Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Zusammenfassung

Es wurde ein Echtzeit-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um gleichzeitig (1) eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, die auf einen intrazellulären bakteriellen Krankheitserreger abzielen, und (2) die Zytotoxizität eukaryotischer Zellen zu bewerten. Eine Variation der gleichen Technologie wurde anschließend mit digitaler Dosiertechnologie kombiniert, um einfache, hochauflösende Dosis-Wirkungs-Studien sowie zwei- und dreidimensionale Synergiestudien zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Traditionelle Maßnahmen der intrazellulären antimikrobielle Aktivität und eukaryotische Zelle Zytotoxizität vertrauen auf Endpunkt-Assays. Solche Endpunktassays erfordern mehrere zusätzliche experimentelle Schritte vor, wie Zelllyse auszulesen, koloniebildende Einheit Bestimmung oder Reagenzzugabe. Wenn Tausende von Assays, beispielsweise während des Hochdurchsatz-Screening durchgeführt wird, die stromabwärts Aufwand für diese Arten von Assays erforderlich ist, ist beträchtlich. Daher Hochdurchsatz antimikrobielle Entdeckung zu erleichtern, haben wir ein Echtzeit-Test, um gleichzeitig Inhibitoren der intrazellulären Bakterienwachstums identifizieren und eukaryotischen Zell-Cytotoxizität zu bewerten. Insbesondere wurde das Bakterienwachstum intrazellulärem Echtzeit - Detektion von Markierungs bakterielle Screening Stämme aktiviert entweder mit einem bakteriellen lux - Operon ^(1. Generation assay) oder fluoreszierendes Protein Reporter (2 ^nd Generation, orthogonal assay). Eine nicht-toxische, Zellmembran-impermeante, nukleinsäurebindende Farbstoffwurde auch während der anfänglichen Infektion von Makrophagen aufgenommen. Diese Farbstoffe werden aus lebenden Zellen ausgeschlossen. Allerdings nicht lebensfähigen Wirtszellen verlieren die Integrität der Membran erlauben Eintritt und Fluoreszenzmarkierung von Kern-DNA (Desoxyribonukleinsäure). Bemerkenswerterweise ist DNA-Bindung mit einer starken Zunahme der Fluoreszenzquantenausbeute verbunden, die eine lösungsbasierte Auslesen der Wirtszelle Tod liefert. Wir haben dieses kombinierten Assay verwendet ein Hochdurchsatz-Bildschirm in Mikroplattenformat durchzuführen, und die intrazelluläre Wachstum und die Zytotoxizität durch Mikroskopie zu bewerten. Bemerkenswerterweise zeigen können antimikrobielle Mittel Synergie in denen die kombinierte Wirkung von zwei oder mehreren antimikrobiellen Mitteln, wenn sie zusammen angewendet ist größer als bei getrennter Anwendung. Die Prüfung auf in vitro Synergie gegen intrazelluläre Erreger ist in der Regel eine ungeheure Aufgabe als kombinatorische Permutationen von Antibiotika in verschiedenen Konzentrationen zu beurteilen ist. Allerdings fanden wir, dass unsere Echtzeit-Test kombiniert mit automatisierten, digitalen Dosiertechnik pfacile Synergie Test ermitted. Mit diesen Ansätzen konnten wir systematisch Wirkung einer großen Anzahl von antimikrobiellen Mitteln vermessen allein und in Kombination gegen das intrazelluläre Pathogen Legionella pneumophila.

Einleitung

Pathogene, die wachsen oder sich dort aufhalten vorübergehend in intrazellulären Kompartimenten sind schwer zu therapeutisch auszurotten. Obligat oder relativ intrazelluläre Erreger obligat wie Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, spp Brucella. , Francisella tularensis und Mycobacterium spp. erfordern oft Kurse der antimikrobiellen Therapie zur Heilung verlängert, die von Monaten sogar Jahre reichen. Darüber hinaus können extrazelluläre Erreger transient intrazellulären Nischen besetzen und auf diese Weise der Freigabe durch normalen Kurse der antimikrobiellen Therapie entkommen und später entstehen neue Run....

Protokoll

1. Echtzeit intrazelluläres Wachstum und eukaryotischen Zelle Zytotoxizitätstest

1. Vorbereiten Wirtszellen (J774A.1 Zellen)
   1. Kultur J774A.1 Mus musculus Makrophagen-ähnlichen Zellen in Suspension in RPMI 1640 mit 9% Eisen ergänzt Kälberserum. Zunächst Passage in Zellkulturflaschen. Nachdem die Zellen konfluent in einem 75 cm ² Gewebekulturkolben in 15 ml Medium geworden sind, geteilt durch Abkratzen und Verdünnen auf 65 ml mit dem gleichen Typ des Mediums, von denen 15 ml in die Gewebekulturkolben zurückgeführt wird , und 50 ml transferiert in einen 250 ml Bakterien Schüttelkolben.
   2. Für Scale-up-Kultur in Suspension in 25....

Ergebnisse

Intrazellulärer Wachstumsassay in Mikrotiterplatten

Abbildung 1 veranschaulicht die Assayschritte. Die dargestellten automatisierten Schritte können manuell durchgeführt werden. Der Durchsatz wird jedoch erheblich durch die Verwendung von Flüssigkeitsmanagementsystemen erleichtert.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse aus einem .......

Diskussion

Wir beschreiben Echtzeit-Assays zum gleichzeitigen Nachweis des intrazellulären Bakterienwachstums und der Zytotoxizität der Wirtszelle. Das Protokoll enthält mehrere kritische Schritte. Erstens muss für eine robuste Assay-Leistung eine ausreichende spektrale Trennung zwischen bakteriellen und zytotoxischen Messwerten vorhanden sein. Eine solche Trennung ist intrinsisch für Kombinationen von Luciferase-Operon-Reportern und fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoffen. Basierend auf unseren Erfahrungen (Tabelle 1-3<.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
J774A.1 Zellen	American Type Culture Collection	TIB-67	Wirtszelle
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefe-Extrakt-Medium
Hefeextrakt, ultrafiltriert	Becton-Dickinson/Difco	210929	Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefeextrakt-Medium; niedrigere Qualitäten können das Wachstum beeinträchtigen und/oder die Empfindlichkeit von Legionellen gegenüber Wachstumshemmern verändern
Alpha-Ketoglutarsäure, Monokaliumsalz	Sigma-Aldrich	K2000	Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefe-Extrakt-Medium
Natriumpyruvat	Sigma-Aldrich	P5280	Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefeextraktmedium
Kaliumphosphat, zweibasig	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefeextraktmedium
L-Cystein	Sigma-Aldrich	C-7755	Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefeextraktmedium
Ammoniumeisen(III)-citrat	Sigma-Aldrich	F5879	Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefe-Extrakt-Medium; Eisenpyrophosphat kann stattdessen verwendet werden, ist aber schwieriger genau abzuwiegen
Kaliumhydroxidlösung, konzentriert	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefe-Extrakt-Agar und gepuffertem Hefe-Extraktmedium
Deonisiertes Wasser	N/A	N/A	Zur Herstellung von gepuffertem Aktivkohle-Hefeextrakt-Agar und gepuffertem Hefe-Extrakt-Medium
Thymidin (Gewebekulturqualität)	Sigma-Aldrich	T1895	Zur Ergänzung von RPMI 1640 und gepuffertem Hefeextrakt Agar/Medium — Thymidin niedrigerer Qualität kann für letzteres verwendet werden, kann jedoch zu einem beeinträchtigten Zellwachstum und/oder Zelltod führen RPMI 1640
RPMI 1640, Standardformulierung	Corning über Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Für die Züchtung von J774A.1-Zellen vor der Beschichtung; enthält 2 mM L-Glutamin
RPMI 1640 ohne phenolrotes	Corning über Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Zum Plattieren von J774A.1-Zellen in 384-Well-Schalen (nicht geeignet für das Wachstum vor dem Plattieren); fehlt auch L-Glutamin — Ergänzung zu 2 mM vor Gebrauch
L-Glutamin, 200 mM in 0,85 % NaCl (Gewebekulturqualität)	HyClone über Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Zur Ergänzung von RPMI 1640 ohne L-Glutamin, bis 2 mM Endkonzentration
Eisenhaltiges Kälberserum	Gemini Bioproducts	100-510	Zur Ergänzung von RPMI 1640, bis 9,1 % Endkonzentration
Trypanblau-Lösung	Sigma-Aldrich	T8154	Zur Färbung zur Bestimmung des Zelltods von J774A.1 beim Zählen der Zelldichte
SYTOX Green, 5 mM Lösung in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Zur Färbung zur Bestimmung des Zelltods von J774A.1 mittels Fluoreszenzmessung oder Epifluoreszenzmikroskopie (in Verbindung mit orange-rot oder dunkelrot fluoreszierenden Bakterien). Bei einer Endkonzentration von 125 nM verwenden.
Zellkultur-Inkubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Für die Inkubation von J774A.1-Zellen (sowohl vor als auch nach der Infektion); kann auch für die Inkubation von Bakterien verwendet werden, oder es kann ein Inkubator mit Standardatmosphäre verwendet werden)
Orbitalschüttler	BellCo Glass	7744-01010	Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der Infektion; passt in den Zellkultur-Inkubator; inklusive Schüttelbasis 7744-01000 und Tablett 7740-01010 (diese sind auch separat erhältlich)
Schüttelkolben (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der Infektion
Schüttelklemmen für Kolben (250 ml)	BellCo Glas	7744-16250	Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der Infektion
Schüttelkolben (1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der Infektion
Schüttelklemmen für Kolben (1.000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der
Infektion Schwammschaumkappen für Kolben (250 ml-1.000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Zum Schütteln der Inkubation von J774A.1-Zellen vor der Infektion; reduziert das Kontaminationsrisiko im Vergleich zu Standard-Metallkappen
MultiDrop Combi programmierbare Mehrkanal-Peristaltikpumpe	Thermo Fisher Scientific	5840300	Zum Dispensieren von J774A.1-Zellen, Medium und bakterieller Suspension, die Fluorophore enthalten, an eine große Anzahl von 384-Well-Schalen
Kombi-Verteiler mit Standardbohrung	Thermo Fisher Scientific	24072670	Standardmäßiges Predispense-Volumen von 20 μ l ist nicht ausreichend, um das Absetzen zu kompensieren — Erhöhung auf 80 μ l
Weiße 384 Well-Schalen, behandelt für Gewebekulturen	Corning	3570	Zum Lesen von Lumineszenz und Fluoreszenz; Greiner Katalog # 781080 ebenfalls erfolgreich getestet
DMSO (Gewebekulturqualität, in verschlossenen Ampullen)	Sigma-Aldrich	D2650	Zum Auflösen von Positivkontroll- und Testverbindungen
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotika-Positivkontrolle
Saponin (aus Quillaja-Rinde)	Sigma-Aldrich	S-4521	Zytotoxizitäts-Positivkontrolle
Mehrkanalpipette	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	Für den Transfer von festen Mengen positiver Kontrollverbindungen; Pipettierer muss über eine digitale Dispensierung mit Arretierung verfügen, um eine wiederholte Dosierung mit festem Volumen zu ermöglichen
Epson Pin-Transferroboter	Epson/ICCB-L	(kundenspezifische Ausrüstung)	Für den Transfer von festen Mengen von Testverbindungen aus Bibliotheksarrays
D300 digitales Dispensiersystem	Hewlett-Packard über Tecan	D300	Für den Transfer variabler Mengen von Testverbindungen von 11 Pikolitern bis 10 & Mikro; l
T8+ Kartuschen für das digitale Dosiersystem D300	Hewlett-Packard über Tecan	T8+	Für die Abgabe von Testverbindungen
Epifluoreszenzmikroskop mit computergebundener Digitalkamera	Nikon	Ti	Für die Bildgebung lebender Zellen; jedes Standard-Fluoreszenzmikroskop kann mit Phasenkontrast- oder DIC-Optiken, die grüne (Fluorescein), orangerote bis rote (Texas Red) und dunkelrote (Cy5) Fluoreszenz mit 100-fachem Öl abbilden können, ersetzen Objektiv für höchste Auflösung
Gewebekulturschalen mit Glasboden	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Für die Bildgebung lebender Zellen. Schüsseln wie die MatTek ermöglichen eine mikroskopische Visualisierung bei 600-facher oder 1.000-facher Vergrößerung durch den Einsatz eines inversen Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskops. Diese speziellen Schalen haben einen Nenndurchmesser von 3,5 cm, einen Innendurchmesser von 3,3 cm, mit Abdeckgläsern mit einem Durchmesser von 20 mm Durchmesser #1,5, die in die Böden eingesetzt sind.
Photoshop CS6	Adobe		, Adobe Photoshop oder ähnliche Programme können verwendet werden, um Lichtmikroskopische und fluoreszierende Bilder zu pseudofärben und zusammenzuführen.
Mathematica 10	Wolfam		Zur Erzeugung von zweidimensionalen isokonturalen Isobologrammen und dreidimensionalen Oberflächenisobologrammen.

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