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Methodenartikel

Die Messung der differentiell methylierter

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DOI:

10.3791/54838

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21. Dezember 2016

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pediartics, Omaha Children's Hospital and Medical Center, University of Nebraska Medical Center, 3Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Medicine, and Cellular and Integrative Physiology, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 4Indiana Biosciences Research Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Inselzelltod β der Entwicklung von Typ-1-Diabetes vorausgeht, und die Erkennung dieses Prozesses könnte eine frühzeitige therapeutische Intervention ermöglichen. Hier geben wir eine detaillierte Beschreibung, wie differentiell methylierte INS-DNA-Spezies in humanem Serum als Biomarker für β Zelltod gemessen werden können.

Zusammenfassung

Es wird angenommen, dass das Absterben von Inselzellen β der Pathogenese praktisch aller Formen von Diabetes zugrunde liegt und der Entwicklung von offener Hyperglykämie, insbesondere bei Typ-1-Diabetes, vorausgeht. Die Entwicklung sensitiver und zuverlässiger Biomarker für den β Zelltod kann ein frühzeitiges therapeutisches Eingreifen ermöglichen, um die Entwicklung von Diabetes zu verhindern oder zu verzögern. Kürzlich haben mehrere Gruppen, darunter auch unsere eigene, berichtet, dass zellfreie, differentiell methylierte DNA, die für Preproinsulin (INS) im Blutkreislauf kodiert, mit dem β Zelltod bei Prä-Typ-1-Diabetes und neu aufgetretenem Typ-1-Diabetes korreliert. In dieser Arbeit stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit digitaler PCR zur Messung von zellfreier INS-DNA vor, die am Cytosin an der Position -69 bp (relativ zur transkriptionellen Startstelle) differentiell methyliert ist. Wir zeigen, dass der Assay zwischen methyliertem und unmethyliertem Cytosin an Position -69 bp unterscheiden kann, über mehrere Größenordnungen linear ist, eine absolute Quantifizierung der DNA-Kopienzahlen ermöglicht und auf Proben von humanem Serum von Personen mit neu aufgetretenem Typ-1-Diabetes und krankheitsfreien Kontrollen angewendet werden kann. Das hier beschriebene Protokoll kann an jede DNA-Spezies angepasst werden, für die der Nachweis von differentiell methylierten Cytosinen gewünscht wird, sei es aus dem Blutkreislauf oder aus isolierten Zellen und Geweben, und kann eine absolute Quantifizierung von DNA-Fragmenten ermöglichen.

Einleitung

Typ - 1 - Diabetes (T1D) ist eine Autoimmunerkrankung , die durch die Zerstörung der Insulin produzierenden Inselzellen β - Zellen durch autoreaktive T - Zellen 1 gekennzeichnet ist. Die Diagnose von T1D ist in der Regel bei der Messung von Hyperglykämie (Blutzucker> 200 mg / dl) in einem schlanken, jungen Person gemacht, die mit einer Ketoazidose als Beweis für Insulinmangel darstellen könnten. Zum Zeitpunkt der Diagnose von T1D gibt es Hinweise für einen wesentlichen Verlust von β - Zellfunktion und Masse (50-90%) 2. In klinischen Studien wurden mehrere immunmodulatorischen Medikamente, die zum Zeitpunkt der Diagnose eingeleitet wurden führte zur Stabilisierung der β-Zellfunktion (und vermutlich Masse), aber keine haben in klinischer Remission der Erkrankung führte, eine Feststellung, dass die Forderung nach der Entwicklung erhöht hat von Biomarkern für frühere Erkennung der Krankheit und für die Längs Verfolgung der Wirksamkeit von Kombinationstherapien 3,4. Die Bemühungen der internationalen Konsortien, eine solchedas Human Islet Research Network Consortium s an den National Institutes of Heath 5, haben die Notwendigkeit zur Entwicklung von Biomarkern betont , dass in T1D auf β Zellstress und Tod konzentrieren.

Im Einklang mit diesen Bemühungen haben unsere Gruppe und andere kürzlich Biomarker - Assays entwickelt, die epigenetisch modifizierte DNA - Fragmente messen zirkulierenden , die von sterbenden β - Zellen 6 in erster Linie entstehen - 9. In allen veröffentlichten Assays bisher hat sich der Schwerpunkt auf die Quantifizierung des humanen kodierenden Gens Präproinsulin (INS) gewesen, der größer Grade unmethylierte CpG - Stellen in den Codierungs- und Promotorregionen im Vergleich zu anderen Zelltypen veranschaulicht. Die Befreiung von nicht - methylierten INS DNA - Fragmente wurde die Hypothese aufgestellt , als in erster Linie vom Sterben (nekrotischen, apoptotischen) β - Zellen entstehen. Unsere jüngsten Studien haben gezeigt , dass in der Jugend, Erhöhungen in sowohl unmethylierte und methylierte DNA INS an Position -69 bp (bezogen auf ter Transkriptionsstartstelle) wurden in neu einsetzende T1D beobachtet und diente zusammen als spezifische Biomarker für diese Population 6. Diese Biomarker Assays beinhalten die Isolierung von zellfreien DNA aus Serum oder Plasma unter Verwendung handelsüblicher Kits Spin, gefolgt von einer Bisulfit-Umwandlung von der isolierten DNA (an nicht-methylierte Cytosine bis uracile konvertieren, so dass methylierte Cytosine intakt).

In diesem Bericht beschreiben wir die technischen Aspekte der Serumprobe Sammlung, Isolierung von zellfreien DNA aus Serum, Bisulfitumwandlung und Leistung von Tröpfchen digitalen PCR (von nun an, digitale PCR) für differentiell methyliert INS DNA.

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Protokoll

Ethikerklärung: Die Protokolle wurden vom Indiana University Institutional Review Board genehmigt. Die Eltern der Probanden gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, und Kinder über 7 Jahren gaben ihre Zustimmung zur Teilnahme.

1. Serum-Verarbeitung

HINWEIS: Der beschriebene Assay wurde streng mit Humanserum getestet, das wie folgt isoliert wurde.

  1. Sammeln Sie Blut in einem roten oberen Blutentnahmeröhrchen (ohne Zusatzstoffe; unbeschichtet).
  2. 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen, damit sich das Gerinnsel bilden kann.
  3. Zentrifugenröhrchen bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand (Serum) in ein neues Röhrchen, das für die Serumlagerung vorgesehen ist (Schraubröhrchen aus Polypropylen, Größe abhängig von den Proben).
  4. Lagern Sie die Proben bei -80 ºC, bis sie für die DNA-Isolierung bereit sind.

2. Serum-DNA-Extraktion

HINWEIS: Die DNA wird mit einem DNA-Extraktionskit mit 50 μl Serum (empfohlen) extrahiert, wobei das Protokoll des Herstellers mit einigen Änderungen

eingehalten wird.
  1. Bereiten Sie 200 μl Lysepuffer + 1 μl Poly(A) (5 μg) pro Probe in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor. 15 Sek. lang vortexen. Bis Schritt 2.3 beiseite stellen.
  2. Nehmen Sie Serumproben aus dem -80 ºC Gefrierschrank und tauen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Erhöhen Sie das Serumprobenvolumen auf insgesamt 200 μl mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, mit Calciumchlorid und Magnesiumchlorid).
  3. Die Probe wird lysiert, indem der Probe 20 μl Protease (1,4 Anson-Einheiten/ml) zugesetzt werden, gefolgt von 200 μl Lysepuffer/PolyA-Mischung (aus Schritt 2.2) und 8 Sekunden lang vortexen. Die Probe wird 10 Minuten lang bei 56 °C inkubiert, dann 7 Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge (>10.000 x g) kurz zentrifugiert.
  4. Ausfällung der DNA durch Zugabe von 230 μl 100 % Ethanol zur Probe und 8 Sekunden lang vortexen. 7 Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit (>10.000 x g) kurz zentrifugieren.
  5. Tragen Sie die DNA auf die Spin-Säule auf, indem Sie 600 μl Probenmischung in die Mini-Spin-Säule geben. Bei 6.000 x g 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Durchfluss und stellen Sie die Säule in ein sauberes Rohr.
  6. Waschen Sie die DNA, indem Sie 500 μl Waschpuffer 1 in die Säule geben. Bei 6.000 x g 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Durchfluss und stellen Sie die Säule in ein sauberes Rohr. 500 μl Waschpuffer 2 in die Säule geben und bei Höchstgeschwindigkeit (>10.000 x g) 3 min zentrifugieren. Setzen Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein und zentrifugieren Sie erneut 1 Minute lang mit Höchstgeschwindigkeit.
  7. Eluieren Sie die DNA, indem Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen legen und 60 μl Elutionspuffer direkt auf den Filter geben. Es ist wichtig, die Spitzen zwischen den Proben zu wechseln, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, dann 1 min bei 6.000 x g zentrifugieren. Fügen Sie weitere 60 μl Elutionspuffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 6.000 x g für 1 min.
  8. Lagern Sie die DNA für die spätere Verwendung bei -20 ºC oder fahren Sie sofort mit der Bisulfitumwandlung fort.

3. Bisulfit-Umwandlung

HINWEIS: Die Bisulfit-Umwandlung wird mit einem Bisulfit-Umrüstsatz durchgeführt, der dem Protokoll des Herstellers mit einigen Änderungen folgt.

  1. Um unmethylierte Cytosine in Uracile umzuwandeln, geben Sie 130 μl Bisulfit-Umwandlungsreagenz zu 20 μl DNA aus Schritt 2.7 in ein PCR-Röhrchen (einzelnes 0,2-ml-PCR-Röhrchen oder 8-Streifen-PCR-Röhrchen). Bewahren Sie die restlichen 40 μl DNA für die zukünftige Verwendung oder die Verwendung in Replikatreaktionen auf. 20 Mal mischen, indem Sie auf und ab pipettieren und kurz zentrifugieren, um sicherzustellen, dass keine Tropfen an den Seiten oder am Deckel sind. In einem Wasserbad oder Thermocycler wie folgt inkubieren: 98 °C für 8 min, 54 °C für 60 min, 4 °C für 5 min.
    1. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort oder lagern Sie es bis zu 20 Stunden bei 4 °C.
  2. Geben Sie 600 μl Bindungspuffer in die Spin-Säule und legen Sie die Säule in das mitgelieferte Auffangröhrchen. Tragen Sie die bisulfitierte DNA auf die Säule auf und mischen Sie, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren. Bei Höchstgeschwindigkeit (>10.000 x g) 30 Sekunden lang zentrifugieren. Durchfluss verwerfen.
  3. Waschen Sie die DNA, indem Sie 100 μl Waschpuffer in die Säule geben und 30 Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit (>10.000 x g) zentrifugieren.
  4. Führen Sie eine Desulfonierung durch, um die Sulfonatgruppe zu entfernen, um die Umwandlung von unmethylierten Cytosinen in Uracil abzuschließen, indem Sie der Säule 200 μl Desulphonationspuffer hinzufügen. 20 min bei Raumtemperatur ziehen lassen, dann 30 Sekunden lang bei Höchstgeschwindigkeit (>10.000 x g) zentrifugieren.
  5. Waschen Sie die DNA, indem Sie 200 μl Waschpuffer in die Säule geben und 30 Sekunden lang bei voller Geschwindigkeit zentrifugieren. Entsorgen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie diesen Waschschritt.
  6. Setzen Sie die Säule in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein. Eluieren Sie DNA, indem Sie 10 μl Elutionspuffer direkt in den Säulenfilter geben. 1 Min. inkubieren. Zentrifugieren Sie 30 s lang bei voller Geschwindigkeit, um die DNA zu eluieren. Quantifizierung der wiedergewonnenen DNA durch Spektrophotometrie bei A260.
    HINWEIS: Die durch Spektrophotometrie detektierte DNA stellt in erster Linie die Träger-PolyA-DNA dar, die in Schritt 2.3 oben hinzugefügt wurde. Typischerweise beträgt die Wiederfindung von PolyA ≥85 % des Eingangs (>4,25 μg).
  7. Lagern Sie die DNA bei -20 °C, bis Sie mit der digitalen PCR fortfahren können.

4. Digitale Multiplex-PCR

  1. Erstellen Sie einen Mastermix mit genügend Lösung für jedes Sample und jede Kontrolle. Mindestens eine Probe, die Wasser enthält (Negativkontrolle), eine Probe eines Plasmids, das unmethyliertes INS enthält (1 pg, Positivkontrolle), eine Probe eines Plasmids, das methyliertes INS enthält (1 pg, Positivkontrolle), und eine Probe, die eine 1:1-Mischung von Plasmiden enthält.
    1. Zur Herstellung des PCR-Mastermixes fügen Sie 12,5 μl pro Reaktion PCR-Puffer (z. B. 125 μl pro 10 Proben), 1,25 μl pro Reaktionsprimer/Sonden-Mix (z. B. 12,5 μl pro 10 Proben), 8,25 μl pro Reaktionswasser (z. B. 82,5 μl pro 10 Proben), 0,5 μl pro Reaktion EcoR1-Enzym (z. B. 5 μl pro 10 Proben).
      HINWEIS: Die hier verwendeten Primer und Sonden sind wie folgt: Forward Primer: 5'-GGAAATTGTAGTTTTTTTTTTAGTTATTTGT-3'; Rückseitige Grundierung: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; FAM-Sonde: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; VIC-Sonde: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
  2. Richten Sie die Multiplex-PCR-Reaktion in einer 96-Well-Platte ein. Geben Sie 19,5 μl Mastermix in jede Vertiefung. Geben Sie 2,5 μl Bisulfit-umgewandelte DNA-Probe in jede geeignete Vertiefung (bewahren Sie die restlichen 7,5 μl Bisulfit-umgewandelte DNA auf oder verwenden Sie sie in Replikatreaktionen). Mischen Sie, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.
    HINWEIS: Alle 8 Vertiefungen in einer Reihe müssen eine Proben- oder Pufferkontrolle enthalten.
  3. Versiegeln Sie mit einer Folienversiegelung mit einem Plattenversiegeler und zentrifugieren Sie in einem Plattenschleuder, bis sich keine Flüssigkeit mehr an den Seiten der Vertiefungen befindet.
  4. Richten Sie den automatischen Tröpfchengenerator auf dem Touchscreen ein.
    HINWEIS: Alle 8 Vertiefungen in der Kartusche müssen eine Proben- oder Pufferkontrolle enthalten.
    1. Legen Sie die Anzahl der zu verwendenden Zeilen fest, indem Sie die Zeile(n) berühren, in die die Proben auf der 96-Well-Platte aus Schritt 4.2 geladen werden, und markieren Sie die Zeile blau, um eine aktive Reihe anzuzeigen.
    2. Laden Sie Verbrauchsmaterialien von hinten nach vorne, um Kontaminationen zu vermeiden. Fügen Sie zunächst Kartuschen in der hinteren Reihe des Instruments hinzu. Legen Sie die Spitzen in die mittlere Reihe des Instruments.
      HINWEIS: Die Patronen können nur in der richtigen Ausrichtung in die Halterungen passen.
    3. Setzen Sie die 96-Well-Platte in das Gerät ein. Nehmen Sie einen kalten Block aus dem -20 °C-Gefrierschrank und setzen Sie eine neue 96-Well-Platte mit Rand hinein. Platzieren Sie es im Gerät neben der mit der Probe bestückten 96-Well-Platte.
    4. Geben Sie Öl in den Spender an der Vorderseite des Geräts. Wählen Sie die Ölsorte auf dem Touchscreen aus.
    5. Berühren Sie die blaue Starttaste, um den Lauf zu starten. Bestätigen Sie die Einrichtung der Platte und berühren Sie die Start-Run-Taste, um zu beginnen.
  5. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die 96-Well-Platte, die die neu gebildeten Tröpfchen enthält, und versiegeln Sie sie mit einer Folienversiegelung mit einem Plattenversiegeler.
  6. Führen Sie die PCR10 auf einem Thermocycler mit folgendem Programm durch: 95 °C für 10:00 min; 40 Zyklen bei: 94 °C für 00:30 min, 57,5 °C für 01:00 min; 98 °C für 10:00 min; 12 °C für 10 min oder bis zu 24 Stunden.
  7. Legen Sie die Platte auf den Tröpfchenleser und richten Sie den Leser ein.
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte Setup. Öffnen Sie eine neue Vorlage, indem Sie auf Vorlage > neu klicken. Geben Sie einen Dateinamen ein.
    2. Verwenden Sie den Well-Editor, um die Parameter für jede Probe festzulegen. Geben Sie jedem Sample einen eindeutigen Namen, stellen Sie das Experiment auf Rare Event Detection (R-RED) und den Master-Mix auf den in Schritt 4.1 verwendeten Mix ein.
    3. Geben Sie Ziel 1 einen Namen (d. h. unmethyliert) und setzen Sie Ziel 1 auf unbekannt (U). Geben Sie Ziel 2 einen Namen (d. h. methyliert) und setzen Sie Ziel 2 als Referenz (R).
    4. Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen, um die Ausführung zu starten. Wählen Sie im Fenster mit den Ausführungsoptionen die Nachweischemie (FAM/VIC) aus.

5. Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Ergebnisse auf der Registerkarte "Analysieren" und analysieren Sie mit einem 2D-Diagramm auf der Grundlage positiver Kontrollen (siehe Abbildung 1).
  2. Exportieren Sie die vom Droplet-Reader generierte CSV-Datei zur Datenanalyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
  3. Um "Kopien pro μl" Serum zu erzeugen, verwenden Sie die Formel: (Konzentration*250)/(Volumen des für die DNA-Isolierung verwendeten Serums in μl). 6
    HINWEIS: Die Daten werden in der Regel in log10 konvertiert, wenn sie aus Humanserum gewonnen werden, um eine Normalverteilung zu gewährleisten. Alternativ können die Daten auf einer logarithmischen10-Skala dargestellt und durch nicht-parametrische Statistiken analysiert werden.

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Ergebnisse

Um Daten in geeigneter Weise zu interpretieren, verwenden wir Plasmid - Kontrollen sowohl für die unmethylierte und methylierte Ziel INS DNA in jeder digitalen PCR - Lauf. Diese Kontrollen stellen sicher, dass Signale an methylierter und nicht methylierter DNA entsprechen, sind klar zu unterscheiden. Abbildung 1 zeigt die 2-D Streudiagramme zu Tröpfchen für Plasmid Kontrollen enthält Bisulfit umgewandelt unmethylierte INS DNA (1A) entsp...

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Diskussion

Die Methylierung von Cytosin durch DNA-Methyltransferasen ermöglicht die epigenetische Kontrolle der Transkription bei vielen Genen. Das INS - Gen beim Menschen wird fast ausschließlich in islet β - Zellen exprimiert, und es scheint Silencing seiner Transkriptions 11 eine Korrelation zwischen der Häufigkeit der Methylierung von Cytosin in dem INS - Gen zu sein. Als solches zeigen die meisten Zelltypen wesentlich höhere Frequenzen der Methylierung des INS - Gen an verschiedenen Cytos...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Institutes of Health Grant UC4 DK104166 (an RGM). Wir möchten uns für die Unterstützung des Indiana Diabetes Research Center Translation Core bedanken, der durch den Zuschuss P30 DK097512 der National Institutes of Health unterstützt wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Roter Top Vacutainer Beckon Dickinson366441ohne Zusatzstoffe, unbeschichtete Innenseite, 10 ml
KryoröhrchenSimportT310-3APolypropylen, Röhrchen mit Schraubverschluss, jede Größe
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51106
Poly(A)SigmaP9403ungeliebt in TE-Puffer (10 mM Tris-Cl pH 8,0 + 1 mM EDTA) bis 5 &; Mikro; g/µ l 
Absolute Ethanol (200 Proof)Fisher ScientificBP2818-500
DPBS (mit CaCl2 und MgCl2)SigmaD8662
0,2 ml PCR 8-Streifen RöhrchenMidSciAVST
8-Streifen Kappen, DomeMidSci AVSTC-N
EZ DNA Methylierung-Lightning KitZymoD5031
ddPCR Supermix für Sonden (ohne dUTP)Biorad1863024
Pufferkontrolle für SondenBiorad1863052
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe MixLife TechnologiesAH21BH1
EcoR1New England BiolabsR0101L
twin.tec PCR Plate 96, Eppendorf951020346
Durchstechbare Folien-HeißsiegelungBiorad1814040
PX1 PCR-PlattenversiegelungBiorad1814000
QX200 AutoDG Tröpfchen-Digital-PCR-SystemBiorad1864101
automatisiertes Tröpfchenerzeugungsöl für SondenBiorad186-4110
DG32 Kartusche für automatisierten TröpfchengeneratorBiorad186-4108
Pipettenspitzen für den automatischen TröpfchengeneratorBiorad186-4120
Pipettenspitzenbehälter für den automatischen TröpfchengeneratorBiorad186-4125
C1000 Touch Thermal CyclerBiorad1851197
QX200 TröpfchenleserBiorad186-4003
ddPCR Tröpfchenleser ÖlBiorad186-3004
mit halbem Rand

Referenzen

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