Methodenartikel

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in C. elegans

DOI:

10.3791/54810

⸱

14. November 2016

 , 
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.

Zusammenfassung

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Forward genetisches Screening in Modellorganismen ist das Arbeitspferd, um funktionell wichtige Gene und Signalwege in vielen biologischen Prozessen zu entdecken. Bei den meisten Mutagenese-basierten Screenings haben sich die Forscher auf die Verwendung von giftigen Chemikalien, Karzinogenen oder Bestrahlung verlassen, was eine spezielle Ausrüstung, Sicherheitsvorkehrungen und/oder die Entsorgung gefährlicher Materialien erfordert. Wir haben einen einfachen Ansatz entwickelt, um vererbbare Mutationen in C. elegans mit Hilfe von keimbahnexprimiertem Histon-miniSOG, einem lichtinduzierbaren potenten Generator von reaktiven Sauerstoffspezies, zu induzieren. Diese Mutagenese-Methode ist frei von giftigen Chemikalien und erfordert ein Minimum an Laborsicherheit und Abfallmanagement. Die induzierten DNA-Modifikationen umfassen Einzelnukleotidveränderungen und kleine Deletionen und ergänzen solche, die durch klassische chemische Mutagenese verursacht werden. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Integration von extrachromosomalen Transgenen zu induzieren. Hier stellen wir die Details des LED-Aufbaus und die Protokolle für die Standard-Mutagenese und Transgenintegration zur Verfügung.

Einleitung

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Vorwärts genetischen Screens wurden verschiedene biologische Prozesse in Modellorganismen genetische Mutanten zu erzeugen , zu stören wie Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1 weit verbreitet. Analysen solcher Mutanten führen zur Entdeckung von funktionell wichtigen Gene und ihre Signalwege 1,2. Traditionell Mutagenese in C elegans unter Verwendung mutagener Chemikalien erreicht, Strahlung oder Transposonen 2. Chemikalien , wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS) und N - Ethyl - N -nitrosourea (ENU) sind für den Menschen giftig; gamma-Strahlen oder Ultraviolett (UV) -Strahlung Mutagenese erfordert spezielle Ausrüstung; und Transposon-aktiven Stämmen wie Mutatorstämme 3 können unnötige Mutationen während der Wartung führen. Wir haben eine einfache Ansatz entwickelt vererbbare Mutationen zu induzieren 4 eine genetisch kodierte Photosensibilisator verwendet wird .

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) können DNA 5 beschädigen.Der Mini - Singlet Sauerstoff - Generator (miniSOG) ist ein grün fluoreszierendes Protein von 106 Aminosäuren, die von der LOV (Licht, Sauerstoff und Voltage) Domäne von Arabidopsis Phototropin 2 6 entwickelt wurde. Bei Bestrahlung mit blauem Licht (~ 450 nm), miniSOG ROS erzeugt , einschließlich Singulett - Sauerstoff mit fl avin Mononukleotid als Cofaktor 6-8, die in allen Zellen vorhanden ist. Wir konstruierten eine His-Fusionsprotein durch MSOG miniSOG an den C-Terminus von Histon-72, ein C - Tagging elegans Variante von Histon 3. Wir erzeugten eine Einzelkopie - Transgen 9 His-MSOG in der Keimbahn von C. auszudrücken elegans. Unter normalen Kulturbedingungen in der Dunkelheit, die His-MSOG transgenen Würmer haben normale Brut Größe und Lebensdauer 4. Bei Bestrahlung mit blauem LED - Licht, die His-MSOG Würmer produzieren vererbbare Mutationen unter ihren Nachkommen 4. Das Spektrum der induzierten Mutationen umfasst Nukleotidänderungen, wie G: C zu T: A und G: C zu C: G, und kleine chromosome Löschungen 4. Dieses Mutagenese Verfahren ist einfach durchzuführen und erfordert nur minimale Laborsicherheit Setup. Hier beschreiben wir die LED-Beleuchtung Einrichtung und Verfahren für optogenetische Mutagenese.

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Protokoll

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1. Aufbau der LED-Illuminator

HINWEIS: Die erforderliche LED-Geräte sind in der Liste der Materialien zusammengefasst. Die gesamte LED - Setup ist klein und kann überall im Labor aufgestellt werden, obwohl wir es empfehlen , in einem dunklen Raum platziert werden 4 Lichtexposition von Würmern zu steuern.

  1. Schließen Sie das LED an einen Controller mit Kabel (1A, D).
  2. Schließen Sie den Controller an einen digitalen Funktionsgenerator / Verstärker mit einem BNC - Kabel (Abbildung 1A, C, D).
  3. Befestigen Sie die LED - Leuchte 10 cm über der Bühne einen benutzerdefinierten Halter (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Es wird der Halter mit Metallteilen.
  4. Decken Sie die LED - Beleuchtung Einrichtung teilweise, aber Wärmestau (1B) zu vermeiden, die Würmer krank macht.
    HINWEIS: Wir verwenden eine maßgeschneiderte Hartplastikhülle mit oben und unten offen (Abbildung 1A). Der Deckel ist für die Mutagenese selbst ist nicht erforderlich, wird aber verwendet to begrenzen unnötige Exposition des blauen Lichts in die Umgebung. Wir empfehlen nicht den LED - Setup völlig abdecken (Abbildung 1B) eine Überhitzung der Würmer zu verhindern.
  5. Tragen Sie Laser-Schutzbrille.
    HINWEIS: Wir tragen Laser-Schutzbrille, weil das Licht sehr hell ist. Sonnenbrille kann auch arbeiten.
  6. Schalten Sie den Hebel des LED-Controller auf "Int." für kontinuierliche Beleuchtung (1D) und es bei 65% der maximalen Leistung (1C) eingestellt.
  7. Verwenden Sie ein Photometer die blaue Lichtintensität auf der Bühne zu messen, wo die Würmer gestellt werden Protokoll des Herstellers verwendet wird. Das Setup gibt 2,0 mW / mm 2 unter kontinuierlicher Beleuchtung.

2. Blau-Licht-Behandlung

HINWEIS: Verwenden Sie den Stamm CZ20310 juSi164 [pMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ed3) III 4 Der Stamm ist verfügbar. am Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. Pflegen Sie den His-MSOG Stamm im Dunkeln auf Standard - Nematode Wachstumsmedium (NGM) Platten mit E. coli OP50 nach einem Standardprotokoll 10,11.
    HINWEIS: Unter Umgebungslicht, juSi164 haltigen Stämme mit einer Mutationsrate über einer spontanen Rate 4 nicht angezeigt werden soll . Routine Stamm Durchgang einen Binokular mit einer Halogenlampe mit im Allgemeinen nicht Mutationen auch verursacht. Dennoch sollte darauf unnötige Lichteinwirkung vermieden wird, zum Beispiel mit den Stämmen in einem Standard - dunkel innerhalb Inkubator zu halten, oder Abdecken der Stämme mit Folie. Es wird empfohlen, Teilmengen des Stammes einzufrieren, nachdem es im Fall unnötige Mutationen ansammeln im Laufe der Zeit zu empfangen.
  2. Pick - trächtige junge Erwachsene (ca. 12 h nach L4) Tiere mit einem Wurm Pick 11.
    HINWEIS: Die kleinen Tiere zeigen weniger mutagene Wirkung 4, während ältere Tiere niedriger Brut Größe haben können.
  3. Schneiden Sie einen Filter paper eine 60 - mm - Platte mit 25 mm x 25 mm Vierkantloch und setzen auf eine ungeimpfte Platte (Abbildung 1E) zu passen.
    HINWEIS: Ein quadratisches punch verwendet werden kann, aber die Größe des Stempels muss nicht genau zu sein.
  4. Drop 100 ul 100 mM CuCl 2 auf dem Filterpapier gleichmäßig Würmer auf der Platte innerhalb der quadratischen Öffnung zu beschränken.
  5. Wählen Sie gewünschte Anzahl von trächtigen jungen Erwachsenen Hermaphroditen (siehe Schritt 3 für ein Beispiel) und Transfer zum Zentrum der CuCl 2 - Platte.
  6. Tragen Laserschutzbrille.
  7. Schalten Sie das LED und den Funktionsgenerator.
  8. Schalten Sie den Hebel des LED-Controller zu "Ext." zu steuern , es wird von dem Funktionsgenerator (Figur 1D).
  9. Stellen Sie den Regler auf 65% der maximalen Leistung und den Funktionsgenerator als Sinuswelle, 4 Hz (1C).
  10. Legen Sie die CuCl 2 - Platte aus Schritt 2.5 ohne Deckel auf der Bühne unter der LED (1A </ Strong>).
  11. Illuminate die Tiere mit blauem Licht für 30 min.
  12. Übertragen Sie gesund aussehende Würmer auf eine geimpfte Platte als P 0.
    HINWEIS: Die gewünschte Anzahl von P 0 ist abhängig von der Art des Bildschirms. Siehe Schritt 3 für ein Beispiel. Die P 0 Würmer erscheinen nach der Lichtbehandlung unkoordiniert sofort sein und wird im Laufe der Zeit zu erholen.
  13. Halten Sie Würmer abgedeckt mit Folie in einem Inkubator oder im Dunkeln; und folgen Sie dem Standardverfahren zu beginnen , bei ihren Nachkommen 2,10 gewünschten Phänotypen Screening.

3. Beispiel eines Forward genetischen Screen

. ANMERKUNG: Dies ist ein Beispiel für die klonale Bildschirm mit 120 haploiden Genomen zu überprüfen , ob die LED und Belastung arbeiten Abbildung 2 zeigt ein Schema des Verfahrens.

  1. [Day1] Nach blaues Licht Behandlung, Pick fünf gesunde Würmer auf eine NGM Platte mit OP50 als P 0, halten sie in einem 20 ° C Inkubator suchen, und lassen Sie sie Eier legen für 1d ( 'Day1' Schild).
  2. [Day2] Übertragung P 0 auf eine neue ausgesät Platte ( 'Day2' Schild).
  3. [Day3] Pick - and - Platte P 0 auf der 'Day2' töten sie durch Verbrennen.
  4. [Day4] 30 trächtige jungen Erwachsenen F - Pick 1 von der Platte "Tag1" und sie auf einzelnen Platten (30 F 1 Platten für 'Day1') übertragen.
  5. [Day5] Wiederholen Sie Schritt 3.4 für die 'Day2' Platte (30 F 1 Platten für 'Day2').
  6. Prüfen Sie [Day7-9] , um die anomalen Morphologien und / oder das Verhalten von F 2 Würmer im Vergleich zum WT - Stamm (3A) unter einer Standardstereo , wenn sie erwachsen werden.
    Hinweis: Um eine vererbbare Mutation zeigt etwa ein Viertel der Würmer mit dem gleichen Phänotyp unter F 2 , wenn es mit hoher Penetranz rezessiv ist. Allerdings wachsen einige Mutanten können langsam und / oder Teil Penetranz zeigen. Daher ist es möglich, dass weniger als ein Viertel der Mutanten auf eine gefunden werden kannTeller.
  7. Pick-Würmer mit sichtbaren Phänotypen individuell und überprüfen Sie die Erblichkeit des Phänotyps in der nächsten Generation.

4. Beispiel eines extrachromosomalen Transgene Integration

  1. Injizieren Sie die DNA von Interesse in CZ20310 juSi164 [pMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ed3) und bereiten transgene Würmer mit einem niedrige Übertragungsrate (10-30%) nach einem Standard - Injektionsprotokoll 12,13.
    HINWEIS: Alternativ etablierte extrachromosomale Arrays können in die juSi164 Stämme gekreuzt werden. Um zu vermeiden , Genotypisierung für juSi164, juSi164 Heterozygoten kann als P verwendet werden 0 obwohl Effizienz könnte verringert werden. Die Genotypisierung Methode für juSi164 wird in Abschnitt 5 beschrieben.
  2. [Day1] Saures ~ 20 transgene Tiere als P 0 mit blauem Licht wie in Schritt 2 beschrieben.
    HINWEIS: Weitere P 0 Würmer sind notwendig , je nach tr ansmission Rate. Transgene können durch Phänotypen oder Co - Injektion Marker 12,13 identifiziert werden.
  3. Wählen Sie 10 gesund aussehende P 0 auf einzelnen Platten, halten sie in einem 20 ° C Inkubator, und lassen Sie sie legen Eier für ein paar Tage (P 0 Platten)
  4. Einzel aus 20 transgenen F 1 Würmer aus jeder P 0 Platte [Day4] auf einzelne Platten und lassen sie Eier legen. (20 F 1 x 10 P 0 Platten = 200 F 1 Platten insgesamt.)
  5. [Day7] Finden F 1 Platten mit> 75% F 2 mit Transgene.
  6. Wählen Sie fünf transgenen Tiere aus dem> 75% Übertragungsrate F 1 - Platten (F 2 Platten).
  7. [Day10] Halten Sie F 2 - Platten mit 100% Übertragungsrate als potentielle integrierte Linien.
  8. Auskreuzung die möglichen integrierten Linien ein Standardverfahren 10 mit der Mendelschen Segregation zu überprüfen und mögliche Hintergrundmutationen entfernen.
le "> 5. Genotypisierung

  1. Lyse 20 kreuzt F 2 Würmer in Lysepuffer mit einem Standardprotokoll 14.
  2. Führen PCR unter Verwendung der Primer für MosSCI Insertion 9, juSi164, (Tabelle 1) mit einer Annealingtemperatur von 58 ° C nach einem Standardprotokoll 14.
    HINWEIS: Es ist nicht notwendig , unc-119 (ed3) , weil unc-119 (ed3) durch unkoordinierte Verhalten nachgewiesen werden , zu dem Genotyp nach der Rettung von Transgen (juSi164) in den folgenden Schritte 5.4 und 5.5 zu entfernen.
  3. Führen Sie Agarose - Gelelektrophorese 15 und die Bandgrößen (Tabelle 1) untersuchen die WT für juSi164 zu finden.
  4. Überprüfen Sie, ob die F 2 Nachkommen Würmer aufgrund der Existenz von unc-119 (ed3) gelähmt hat.
  5. Wenn unkoordiniert Würmer auf Schritt 5.4, einzelne mehrere nonuncoordinated Würmer alle nonuncoordinated Würmer in der nächsten Generation zu finden sind erhalten.

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Ergebnisse

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Wir führten eine vorwärts genetischen Bildschirm mit CZ20310 juSi164 unc-119 (ed3) 30 min Belichtung mit nach dem Standardprotokoll in den Abschnitten 2 und 3 unter 60 F 1 Platten bis 120 mutagenisiert haploide Genome entspricht, fanden wir 8 F 1 Platten mit F 2 Würmer sichtbar Phänotypen wie Körpergröße Defekt (3B), unkoordinierte Bewegung (3C) und Erwachsenen Letalität (3D) angezeigt wird . Wir...

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Diskussion

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Hier beschreiben uns ein detailliertes Verfahren von optogenetische Mutagenese unter Verwendung von His-MSOG in der Keimbahn exprimiert und ein Beispiel für einen kleinen Maßstab vorwärts genetischen Bildschirm liefern. Im Vergleich zu Standard chemische Mutagenese weist dieses optogenetische Mutagenese Methode mehrere Vorteile. Zum einen ist es ungiftig, dadurch hält das Laborpersonal weg von giftigen chemischen Mutagenen wie EMS, ENU und Trimethylpsoralen mit ultraviolettem Licht (TMP / UV). Zweitens kann das experime...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Arbeit wird von HHMI unterstützt. Wir danken unseren Labormitgliedern für ihre Hilfe beim Testen des Protokolls und bei der Überarbeitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ultra High Power LED-LichtquellePrizmatixUHP-mic-LED-460460 ± 5 nm
LED-ControllerPrizmatixUHPLCC-01
Digitaler Funktionsgenerator/-verstärkerPASCOPI-9587CPI-9587C ist nicht mehr lieferbar. Der Ersatz ist PI-8127.
BNC-Kabel Stecker/SteckerTHORLABSCA3136
USB-TTL-SchnittstellePrizmatixOptionales
PhotometerTHORLABSPM50 und Modell D10MM
FilterpapierWhatman1001-110
StereomikroskopLeicaMZ95
NGM-Platte5 g NaCl, 2,5 g Pepton, 20 g Agar, 10 & Mikro auflösen; g/ml Cholesterin in 1 L H2O. Nach dem Autoklavieren 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4 (pH 6,0) hinzufügen.
Lyselösung10 mM Tris(pH 8,8), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 100 µ g/mL Proteinase K

Referenzen

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  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
  4. Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868(2015).
  5. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  6. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041(2011).
  7. Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
  8. Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
  9. Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
  13. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  14. Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  16. Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
  17. Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271(2016).
  18. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
  19. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  20. Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
  21. Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), http://www.bio-protocol.org/e316 316(2013).
  22. Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
  23. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).

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Optogenetische MutageneseLED AufbauForward Genetik ScreeningROS GenerierungKupferchloridKeimbahnhypotheseTransgen IntegrationLichtbehandlung

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