Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

Summary

Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.

Abstract

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Introduction

Vorwärts genetischen Screens wurden verschiedene biologische Prozesse in Modellorganismen genetische Mutanten zu erzeugen , zu stören wie Caenorhabditis elegans (C. elegans) ¹ weit verbreitet. Analysen solcher Mutanten führen zur Entdeckung von funktionell wichtigen Gene und ihre Signalwege ^1,2. Traditionell Mutagenese in C elegans unter Verwendung mutagener Chemikalien erreicht, Strahlung oder Transposonen ^2. Chemikalien , wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS) und N – Ethyl – N -nitrosourea (ENU) sind für den Menschen giftig; gamma-Strahlen oder Ultraviolett (UV) -Strahlung Mutagenese erfordert spezielle Ausrüstung; und Transposon-aktiven Stämmen wie Mutatorstämme ³ können unnötige Mutationen während der Wartung führen. Wir haben eine einfache Ansatz entwickelt vererbbare Mutationen zu induzieren ⁴ eine genetisch kodierte Photosensibilisator verwendet wird .

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) können DNA ⁵ beschädigen.Der Mini – Singlet Sauerstoff – Generator (miniSOG) ist ein grün fluoreszierendes Protein von 106 Aminosäuren, die von der LOV (Licht, Sauerstoff und Voltage) Domäne von Arabidopsis Phototropin 2 ⁶ entwickelt wurde. Bei Bestrahlung mit blauem Licht (~ 450 nm), miniSOG ROS erzeugt , einschließlich Singulett – Sauerstoff mit fl avin Mononukleotid als Cofaktor ^6-8, die in allen Zellen vorhanden ist. Wir konstruierten eine His-Fusionsprotein durch MSOG miniSOG an den C-Terminus von Histon-72, ein C – Tagging elegans Variante von Histon 3. Wir erzeugten eine Einzelkopie – Transgen ⁹ His-MSOG in der Keimbahn von C. auszudrücken elegans. Unter normalen Kulturbedingungen in der Dunkelheit, die His-MSOG transgenen Würmer haben normale Brut Größe und Lebensdauer ^4. Bei Bestrahlung mit blauem LED – Licht, die His-MSOG Würmer produzieren vererbbare Mutationen unter ihren Nachkommen ^4. Das Spektrum der induzierten Mutationen umfasst Nukleotidänderungen, wie G: C zu T: A und G: C zu C: G, und kleine chromosome Löschungen ^4. Dieses Mutagenese Verfahren ist einfach durchzuführen und erfordert nur minimale Laborsicherheit Setup. Hier beschreiben wir die LED-Beleuchtung Einrichtung und Verfahren für optogenetische Mutagenese.

Protocol

1. Aufbau der LED-Illuminator HINWEIS: Die erforderliche LED-Geräte sind in der Liste der Materialien zusammengefasst. Die gesamte LED – Setup ist klein und kann überall im Labor aufgestellt werden, obwohl wir es empfehlen , in einem dunklen Raum platziert werden 4 Lichtexposition von Würmern zu steuern. Schließen Sie das LED an einen Controller mit Kabel (1A, D). Schließen Sie den Controller an einen digitalen Funktionsgenerator / Verstärker mit einem BNC – Kabel (Abbildung 1A, C, D). Befestigen Sie die LED – Leuchte 10 cm über der Bühne einen benutzerdefinierten Halter (Abbildung 1A). HINWEIS: Es wird der Halter mit Metallteilen. Decken Sie die LED – Beleuchtung Einrichtung teilweise, aber Wärmestau (1B) zu vermeiden, die Würmer krank macht. HINWEIS: Wir verwenden eine maßgeschneiderte Hartplastikhülle mit oben und unten offen (Abbildung 1A). Der Deckel ist für die Mutagenese selbst ist nicht erforderlich, wird aber verwendet to begrenzen unnötige Exposition des blauen Lichts in die Umgebung. Wir empfehlen nicht den LED – Setup völlig abdecken (Abbildung 1B) eine Überhitzung der Würmer zu verhindern. Tragen Sie Laser-Schutzbrille. HINWEIS: Wir tragen Laser-Schutzbrille, weil das Licht sehr hell ist. Sonnenbrille kann auch arbeiten. Schalten Sie den Hebel des LED-Controller auf "Int." für kontinuierliche Beleuchtung (1D) und es bei 65% der maximalen Leistung (1C) eingestellt. Verwenden Sie ein Photometer die blaue Lichtintensität auf der Bühne zu messen, wo die Würmer gestellt werden Protokoll des Herstellers verwendet wird. Das Setup gibt 2,0 mW / mm 2 unter kontinuierlicher Beleuchtung. 2. Blau-Licht-Behandlung HINWEIS: Verwenden Sie den Stamm CZ20310 juSi164 [pMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ed3) III 4 Der Stamm ist verfügbar. am Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/). Pflegen Sie den His-MSOG Stamm im Dunkeln auf Standard – Nematode Wachstumsmedium (NGM) Platten mit E. coli OP50 nach einem Standardprotokoll 10,11. HINWEIS: Unter Umgebungslicht, juSi164 haltigen Stämme mit einer Mutationsrate über einer spontanen Rate 4 nicht angezeigt werden soll . Routine Stamm Durchgang einen Binokular mit einer Halogenlampe mit im Allgemeinen nicht Mutationen auch verursacht. Dennoch sollte darauf unnötige Lichteinwirkung vermieden wird, zum Beispiel mit den Stämmen in einem Standard – dunkel innerhalb Inkubator zu halten, oder Abdecken der Stämme mit Folie. Es wird empfohlen, Teilmengen des Stammes einzufrieren, nachdem es im Fall unnötige Mutationen ansammeln im Laufe der Zeit zu empfangen. Pick – trächtige junge Erwachsene (ca. 12 h nach L4) Tiere mit einem Wurm Pick 11. HINWEIS: Die kleinen Tiere zeigen weniger mutagene Wirkung 4, während ältere Tiere niedriger Brut Größe haben können. Schneiden Sie einen Filter paper eine 60 – mm – Platte mit 25 mm x 25 mm Vierkantloch und setzen auf eine ungeimpfte Platte (Abbildung 1E) zu passen. HINWEIS: Ein quadratisches punch verwendet werden kann, aber die Größe des Stempels muss nicht genau zu sein. Drop 100 ul 100 mM CuCl 2 auf dem Filterpapier gleichmäßig Würmer auf der Platte innerhalb der quadratischen Öffnung zu beschränken. Wählen Sie gewünschte Anzahl von trächtigen jungen Erwachsenen Hermaphroditen (siehe Schritt 3 für ein Beispiel) und Transfer zum Zentrum der CuCl 2 – Platte. Tragen Laserschutzbrille. Schalten Sie das LED und den Funktionsgenerator. Schalten Sie den Hebel des LED-Controller zu "Ext." zu steuern , es wird von dem Funktionsgenerator (Figur 1D). Stellen Sie den Regler auf 65% der maximalen Leistung und den Funktionsgenerator als Sinuswelle, 4 Hz (1C). Legen Sie die CuCl 2 – Platte aus Schritt 2.5 ohne Deckel auf der Bühne unter der LED (1A </ Strong>). Illuminate die Tiere mit blauem Licht für 30 min. Übertragen Sie gesund aussehende Würmer auf eine geimpfte Platte als P 0. HINWEIS: Die gewünschte Anzahl von P 0 ist abhängig von der Art des Bildschirms. Siehe Schritt 3 für ein Beispiel. Die P 0 Würmer erscheinen nach der Lichtbehandlung unkoordiniert sofort sein und wird im Laufe der Zeit zu erholen. Halten Sie Würmer abgedeckt mit Folie in einem Inkubator oder im Dunkeln; und folgen Sie dem Standardverfahren zu beginnen , bei ihren Nachkommen 2,10 gewünschten Phänotypen Screening. 3. Beispiel eines Forward genetischen Screen . ANMERKUNG: Dies ist ein Beispiel für die klonale Bildschirm mit 120 haploiden Genomen zu überprüfen , ob die LED und Belastung arbeiten Abbildung 2 zeigt ein Schema des Verfahrens. [Day1] Nach blaues Licht Behandlung, Pick fünf gesunde Würmer auf eine NGM Platte mit OP50 als P 0, halten sie in einem 20 ° C Inkubator suchen, und lassen Sie sie Eier legen für 1d ( 'Day1' Schild). [Day2] Übertragung P 0 auf eine neue ausgesät Platte ( 'Day2' Schild). [Day3] Pick – and – Platte P 0 auf der 'Day2' töten sie durch Verbrennen. [Day4] 30 trächtige jungen Erwachsenen F – Pick 1 von der Platte "Tag1" und sie auf einzelnen Platten (30 F 1 Platten für 'Day1') übertragen. [Day5] Wiederholen Sie Schritt 3.4 für die 'Day2' Platte (30 F 1 Platten für 'Day2'). Prüfen Sie [Day7-9] , um die anomalen Morphologien und / oder das Verhalten von F 2 Würmer im Vergleich zum WT – Stamm (3A) unter einer Standardstereo , wenn sie erwachsen werden. Hinweis: Um eine vererbbare Mutation zeigt etwa ein Viertel der Würmer mit dem gleichen Phänotyp unter F 2 , wenn es mit hoher Penetranz rezessiv ist. Allerdings wachsen einige Mutanten können langsam und / oder Teil Penetranz zeigen. Daher ist es möglich, dass weniger als ein Viertel der Mutanten auf eine gefunden werden kannTeller. Pick-Würmer mit sichtbaren Phänotypen individuell und überprüfen Sie die Erblichkeit des Phänotyps in der nächsten Generation. 4. Beispiel eines extrachromosomalen Transgene Integration Injizieren Sie die DNA von Interesse in CZ20310 juSi164 [pMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ed3) und bereiten transgene Würmer mit einem niedrige Übertragungsrate (10-30%) nach einem Standard – Injektionsprotokoll 12,13. HINWEIS: Alternativ etablierte extrachromosomale Arrays können in die juSi164 Stämme gekreuzt werden. Um zu vermeiden , Genotypisierung für juSi164, juSi164 Heterozygoten kann als P verwendet werden 0 obwohl Effizienz könnte verringert werden. Die Genotypisierung Methode für juSi164 wird in Abschnitt 5 beschrieben. [Day1] Saures ~ 20 transgene Tiere als P 0 mit blauem Licht wie in Schritt 2 beschrieben. HINWEIS: Weitere P 0 Würmer sind notwendig , je nach tr ansmission Rate. Transgene können durch Phänotypen oder Co – Injektion Marker 12,13 identifiziert werden. Wählen Sie 10 gesund aussehende P 0 auf einzelnen Platten, halten sie in einem 20 ° C Inkubator, und lassen Sie sie legen Eier für ein paar Tage (P 0 Platten) Einzel aus 20 transgenen F 1 Würmer aus jeder P 0 Platte [Day4] auf einzelne Platten und lassen sie Eier legen. (20 F 1 x 10 P 0 Platten = 200 F 1 Platten insgesamt.) [Day7] Finden F 1 Platten mit> 75% F 2 mit Transgene. Wählen Sie fünf transgenen Tiere aus dem> 75% Übertragungsrate F 1 – Platten (F 2 Platten). [Day10] Halten Sie F 2 – Platten mit 100% Übertragungsrate als potentielle integrierte Linien. Auskreuzung die möglichen integrierten Linien ein Standardverfahren 10 mit der Mendelschen Segregation zu überprüfen und mögliche Hintergrundmutationen entfernen. le "> 5. Genotypisierung Lyse 20 kreuzt F 2 Würmer in Lysepuffer mit einem Standardprotokoll 14. Führen PCR unter Verwendung der Primer für MosSCI Insertion 9, juSi164, (Tabelle 1) mit einer Annealingtemperatur von 58 ° C nach einem Standardprotokoll 14. HINWEIS: Es ist nicht notwendig , unc-119 (ed3) , weil unc-119 (ed3) durch unkoordinierte Verhalten nachgewiesen werden , zu dem Genotyp nach der Rettung von Transgen (juSi164) in den folgenden Schritte 5.4 und 5.5 zu entfernen. Führen Sie Agarose – Gelelektrophorese 15 und die Bandgrößen (Tabelle 1) untersuchen die WT für juSi164 zu finden. Überprüfen Sie, ob die F 2 Nachkommen Würmer aufgrund der Existenz von unc-119 (ed3) gelähmt hat. Wenn unkoordiniert Würmer auf Schritt 5.4, einzelne mehrere nonuncoordinated Würmer alle nonuncoordinated Würmer in der nächsten Generation zu finden sind erhalten.

Representative Results

Wir führten eine vorwärts genetischen Bildschirm mit CZ20310 juSi164 unc-119 (ed3) 30 min Belichtung mit nach dem Standardprotokoll in den Abschnitten 2 und 3 unter 60 F 1 Platten bis 120 mutagenisiert haploide Genome entspricht, fanden wir 8 F 1 Platten mit F 2 Würmer sichtbar Phänotypen wie Körpergröße Defekt (3B), unkoordinierte Bewegung (3C) und Erwachsenen Letalität (3D) angezeigt wi…

Discussion

Hier beschreiben uns ein detailliertes Verfahren von optogenetische Mutagenese unter Verwendung von His-MSOG in der Keimbahn exprimiert und ein Beispiel für einen kleinen Maßstab vorwärts genetischen Bildschirm liefern. Im Vergleich zu Standard chemische Mutagenese weist dieses optogenetische Mutagenese Methode mehrere Vorteile. Zum einen ist es ungiftig, dadurch hält das Laborpersonal weg von giftigen chemischen Mutagenen wie EMS, ENU und Trimethylpsoralen mit ultraviolettem Licht (TMP / UV). Zweitens kann das expe…

Materials

Ultra High Power LED light source	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED controller	Prizmatix	UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier	PASCO	PI-9587C	PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male	THORLABS	CA3136
USB-TTL interface	Prizmatix		Optional
Photometer	THORLABS	PM50 and Model D10MM
Filter paper	Whatman	1001-110
Copper chloride dihydrate (CuCl2∙2H2O)	Sigma	C6641
Stereomicroscope	Leica	MZ95
NGM plate			Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 µg/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0).
Lysis solution			10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/ml Proteinase K