 Sekunden), ohne die Nadel zu bewegen und mit gleichmäßigem Druck.
   HINWEIS: Wenn die Nadel in den subretinalen Raum ist, wird ein leichter Widerstand zu spüren sein, während der Kolben niedergedrückt. Es wird keine auf minimalen Widerstand, wenn die Nadel in die Netzhaut durchbohrt, und eine hohe Beständigkeit, wenn die Nadel nicht die Sklera oder RPE eindringt.
4. Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel herausgezogen Rückfluss zu minimieren.
5. Spülen Sie das Auge mit steriler gepufferter Salzlösung und sorgen für die Augen hals zurück in seine normale Position gedreht wird.

4. Bewertung der Amotio OCT und Fundusimaging

1. Führen OCT-Bildgebung unmittelbar nach der Injektion, die Qualität der Injektion und zu geeigneten Zeitpunkten nach der Injektion zu bewerten, wie Netzhautstruktur zu bewerten benötigt.
   Hinweis: Beispiele für die Verwendung der OCT in ähnlichen Studien bisher ^7,14 beschrieben wurde.
   1. Justieren und Ausrichten der OCT-Bild der Injektionsstelle zu richten. Die Injektionsstelle sollte der Mittellinie und 0,5 mm temporal der Sehnervenkopf sein. Bei Bedarf wiederholen, wenn die Ablösung aus dem Rahmen oder nicht optimal zentriert ist.
2. Visualisieren Netzhautablösung und Farbstoffinjektionsbereich mit en-face Fundus Imaging ^7,14.
   HINWEIS: Wenn ein OCT-Abbildungssystem nicht verfügbar ist, Einspritzen einer kleinen Menge von Fluorescein mit einem Vektor für die Praxis wird Visualisierung mit jeder Funduskamera ermöglichen, die Fluorescein angio führtgrafie die gleichen Anregungswellenlängen und Sperrfilter verwenden. Lokalisierte Bereiche der hyper-Fluoreszenz wird unter dem Gefäßsystem erscheinen und die Gefäße werden scharfe und deutliche Grenzen, wenn der subretinalen Raum richtig ausgerichtet ist. Der Rand des Bleb von der Injektion wird durch den Übergang von Hyper- zu Hypo- Fluoreszenz abgegrenzt werden. Mehrere Instrumente bieten diese Möglichkeit für die Maus; die Instrumentierung verwendet hier wird an anderer Stelle ¹⁴ beschrieben.

5. postoperative Pflege

1. Tragen Sie eine dicke Schicht von Triple-antibiotische Augencreme auf der Hornhautoberfläche des injizierten Auge.
2. Platzieren Sie Mäuse in einem sauberen Einzelkäfigen für Erholung. Kombinieren Sie nicht Mäuse, die Operation unterzogen haben, bis sie vollständig wiederhergestellt werden.
3. Überwachen der Atmung und Temperatur während der Narkose Erholung. Überwachen Tiere, bis sie Brustlage halten können.
4. Führen Sie zusätzliche geeignete postoperative Überwachungund Behandlung, einschließlich einer subkutanen Injektion von Carprofen (5 mg / kg) für die postoperative Schmerztherapie.

6. Bewertung der Retinal-Funktion durch Elektroretinogramm (ERG)

1. Führen ERG Analyse vor der Injektion und zu geeigneten Zeitpunkten nach der Injektion als Funktion der Retina zu bewerten benötigt. Wenn die Injektion in den subretinalen Raum gemacht wurde, sollte die Netzhautablösung innerhalb von 72 Stunden gelöst.
   1. Verwenden Sie Standard - ERG Techniken Netzhautfunktion vor und nach der Injektion zu bewerten , wie zuvor beschrieben ^14,15.

7. 3D-Rekonstruktion und Bleb Volume Quantifizierung

HINWEIS: Oktober-Scans mit hohem Kontrast sind für den Einsatz optimal die gesamte Distanz im Rahmen der Ansicht umfasst. ImageJ / Fiji ^17,18 und Imaris wurden verwendet, aber auch andere Software verwendet werden kann.

1. Exportieren Sie die b-Scan von Interesse, die Einfuhr zu ImageJ / Fidschi und Ernte (Bild> Crop) den Teil des OCT-scein zu modellierenden den rechteckigen Auswahlwerkzeug.
   1. Kontrast einstellen (Bild> Anpassen> Helligkeit / Kontrast) und beschreiben die fehlenden Grenzen, indem zwei Abschnitte mit einer Linie.
   2. Zeichnen einer geraden Linie mit dem Zeilenwerkzeug (Halteverschiebung), die das RPE auf die Photorezeptorschicht erstreckt. Measure (Analysieren> Measure) die Länge der Liniengröße von maximal Ablösung für 7,8 Schritt zu erhalten.
2. Import abgeschnitten Rahmen zum 3D-Rekonstruktionssoftware (Siehe Tabelle der Materialien), um die "RGB Gray" Plugin verwendet und MATLAB Compiler Runtime.
3. Stellen Sie die Voxelgröße (unter Image-Eigenschaften) unter Verwendung der Kalibrierungsparameter aus dem OCT-Scan (x, y, z).
4. Führen Sie den "RGB Gray" Plugin (unter Image-Eigenschaften), mit gleicher Gewichtung für jeden Kanal, einen vierten Kanal zu erstellen. Original löschen Rot-Grün-Blau-Kanäle.
5. Kehren Sie die grauen Kanal mit Kontraständerung. Shop Bild.
6. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Hinzufügen einew Oberfläche "in der 3D-Registerkarte Ansicht, und damit beginnen, die geführte 4 Schritt-Verfahren die Oberfläche zu schaffen.
   1. Stellen Sie die Oberfläche Detailebene (Schritt 1 von 4).
      HINWEIS: Nach unserer Erfahrung 8,0-12,0 war die effektive Reichweite.
   2. Legen Sie die maximale Kugelgröße (unter Hintergrund Auswahl) auf etwas weniger als die maximale Distanz Größe in 7.1.2 gemessen. Erstellen Sie die Oberfläche und rückgängig gemacht werden grau Kanalinversion (Schritt 2 von 4).
   3. Stellen Sie den Schwellenwert auf den Maximalwert, so dass die Oberfläche der negativen Räume außerhalb der Netzhaut und der Ablösung nicht in Kontakt (Schritt 3 von 4) kommen.
   4. Stellen Sie den Filtertyp auf die Anzahl der Voxel und den negativen Raum in der Ablösung Ort durch Größe zu isolieren. Beenden Sie die Oberfläche (Schritt 4 von 4).
      HINWEIS: Das Volumen der Ablösung Oberfläche ist in der Statistik unter der Registerkarte Volumen befindet.

Results

Posterioren Ansatz transcleral subretinalen Injektionen wurden auf 31 gesunde Augen von 16 Wildtyp-Mäusen, die mit Injektionen von 0,3 & mgr; l (n = 18), 0,5 ul (n = 8) und 1,0 ul (n = 5) von 0,01% Fluorescein. Ein Auge war von der Injektion ausgeschlossen aufgrund einer vorbestehenden Hornhauttrübung, die strukturelle und funktionelle Analyse verhindert. Jedes injizierten Auge wird in diesem Bericht enthalten. Keine unbeabsichtigte Netzhautablösungen, Einstiche der neurosensorischen...

Discussion

Subretinale Injektionen sind die Methode der Wahl für die Lieferung von viralen Vektoren und Stammzell-abgeleiteten Therapie für Photorezeptoren und den RPE in der Grundlagenforschung und der klinischen Behandlung zu manipulieren. Bei Patienten werden subretinalen Injektionen typischerweise mit einem vorderen Sclerotomie an der Pars plana, einen hinteren Kern Vitrektomie und das Eindringen der Netzhaut durch die Nadel mit direkter Visualisierung erfolgen. Wie bei den meisten Vitrektomie Verfahren ist es üblich, für die ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Spritze x 1
Hamilton Nadel 33 G, 1.0", 20 Grad, Spitze 3 (Edelstahl 304)	Hamilton	7803-05	Nadeln x 6
Vannas Gebogene Schere	Ted Pella, INC.	1347	5 mm Klinge
22,5 Grad Mikrochirurgie-Messer	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamin
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xylazin
Fluorescein 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0,9% Kochsalzlösung USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9% NaCl
Antibiotische Salbe	Akorn	NDC 17478-235-35	Augenwasser
Umwälzpumpe	Gaymar	TP-500 T/Pumpe	Bestellnummer 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Serie	Kommerzielle
Funduskamera	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Pinzette Typ 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2,5 % Phenylephrin	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Ophthalmic
IMARIS8	Bitplane		Version 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose  2,5%	Goniovisc	AX0401	Methylcellulose
Augentropfen (Spülen)	Bausch & Lomb		Kochsalzlösung
Mikroskop	Zeiss	Stemi 2000	Mikroskop
Lichtquelle	Fostec	P/N 20520	Lichtquelle