Methodenartikel

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in C. elegans

DOI:

10.3791/54810

⸱

14. November 2016

 , 
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.

Zusammenfassung

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Forward genetisches Screening in Modellorganismen ist das Arbeitspferd, um funktionell wichtige Gene und Signalwege in vielen biologischen Prozessen zu entdecken. Bei den meisten Mutagenese-basierten Screenings haben sich die Forscher auf die Verwendung von giftigen Chemikalien, Karzinogenen oder Bestrahlung verlassen, was eine spezielle Ausrüstung, Sicherheitsvorkehrungen und/oder die Entsorgung gefährlicher Materialien erfordert. Wir haben einen einfachen Ansatz entwickelt, um vererbbare Mutationen in C. elegans mit Hilfe von keimbahnexprimiertem Histon-miniSOG, einem lichtinduzierbaren potenten Generator von reaktiven Sauerstoffspezies, zu induzieren. Diese Mutagenese-Methode ist frei von giftigen Chemikalien und erfordert ein Minimum an Laborsicherheit und Abfallmanagement. Die induzierten DNA-Modifikationen umfassen Einzelnukleotidveränderungen und kleine Deletionen und ergänzen solche, die durch klassische chemische Mutagenese verursacht werden. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Integration von extrachromosomalen Transgenen zu induzieren. Hier stellen wir die Details des LED-Aufbaus und die Protokolle für die Standard-Mutagenese und Transgenintegration zur Verfügung.

Einleitung

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Vorwärts genetischen Screens wurden verschiedene biologische Prozesse in Modellorganismen genetische Mutanten zu erzeugen , zu stören wie Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1 weit verbreitet. Analysen solcher Mutanten führen zur Entdeckung von funktionell wichtigen Gene und ihre Signalwege 1,2. Traditionell Mutagenese in C elegans unter Verwendung mutagener Chemikalien erreicht, Strahlung oder Transposonen 2. Chemikalien , wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS) und N - Ethyl - N -nitrosourea (ENU) sind für den Menschen giftig; gamma-Strahlen oder Ultraviolett (UV) -Strahlung Mutagenese erford....

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Protokoll

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1. Aufbau der LED-Illuminator

HINWEIS: Die erforderliche LED-Geräte sind in der Liste der Materialien zusammengefasst. Die gesamte LED - Setup ist klein und kann überall im Labor aufgestellt werden, obwohl wir es empfehlen , in einem dunklen Raum platziert werden 4 Lichtexposition von Würmern zu steuern.

  1. Schließen Sie das LED an einen Controller mit Kabel (1A, D).
  2. Schließen Sie den Controller an einen digitalen Funktionsgenerator / Verstärker mit einem BNC - Kabel (Abbildung 1A, C, D).
  3. Befestigen Sie die LED - Leuchte 10 cm über der Bühne einen benutzerdefinierten Halter (Abbi....

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Ergebnisse

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Wir führten eine vorwärts genetischen Bildschirm mit CZ20310 juSi164 unc-119 (ed3) 30 min Belichtung mit nach dem Standardprotokoll in den Abschnitten 2 und 3 unter 60 F 1 Platten bis 120 mutagenisiert haploide Genome entspricht, fanden wir 8 F 1 Platten mit F 2 Würmer sichtbar Phänotypen wie Körpergröße Defekt (3B), unkoordinierte Bewegung (3C) und Erwachsenen Letalität (3D) angezeigt wird . Wir.......

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Diskussion

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Hier beschreiben uns ein detailliertes Verfahren von optogenetische Mutagenese unter Verwendung von His-MSOG in der Keimbahn exprimiert und ein Beispiel für einen kleinen Maßstab vorwärts genetischen Bildschirm liefern. Im Vergleich zu Standard chemische Mutagenese weist dieses optogenetische Mutagenese Methode mehrere Vorteile. Zum einen ist es ungiftig, dadurch hält das Laborpersonal weg von giftigen chemischen Mutagenen wie EMS, ENU und Trimethylpsoralen mit ultraviolettem Licht (TMP / UV). Zweitens kann das experime.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Arbeit wird von HHMI unterstützt. Wir danken unseren Labormitgliedern für ihre Hilfe beim Testen des Protokolls und bei der Überarbeitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ultra High Power LED-LichtquellePrizmatixUHP-mic-LED-460460 ± 5 nm
LED-ControllerPrizmatixUHPLCC-01
Digitaler Funktionsgenerator/-verstärkerPASCOPI-9587CPI-9587C ist nicht mehr lieferbar. Der Ersatz ist PI-8127.
BNC-Kabel Stecker/SteckerTHORLABSCA3136
USB-TTL-SchnittstellePrizmatixOptionales
PhotometerTHORLABSPM50 und Modell D10MM
FilterpapierWhatman1001-110
StereomikroskopLeicaMZ95
NGM-Platte5 g NaCl, 2,5 g Pepton, 20 g Agar, 10 & Mikro auflösen; g/ml Cholesterin in 1 L H2O. Nach dem Autoklavieren 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4 (pH 6,0) hinzufügen.
Lyselösung10 mM Tris(pH 8,8), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 100 µ g/mL Proteinase K

Referenzen

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  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Optogenetische MutageneseLED AufbauForward Genetik ScreeningROS GenerierungKupferchloridKeimbahnhypotheseTransgen IntegrationLichtbehandlung

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