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Methodenartikel

Eine Plattform von Assays Anti-Biofilm auf die Erforschung der natürlichen Substanzbibliotheken Geeignet

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DOI:

10.3791/54829

⸱

27. Dezember 2016

 ,  , 
1Pharmaceutical Design and Discovery (PharmDD), Faculty of Pharmacy, University of Helsinki

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Biofilminfektionen zeigen eine hohe Toleranz gegenüber Chemotherapien. Kein einzelner Assay erfasst die Komplexität von Biofilmen. Stattdessen werden komplementäre Assays benötigt. Wir präsentieren eine Screening-Plattform (entwickelt für S. aureus), die Assays für Viabilität, Biomasse und Biofilmmatrix kombiniert. Es ermöglicht die Entdeckung von Anti-Biofilm-Medikamenten, einschließlich der Bewertung langfristiger chemotherapeutischer Wirkungen.

Zusammenfassung

Biofilme sind als eines der schwierigsten Themen der modernen Biomedizin angesehen, und sie sind möglicherweise verantwortlich für über 80% der Antibiotika-tolerante Infektionen. Biofilme haben eine außerordentlich hohe Toleranz für die Chemotherapie angezeigt, die multifaktoriell zu sein gedacht wird. Zum Beispiel stellt die Matrix eine physikalische Barriere, die das Eindringen von Antibiotika in den Biofilm abnimmt. Auch Zellen innerhalb der Biofilme sind phänotypisch vielfältig. Wahrscheinlich entsteht Biofilm Elastizität aus einer Kombination von diesen und anderen, noch unbekannte Mechanismen. Alle derzeit bestehenden Antibiotika gegen Single-Zellen (Plankton) Bakterien entwickelt worden. Daher Bisher existiert ein sehr begrenztes Repertoire von Molekülen, die selektiv auf reife Biofilme wirken kann. Diese Situation hat sich eine progressive Paradigmenwechsel in der Arzneimittelforschung getrieben, in denen Orten für die Anti-Biofilm gedrängt wurde eine prominentere Stelle zu besetzen. Eine weitere Herausforderung ist, dass es eine gibtsehr begrenzte Anzahl von standardisierten Verfahren zur Biofilmforschung, insbesondere diejenigen, die für große Durchsatzscreening von chemischen Bibliotheken verwendet werden können. Hier wird ein experimentelles anti-Biofilm-Plattform für chemisches Screening vorgestellt. Es nutzt drei Assays Biofilm Lebensfähigkeit (mit Resazurin - Färbung), Gesamtbiomasse (mit Kristallviolett - Färbung) und Biofilmmatrix (unter Verwendung eines Weizenkeimagglutinin, WGA-Fluoreszenz-basierte Färbung der Poly- N - Acetyl-Glucosamin zu messen, PNAG Fraktion). Alle Tests wurden unter Verwendung von Staphylococcus aureus als Modell Bakterien entwickelt. Beispiele dafür, wie die Plattform für die primäre Screening verwendet werden sowie für die funktionelle Charakterisierung von identifizierten anti-Biofilm Treffer vorgestellt. Diese experimentelle Sequenz ermöglicht ferner die Klassifizierung der Basis Treffer auf den gemessenen Endpunkte. Es bietet auch Informationen über ihre Wirkungsweise, vor allem auf langfristige gegen kurzfristige chemotherapeutischen Effekte. Somit ist es sehr advantageous für die schnelle Identifizierung von qualitativ hochwertigen Hit-Verbindungen, die als Ausgangspunkte für verschiedene biomedizinische Anwendungen dienen kann.

Einleitung

Bakterien können sich zwischen zwei sehr unterschiedlichen Lebensstile wechseln, planktonischen und sessilen, von denen ein Biofilm das häufigste Beispiel ist. In Biofilmen bilden Bakterien strukturierte Gemeinschaften in einem selbstproduzierten eingebettete Matrix 1. Diese selbst hergestellten Matrix ist eine Barriere zwischen den Bakterien und ihrer äußeren Umgebung und schützt die mikrobiellen Zellen, so dass sie in unmittelbarer Nähe zu halten. Die Zusammensetzung der Biofilmmatrix variiert zwischen und sogar innerhalb der Arten, aber es besteht hauptsächlich aus einem engen Netz von Lipopolysacchariden, extrazelluläre DNA und Proteinen. Die Matrix dient als physikalische Barriere das Eindringen von schädlichen Substanzen inhibierende, aber es schützt auch die Biofilm vor Austrocknung und verhindert Nährstoffe entweicht der Zelle 2.

Biofilme sind als eines der schwierigsten Themen der modernen Biomedizin angesehen, und sie sind angeblich verantwortlich für über 80% der Antibiotika-tolerante Infektionen 3. Sie displag ein von Natur aus eine hohe Toleranz gegen äußere Bedrohungen: Feuchtigkeit, den osmotischen Druck, mechanische Beanspruchung 4, Hitze, UV - Strahlung 5, Desinfektionsmittel, antimikrobielle Mittel, und das Immunsystem des Wirts 1. Zum Beispiel für die erforderliche antimikrobielle Mittel Konzentration einen Biofilm zu töten wurde im Vergleich zu der erforderlich ist, um zu töten Planktonbakterien bis zu 1000-mal höher erwiesen. Die Erklärung für diese höhere Toleranz scheint multifaktoriell zu sein. Die Matrix stellt eine physikalische Barriere, die das Eindringen von Antibiotika in den Biofilm abnimmt. Auch Zellen innerhalb der Biofilme sind phänotypisch vielfältig; sie Übergang zwischen verschiedenen metabolischen Zuständen aufgrund eines vorhandenen Gradienten von Sauerstoff, Nährstoffen und Stoffwechselprodukten zwischen den inneren und äußeren Teilen des Biofilms 6. Daher wird in einigen Biofilm Regionen, wie der Kern, sind Bakterien der Sauerstoff entzogen und Nährstoffe und leben in einer metabolisch weniger aktive oder einem völlig ruhenden Zustand 7. Die vollständig ruhenden Zellen werden als persister Zellen bezeichnet, und sie sind nicht empfindlich gegenüber konventionellen antimikrobiellen Behandlungen 8. Somit ist es wahrscheinlich, dass Biofilm Elastizität aus einer Kombination der gegenwärtig vorgeschlagenen und andere entsteht, noch unbekannte Mechanismen. Staphylococcus spp. sind immer noch zu den problematischen grampositiven Bakterien, was zu schweren, oft Biofilm bezogenen, 4 - Infektionen. Es wird vorgeschlagen , dass bis zu 99% aller Bakterien in Biofilmen verbunden sind, es der vorherrschende bakterielle Lebens 3 macht. Jedoch sind alle der derzeit vorhandenen Antibiotika sind gegen einzellige (planktonischen) Bakterien entwickelt. Bisher ein sehr begrenztes Repertoire von Molekülen besteht, die selektiv auf reife Biofilme wirken kann. Diese Situation hat sich eine progressive Paradigmenwechsel in der Arzneimittelforschung getrieben, in denen Orten für die Anti-Biofilm gedrängt wurde eine prominentere Stelle zu besetzen.

Aus methodologische Perspektive, zusätzliche Herausforderungen bestehen, da nur eine begrenzte Anzahl von Biofilmverfahren durch Normungsorganisationen entwickelt wurden, vor allem diejenigen, die für das Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken. Alle standardisierten Assays (mit einer Ausnahme) basieren auf Biofilmreaktoren, und diese Verfahren erfordern große Arbeitsvolumina und große Mengen von Verbindungen getestet werden, die während der frühen Untersuchungsstadium 9-12 Regel nicht verfügbar sind. Die einzige existierende standardisierte Screening-Assays anwendbar ist die sogenannte Calgary Biofilm Gerät, aus dem der handelsüblichen Mindest Biofilm Eliminieren Konzentration (MBEC) System wurde 13-15 entwickelt. Allerdings ist die Begrenzung dieses Tests, daß die Biofilme auf Zapfen aufgewachsen sind, und nicht alle Bakterienarten oder sogar Stämmen innerhalb derselben Spezies können Biofilme auf diesem Gerät zu bilden. Darüber hinaus Methoden, die besonders auf die Erforschung von Naturstoffen angewendet werden können, sinderforderlich. Natürliche Produkte haben die Hauptquelle für Innovationen in der antimikrobiellen Wirkstoffforschung im vergangenen Jahrhundert 16 gewesen. Sie können neuartige Anti-Biofilm-Verbindungen mit einzigartigen Wirkmechanismen zur Verfügung stellen, die auch wirksam gegen persister Zellen sein kann. Somit hat die Erforschung der natürlichen und natürlich inspirierten Bibliotheken hohe Chancen zur Herstellung von vielversprechenden und einzigartige Anti-Biofilm führt.

Hier stellen wir die experimentellen Details einer Plattform von Assays , die für die chemische Screening von Anti-Biofilm - Verbindungen unter Verwendung von drei Assays Zur Messung der Wirkungen auf die Lebensfähigkeit, Gesamtbiomasse und Matrix von Staphylococcus aureus Biofilm entwickelt wurde. Der erste Test misst Biofilm Lebensfähigkeit und es wird basierend auf Resazurin-Färbung. Resazurin ist ein Redox-Farbstoff, der in seinem oxidierten Zustand blau und nicht-fluoreszierend ist und verwandelt sich in rosa, stark fluoreszierenden Resorufin, wenn sie durch die Stoffwechselaktivität der Bakterien reduziert. Es ist eine sehr einfache und schnelle methode geeignet für primäre Screenings 17-20. Der zweite Test, basierend auf Kristallviolett-Färbung misst Gesamtbiofilmmasse. Kristallviolett ist eine weit verbreitete Färbung für 19,21-23 Bakterien und Bakterien in Biofilmen zu studieren. Der Test basiert auf kostengünstigen Reagenzien und hat eine einfache Absorption Endpunkt Lesen. Schließlich zielt die dritte Assay die extrazelluläre polymere Substanz (EPS) -Matrix des Biofilms durch Weizenkeim - Agglutinin (WGA), die spezifisch N - acetyl-Glucosamin - Reste (PNAG) in der Matrix von Staphylokokken - Biofilme 24 bis Poly- bindet. Die WGA wird mit einem Fluorophor konjugiert ist , der 25 unter Verwendung von Fluoreszenzintensitäts Leser erkannt werden kann. Wir stellen Ihnen hier die Gründe und Einzelheiten der Plattform, die wir entwickelt, darunter Beispiele für Anwendungen.

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Protokoll

1. Anzucht der Bakterien

  1. Vorkultur die Bakterien über Nacht in einer tryptischen Sojabrühe (TSB) bei 37 ° C mit 220 Umdrehungen pro Minute Schütteln (16-18 h).
  2. Verdünnen Sie die Vorkultur 100-1000 Zeiten ( in Abhängigkeit von der Wachstumsrate der Bakterien, hier 1.000 - mal für S. aureus verwendet wird) in frischem TSB und lassen Sie es bei 37 ° C und 200 Umdrehungen pro Minute wachsen exponentielles Wachstum zu erreichen (optisch Dichte bei 595 nm (OD 595) zwischen 0,2 und 0,6).
    Hinweis: Dieser Schritt erfordert stammspezifische Optimierung.

2. Bildung von Biofilmen: Pre- und Post-Exposition

  1. Verdünne die exponentiell gewachsenen Kultur 100 - mal (das entspricht etwa 10 6 koloniebildende Einheiten pro Milliliter (CFU / ml)).
  2. Pre-Expositions - Protokoll
    1. Für unbehandelten Kontrollproben, 200 ul der verdünnten Bakterienkultur pro Vertiefung einer sterilen 96-Mikrotiterplatte.
    2. Hinzufügen 4 ul einer Testverbindung oder einer KontrollAntibiotikum (50x Stammlösung) und 196 ul der verdünnten Bakterienkultur pro Vertiefung.
    3. Inkubieren bei 37 ° C auf einem Plattenschüttler bei 200 UpM für 18 Stunden.
      Hinweis: Hier haben wir einen Schüttler mit einem 2 mm Orbit verwenden.
  3. Postexpositionsprotokoll
    1. Für alle Proben mit 200 ul der verdünnten Bakterienkultur pro Vertiefung einer sterilen 96-Mikrotiterplatte.
    2. Inkubieren bei 37 ° C auf einem Plattenschüttler bei 200 UpM für 18 Stunden.
      Hinweis: Hier haben wir einen Schüttler mit einem 2 mm Orbit verwenden.
    3. Entfernen Sie die gesamte planktonischen Lösung vorsichtig, ohne den Biofilm zu berühren, eine Mehrkanal-Pipette.
    4. In 4 ul einer Testverbindung oder einer Kontroll Antibiotikum (50x Stammlösung) und 196 ul TSB pro Vertiefung.
    5. Inkubieren auf einem Plattenschüttler bei 200 rpm für weitere 24 h bei 37 ° C.
      Hinweis: Hier haben wir einen Schüttler mit einem 2 mm Orbit verwenden.

3. Resazurin Anfärbung Protocol für eine Rentabilitätsprüfung von Biofilmen

  1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,1 mg / ml Resazurin (0,4 mm) in sterilem PBS. Halten Sie diese Lager steril, vor Licht geschützt Belichtung und bei 4 ° C.
  2. Verdünne das Resazurin Lager 01.50 in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) in einer Endkonzentration von 20 uM zu erreichen.
  3. Übertragen Sie die gesamte planktonischen Lösung (die Biofilme in den Vertiefungen zu verlassen) sorgfältig, ohne die Biofilme zu berühren oder das Erstellen von Luftblasen, zu einem separaten, sauberen 96-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette.
  4. Waschen Sie die Biofilme einmal mit sterilem PBS mit 200 & mgr; l pro Vertiefung hinzufügen und entfernen Sie sie vorsichtig mit einem mehrkanaligen Pipette.
  5. In 200 ul der verdünnten Resazurin pro Vertiefung des Biofilms Platte mit einer mehrkanaligen Pipette.
  6. Inkubieren es in der Dunkelheit bei Raumtemperatur (RT) und 200 Umdrehungen pro Minute, für ca. 20 min schütteln, bis die unbehandelten Kontrollen Biofilm gleichmäßig rosa sind.
  7. Messen der Fluoreszenz beiλ exc = 560 nm und λ em = 590 nm mit einem Plattenlesegerät (oben Lesen).

4. Kristallviolett-Färbung Protokoll für Biomasse Quantifizierung von Biofilmen Mit der gleichen Platte wie in Schritt 3

  1. Entfernen Sie die Resazurin Fleck vorsichtig aus den Vertiefungen einer Mehrkanalpipette mit.
  2. Befestigen Sie die Biofilme mit 200 ul Methanol für 15 min.
  3. Lassen Sie die Platte der Luft trocknen für 10 min.
  4. In 190 ul von 0,02% (vol / vol, verdünnt in demineralisiertem Wasser) Kristallviolett-Lösung, vorsichtig mit einem mehrkanaligen Pipette. Vermeiden Sie die Seiten der Vertiefungen mit dem Fleck beim Pipettieren zu berühren und verhindern die Bildung von Luftblasen durch nicht die Pipette drücken Blow-out zu vervollständigen.
  5. Inkubieren Sie für 5 min bei RT.
  6. Entfernen Sie den Fleck vorsichtig mit Hilfe einer Mehrkanalpipette.
  7. Waschen Sie es zweimal mit VE-Wasser (200 & mgr; l jeder Zeit).
  8. Lassen Sie die Vertiefungen für 5 min bei RT trocknen und löse den restlichen Fleckin 96% Ethanol oder 33% Essigsäure.
  9. Inkubieren für 1 h bei RT und die Extinktion bei 595 nm abgelesen.

5. Auswertung der bakterizide Wirkung auf Planktonische Bakterien mit der gleichen Probe Platte wie für die Biofilme

  1. Messen Sie die Trübung bei 595 nm der Platte mit der planktonischen Lösung von 3,3.
  2. Stain die planktonischen Bakterien mit Resazurin von 10 ul der Resazurin Lager Hinzufügen pro Vertiefung. Gut mischen durch Pipettieren.
  3. Inkubieren es bei RT für etwa 5 Minuten in der Dunkelheit, bis die unbehandelten Kontrollen gleichmäßig rosa sind.
  4. Messen der Fluoreszenz bei λ exc = 560 nm und λ em = 590 nm.

6. Weizenkeimagglutinin Färbung für Matrix Quantifizierung und Fluoreszenzmikroskopie Imaging von Biofilmen

  1. Matrix Quantifizierung
    1. Bereiten Sie eine 5 & mgr; g / ml-Lösung von der WGA-Sonde in sterilem PBS.
    2. Verwenden Sie eine parallele Probe plate für diese Färbung. Entfernen Sie die planktonischen Lösung aus den Vertiefungen und waschen Sie einmal mit sterilem PBS (200 ul pro Vertiefung), vorsichtig mit einem mehrkanaligen Pipette, ohne die Biofilme zu berühren.
    3. In 200 ul WGA-Lösung pro Vertiefung gefärbt werden.
    4. Inkubieren bei 4 ° C für 2 Stunden in Dunkelheit.
    5. Entfernen Sie die ungebundenen Fleck durch die Vertiefungen mit 200 ul PBS dreimal gewaschen.
    6. Lassen Sie die Platte trocken für 15 min bei RT.
    7. Man löst den gebundenen Fleck in 33% Essigsäure, unter Verwendung von 200 & mgr; l pro Vertiefung.
    8. Verschließen Sie die Vertiefungen mit Streifen Kappen und beschallen sie mit einem Wasserbad Beschallungsgerät für 30 s bei RT und 40 kHz.
    9. Inkubieren der Platte für 1 h bei RT.
    10. Wiederholen Sie den Beschallungsschritt. Die Vertiefungen können zwischen den Beschallungsschritten verschlossen bleiben.
    11. Messen Sie die Fluoreszenz bei λ ex = 495 nm und λ em = 520 nm mit einem Plattenlesegerät (oben Lesen).
  2. Visualisierung der Matrix mitFluoreszenzmikroskopie
    1. Verwenden Sie das gleiche Protokoll wie oben bis Schritt 6.1.6.
    2. Nach dem Trocknungsschritt, zu visualisieren, die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop, einem FITC-Filter (oder ein anderes geeignetes grünen Anregungsfilter) verwendet.

7. Die Färbung durchführbare und toten Zellen innerhalb der Biofilme für Imaging mit Fluoreszenzmikroskopie und Quantifizierung des Signals für die Grün-zu-Rot-Verhältnis (G / R)

  1. Imaging mit Fluoreszenzmikroskopie
    1. Bereiten Sie eine Lösung jeder Sonde (eine Färbung lebender Zellen und die andere Färbung toten Zellen), nach den Richtlinien des Herstellers.
    2. Entfernen Sie die planktonischen Lösung aus den Vertiefungen und waschen Sie einmal mit sterilem PBS (200 ul pro Vertiefung) einer Mehrkanalpipette mit.
    3. In 6 ul der Färbungslösung pro Vertiefung.
    4. Die Platte in der Dunkelheit für 15 min.
    5. Vor der Mikroskopie, entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit manually mit einer Mehrkanalpipette.
    6. Erfassen Sie die Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop, beispielsweise unter Verwendung eines FITC-Filter (für grüne Fluoreszenz, lebende Zellen) oder TRITC-Filter (rote Fluoreszenz, tote Zellen).
  2. Quantifizierung des Signals als grünes-zu-Rot-Fluoreszenzverhältnis (G / R)
    1. Folgen Sie dem gleichen Protokoll wie in den Schritten 7.1.1 und 7.1.2.
    2. In 200 ul der Färbungslösung pro Vertiefung und inkubieren sie für 15 Minuten in der Dunkelheit.
    3. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Plattenleser bei Anregungs- / Emissions-Wellenlängen 485/535 nm und 485/635 für grüne und rote Fluoreszenz, bzw. (oben Lesen).

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Ergebnisse

In der vorgeschlagenen Plattform, die Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit, Biomasse und Biofilmmatrix quantifiziert. In der Arbeitssequenz (Abbildung 1), wird eine Probenplatte mit Resazurin und anschließend mit Kristallviolett gefärbt , um gleichzeitig die Auswirkungen auf die bakterielle Biofilm Lebensfähigkeit zu bewerten und auf insgesamt Biofilm Biomasse. Beide Assays können in der gleichen Platte durchgeführt nacheinander werden , weil es gezeigt wurde früher , da...

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Diskussion

Es gibt keine einzige Methode, die gleichzeitig die Wirkung einer Verbindung auf die Lebensfähigkeit messen kann, Biomasse und Biofilmmatrix. Daher besteht ein Bedarf an Assays, um die Kombination eine Wirkung auf die drei Endpunkte, vorzugsweise an einem primären Siebstufe zu detektieren.

Resazurin ist ein sehr einfaches Färbeprotokoll nur von der Zugabe des Redox-Sonde besteht. Jedoch mit der Resazurin die optimale Inkubationszeit der Biofilme Festlegung ist entscheidend für den Erfolg die...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Professor Paul Cos und LMPH, Universität Antwerpen, Belgien für seine Unterstützung während der Dreharbeiten in seinem Labor. Diese Arbeit wurde von Academy of Finland geförderten Projekte (Projekte 272.266 und 282.981) und Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finnland. Die technischen Beiträge von MSc Janni Kujala werden anerkannt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ResazurinSigma AldrichR7017
KristallviolettSigma AldrichHT90132 
Weizenkeim-Agglutinin, Alexa Fluor 488 KonjugatThermo Fisher ScientificW11261
LEBEND/TOT BacLight Molekulare SondenL7012SYTO 9 für die Färbung lebensfähiger Zellen grün und Propidiumiodid für die rote Färbung toter Zellen
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung
Trypton-Soja-AgarLab M, NeogenLAB011
Tryptin SojabrüheLab M, NeogenLAB004
F96 Well-Platte Polystyrol steril klar mit flachem BodenThermo Fisher Scientific161093
BRAND Kappen, Streifen aus 8Sigma AldrichBR781413-300EA
Branson CPX Serie UltraschallbadSigma AldrichZ769428-1EA
MultipipetteThermo Fisher Scientific
Multidrop DispenserThermo Fisher Scientific
Biomek 3000Beckman Schar
Varioskan Flash Multiplate-LesegerätThermo Fisher Scientific<
em>Staphylococcus aureusATCC Artikel-Nr.: 25923

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