Inselzelltod β der Entwicklung von Typ-1-Diabetes vorausgeht, und die Erkennung dieses Prozesses könnte eine frühzeitige therapeutische Intervention ermöglichen. Hier geben wir eine detaillierte Beschreibung, wie differentiell methylierte INS-DNA-Spezies in humanem Serum als Biomarker für β Zelltod gemessen werden können.
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Methodenartikel
Die Messung der differentiell methylierter
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es wird angenommen, dass das Absterben von Inselzellen β der Pathogenese praktisch aller Formen von Diabetes zugrunde liegt und der Entwicklung von offener Hyperglykämie, insbesondere bei Typ-1-Diabetes, vorausgeht. Die Entwicklung sensitiver und zuverlässiger Biomarker für den β Zelltod kann ein frühzeitiges therapeutisches Eingreifen ermöglichen, um die Entwicklung von Diabetes zu verhindern oder zu verzögern. Kürzlich haben mehrere Gruppen, darunter auch unsere eigene, berichtet, dass zellfreie, differentiell methylierte DNA, die für Preproinsulin (INS) im Blutkreislauf kodiert, mit dem β Zelltod bei Prä-Typ-1-Diabetes und neu aufgetretenem Typ-1-Diabetes korreliert. In dieser Arbeit stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll mit digitaler PCR zur Messung von zellfreier INS-DNA vor, die am Cytosin an der Position -69 bp (relativ zur transkriptionellen Startstelle) differentiell methyliert ist. Wir zeigen, dass der Assay zwischen methyliertem und unmethyliertem Cytosin an Position -69 bp unterscheiden kann, über mehrere Größenordnungen linear ist, eine absolute Quantifizierung der DNA-Kopienzahlen ermöglicht und auf Proben von humanem Serum von Personen mit neu aufgetretenem Typ-1-Diabetes und krankheitsfreien Kontrollen angewendet werden kann. Das hier beschriebene Protokoll kann an jede DNA-Spezies angepasst werden, für die der Nachweis von differentiell methylierten Cytosinen gewünscht wird, sei es aus dem Blutkreislauf oder aus isolierten Zellen und Geweben, und kann eine absolute Quantifizierung von DNA-Fragmenten ermöglichen.
Einleitung
Typ - 1 - Diabetes (T1D) ist eine Autoimmunerkrankung , die durch die Zerstörung der Insulin produzierenden Inselzellen β - Zellen durch autoreaktive T - Zellen 1 gekennzeichnet ist. Die Diagnose von T1D ist in der Regel bei der Messung von Hyperglykämie (Blutzucker> 200 mg / dl) in einem schlanken, jungen Person gemacht, die mit einer Ketoazidose als Beweis für Insulinmangel darstellen könnten. Zum Zeitpunkt der Diagnose von T1D gibt es Hinweise für einen wesentlichen Verlust von β - Zellfunktion und Masse (50-90%) 2. In klinischen Studien wurden mehrere immunmodulatorischen Medikamente, die zum Zeitpunkt der Diagnose eingeleitet wurden führte ....
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Protokoll
Ethikerklärung: Die Protokolle wurden vom Indiana University Institutional Review Board genehmigt. Die Eltern der Probanden gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, und Kinder über 7 Jahren gaben ihre Zustimmung zur Teilnahme.
1. Serum-Verarbeitung
HINWEIS: Der beschriebene Assay wurde streng mit Humanserum getestet, das wie folgt isoliert wurde.
- Sammeln Sie Blut in einem roten oberen Blutentnahmeröhrchen (ohne Zusatzstoffe; unbeschichtet).
- 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen, damit sich das Gerinnsel bilden kann.
- Zentrifugenröhrchen bei 2.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstan....
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Ergebnisse
Um Daten in geeigneter Weise zu interpretieren, verwenden wir Plasmid - Kontrollen sowohl für die unmethylierte und methylierte Ziel INS DNA in jeder digitalen PCR - Lauf. Diese Kontrollen stellen sicher, dass Signale an methylierter und nicht methylierter DNA entsprechen, sind klar zu unterscheiden. Abbildung 1 zeigt die 2-D Streudiagramme zu Tröpfchen für Plasmid Kontrollen enthält Bisulfit umgewandelt unmethylierte INS DNA (1A) entsp.......
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Diskussion
Die Methylierung von Cytosin durch DNA-Methyltransferasen ermöglicht die epigenetische Kontrolle der Transkription bei vielen Genen. Das INS - Gen beim Menschen wird fast ausschließlich in islet β - Zellen exprimiert, und es scheint Silencing seiner Transkriptions 11 eine Korrelation zwischen der Häufigkeit der Methylierung von Cytosin in dem INS - Gen zu sein. Als solches zeigen die meisten Zelltypen wesentlich höhere Frequenzen der Methylierung des INS - Gen an verschiedenen Cytos.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Institutes of Health Grant UC4 DK104166 (an RGM). Wir möchten uns für die Unterstützung des Indiana Diabetes Research Center Translation Core bedanken, der durch den Zuschuss P30 DK097512 der National Institutes of Health unterstützt wird.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Roter Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | ohne Zusatzstoffe, unbeschichtete Innenseite, 10 ml |
| Kryoröhrchen | Simport | T310-3A | Polypropylen, Röhrchen mit Schraubverschluss, jede Größe |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | ungeliebt in TE-Puffer (10 mM Tris-Cl pH 8,0 + 1 mM EDTA) bis 5 &; Mikro; g/µ l |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (mit CaCl2 und MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0,2 ml PCR 8-Streifen Röhrchen | MidSci | AVST | |
| 8-Streifen Kappen, Dome | MidSci AVSTC-N | ||
| EZ DNA Methylierung-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix für Sonden (ohne dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Pufferkontrolle für Sonden | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe Mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, Eppendorf | 951020346 | ||
| Durchstechbare Folien-Heißsiegelung | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR-Plattenversiegelung | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Tröpfchen-Digital-PCR-System | Biorad | 1864101 | |
| automatisiertes Tröpfchenerzeugungsöl für Sonden | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Kartusche für automatisierten Tröpfchengenerator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipettenspitzen für den automatischen Tröpfchengenerator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipettenspitzenbehälter für den automatischen Tröpfchengenerator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Tröpfchenleser | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Tröpfchenleser Öl | Biorad | 186-3004 |
Referenzen
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., E....
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Nachdrucke und Genehmigungen
