Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Pathogene, die wachsen oder sich dort aufhalten vorübergehend in intrazellulären Kompartimenten sind schwer zu therapeutisch auszurotten. Obligat oder relativ intrazelluläre Erreger obligat wie Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, spp Brucella. , Francisella tularensis und Mycobacterium spp. erfordern oft Kurse der antimikrobiellen Therapie zur Heilung verlängert, die von Monaten sogar Jahre reichen. Darüber hinaus können extrazelluläre Erreger transient intrazellulären Nischen besetzen und auf diese Weise der Freigabe durch normalen Kurse der antimikrobiellen Therapie entkommen und später entstehen neue Runden von virulenten Infektion zu starten. Staphylococcus aureus ¹ und uropathogene Enterobacteriaceae ^2,3 - Infektionen sind zwei Beispiele zunehmend erkannt. Daher ist eine grundlegende Drug Discovery Ziel Roman antimikrobielle Substanzen zu identifizieren, die in intrazelluläre Kompartimente eindringen. Optimale Therapie, um schnell zu beseitigenintrazelluläre Organismen und Entwicklung von Resistenzen durch subinhibitorischen antimikrobielle Exposition verhindern, ist besonders erwünscht.

Zu diesem Zweck haben wir ein Hochdurchsatz - Screening - Technologie zu intrazellulärem-penetrierenden antimikrobielle Mittel die intrazelluläre Wachstum des Modells pathogen Targeting, Legionellen pneumophila identifizieren. ⁴ Bisherige klinische Beobachtungen zeigen , dass Standard antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung nicht genau in vivo therapeutische Wirksamkeit gegen diesen Organismus vorhersagen. Spezifisch ⁵ war dies wegen Hauptklassen von antimikrobiellen Mitteln wie β-Lactame und Aminoglykoside, obwohl hochwirksam gegen axenisch gewachsen Legionellen, nicht ausreichend nicht in die intrazellulären Kompartimente eindringen , wo Legionellen befindet. ^5,6 Später Beweise vorgeschlagen , dass technisch komplexer intrazellulären Wachstumstests effektiv klinische Wirksamkeit vorhergesagt. ⁷

Daher entwickelten wir Technologie für Echtzeit-Bestimmung der intrazellulären Bakterienwachstum. ⁶ Dies wurde durch die Verwendung eines Bakterienstammes erreicht modifiziert durch Integration von entweder einer bakteriellen Luciferase - Operon ⁸ (erste Generation Assay zuvor beschrieben) ⁴ oder fluoreszierendes Protein ⁹ Reporter (zweite Generation, orthogonal Assays hier beschrieben) in das Bakterienchromosom. Auf diese Weise Lumineszenz- oder Fluoreszenzsignal liefert ein Surrogat, Echtzeit-Auslesen von Bakterienzahl.

Allerdings sind diese Attribute nicht einen großen Störfaktor bei der intrazellulären infectio Adressen-Assays, Off-Target-Effekte auf Wirtszellen. Insbesondere begrenzt der Tod der Wirtszelle von Natur aus intrazellulären Wachstum und führt zu falschen positiven Identifizierung der antimikrobiellen Wirkung. Wie viele Verbindungen in Screening-Bibliotheken sind eukaryotische Zelle toxisch, so Fehlalarme wahr antimikrobielle Substanzen überwältigen würde, eine große Anzahl von Follow-up, Endpunkt Cytotoxizitätsassays für die Auflösung erforderlich macht.

So war es von großem Interesse eukaryotische Zelllebensfähigkeit zu bewerten zu können und das intrazelluläre Wachstum gleichzeitig. Bemerkenswert ist, ein Merkmal der nicht lebensfähigen eukaryontischen Zellen ist der Verlust der Zellmembranintegrität. Sonden, die die Durchlässigkeit der Zellmembran testen kann daher verwendet werden, die Lebensfähigkeit der Zellen zu untersuchen. Wir gekennzeichnet zuvor die Fähigkeit einer Reihe von putativ Zellmembran-impermeante, fluoreszierende DNA-bindende Farbstoffe zuzugreifen und Kern-DNA von abgestorbenen Zellen färben. ⁴ Bei der Bindung Kern - DNA, diese Farbstoffe eine starke Zunahme der Quantu anzeigenm Fluoreszenzausbeute was zu einer erhöhten Signal gegenüber dem Hintergrund Lösung Fluoreszenz. Als solche, sofern diese Farbstoffe eine quantitative Anzeige der eukaryotischen Zelltod. Bemerkenswerter ^4, fanden wir , dass mehrere waren nicht toxisch selbst während längerer Koinkubation mit J774 Makrophagen. Wenn während der Erstinfektion hinzugefügt, sofern sie eine Echtzeit-Fluoreszenz-Anzeige von eukaryotischen Zelltod, die mikroskopisch durch eine Mikrotiterplatte oder Fluorimeter beobachtet gemessen werden kann.

Daher ist es durch Verwendung eines bakteriellen Reporter kombiniert und ungiftig, Membran-impermeablen, DNA-bindende Farbstoffe, waren wir in der Lage, ein einfaches, zerstörungsfrei, Echtzeit-Assay sowohl bakterielle Belastung und eukaryotischen Zell-Cytotoxizität gleichzeitig zu messen zu entwickeln. Dieser Assay hat uns in 384-Well-Plattenformat ~ 10.000 bekannt bioactives einschließlich ~ 250 antimikrobiellen Mitteln und> 240.000 kleine Moleküle mit funktionell nicht charakterisierten Aktivität auf die Fähigkeit zur Hemmung der intrazellulären Wachstum zu screenen erlaubtLegionella pneumophila, während zur gleichen Zeit für jede Verbindung eukaryotischen Zell - Cytotoxizität Daten. ⁶ Unsere Analyse bekannter antimikrobieller Mittel gegen intrazelluläre Wachstum von Legionellen war die umfassendste Untersuchung dieser Art bisher. ⁶

Basierend auf der Effizienz unseres Testformats, erforschten wir auch anschließend die potenziell synergistische Wirkungen bekannter antimikrobieller Mittel, wenn sie in Kombination verwendet werden. Eine der häufigsten Synergietests, die so genannte Schachbrett Assay wird üblicherweise durch die Beurteilung der kombinatorischen Wirkung von zweifachen Reihenverdünnungen von zwei oder mehreren antimikrobiellen Mitteln durchgeführt. ¹⁰ In diesen Assays wird Synergie durch die Beobachtung von grßeren Effekt definiert , wenn zwei oder mehr antimikrobielle Mittel zusammen als die Summe der Wirkungen von jeweils separat aufgetragen angewendet werden. Zu beachten ist , konzentrierte sich bisher nur und selektive Synergie Test wurde gegen intrazelluläre Legionella pneumophila durchgeführt

Um Synergie Prüfung zu erleichtern, haben wir den Einsatz unserer Echtzeit - intrazellulären Wachstum / eukaryotischen Zytotoxizitätstest in Kombination mit automatisierten digitalen Dosiertechnik ^6. Diese Automatisierung erlaubt uns serielle Verdünnungen der Verbindungen in DMSO oder wässriger Lösung allein oder in Kombination in 384-Well-Format gelöst zu verzichten. ¹¹ Darüber hinaus solche robuste Liquid - Handling - Technologie erlaubt uns leicht höhere Auflösung führen zu, Quadratwurzel von zwei Kindern ( und nicht als der Standard, mit geringerer Auflösung, Verdoppelung) Verdünnung Kombinationen zu einer höheren Spezifität in unserem zweidimensionalen erreichen, schachbrett Synergie Analyse. Diese Resolution war besonders wertvoll Bedenken in der Synergie Bereich über Reproduzierbarkeit Adressierung bei der Verwendung von zweifache Verdünnungsreihe ^12. Schließlich war unser Test quantitative und auch therefore Abstufungen der Hemmung gemessen. Als Ergebnis erfasst der Test für die Vollständigkeit der inhibitorischen Informationen exprimierbar in Isokontur Isobologramme in dem kombinatorischen Konzentrationen mit ähnlichen Mengen an Wachstumshemmung Isokonturen verbinden. ⁶ Diese Plotten Strategie erlaubt die Visualisierung von kombinatorischen Dosis-Wirkungs-Kurven. Um unsere Methodik zu illustrieren, beschreiben wir unser Protokoll dieser Assays für die Durchführung und repräsentative Ergebnisse.

1. Echtzeit intrazelluläres Wachstum und eukaryotischen Zelle Zytotoxizitätstest

1. Vorbereiten Wirtszellen (J774A.1 Zellen)
   1. Kultur J774A.1 Mus musculus Makrophagen-ähnlichen Zellen in Suspension in RPMI 1640 mit 9% Eisen ergänzt Kälberserum. Zunächst Passage in Zellkulturflaschen. Nachdem die Zellen konfluent in einem 75 cm ² Gewebekulturkolben in 15 ml Medium geworden sind, geteilt durch Abkratzen und Verdünnen auf 65 ml mit dem gleichen Typ des Mediums, von denen 15 ml in die Gewebekulturkolben zurückgeführt wird , und 50 ml transferiert in einen 250 ml Bakterien Schüttelkolben.
   2. Für Scale-up-Kultur in Suspension in 250 ml und / oder 1000 ml bis zu einem Fünftel Volumen gefüllt Bakterienflaschen mit Gewebekulturmedium. Belüften, indem Rotationsgeschwindigkeit bei etwa 120 Umdrehungen pro Minute. Für ein stetiges Wachstum, genau 5% CO ₂ und 37 ° C inkubiert.
   3. Ernte Zellen , wenn sie erreichen Dichte im Bereich von 2,5 x 10 ⁶ Zellen/ ml bis 5 x 10 ⁶ Zellen / ml. Stellen Sie sicher, tote Zelle Prozentsatz (am einfachsten durch Trypan-Blau-Färbung getestet) 25% nicht überschreiten, da tote Zellen werden Hintergrundgeräusche in Zytotoxizitätstests erhöhen.
   4. Platte in weiß, Gewebekultur-behandelten 384-Well - Mikrotiterplatten mit 5 × 10 ⁴ J774A.1 - Zellen in 30 & mgr; l Gewebekulturmedium pro Vertiefung. Mikrotiterplatten über Nacht inkubieren 90% Konfluenz am Tag des Experimentes zu erreichen.
2. Vorbereiten Lumineszenz- oder Fluoreszenz - Legionella pneumophila
   1. Passage L. pneumophila (LP02 :: flaA :: Lux ⁸⁾ Bakterien auf geeigneten Medium, dh gepufferte Kohle Hefeextrakt (BCYE) Medium. Wenn ein Thymidin-auxotrophen Stamm verwenden, ergänzen Medium mit 100 ug / ml Thymidin. Bereiten Sie Patches von Bakterien, die für Experimente von Organismen dicht an einem neuen BCYE Platte und Inkubation 1 Tag verbreitet (wenn aus einer früheren Plattendurchgang) oder zwei bis drei Tage (wenn aus gefrorenem Lager) konfluent zu erhaltenWachstum.
      1. Bereiten BCYE Platten durch Lösen von 10 g Hefeextrakt, 10 g N - (2-Acetamido) -2-aminoethansulfonsäure, 0,35 g K ₂ HPO ₄ und 1 g monobasisches Kalium α-Ketoglutarat in 950 ml deionisiertem Wasser hergestellt . Passen Sie auf pH 6,9 bei Kaliumhydroxid (≥2.5 ml von 11,9 Mol-Lösung).
      2. In 15 g Agar und 2 g Aktivkohle; und bringen auf 1 l Endvolumen. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab und Autoklaven. Kühles Medium auf 55 ° C und Addier-Filter-sterilisierten Lösungen, die 0,4 g L-Cystein und 0,42 g Ammoniumeisen (III) -citrat in deionisiertem Wasser gelöst. Verwenden Magnet Rührplatte zu gießen Petrischalen vor mischen.
      3. Für die Prüfung des Wachstums von L. pneumophila in axenic Wachstumsmedium, bereiten ACES-Hefeextraktbrühe (AYE) durch alle chemischen Reagenzien für BCYE mit Ausnahme von Kohle und Agar verwendet zu kombinieren. Filter sterilisieren und sofort verwenden oder für spätere Experimente einzufrieren.
   2. Resuspendieren Organismen im same Gewebekulturmedium für J774A.1-Zellen mit 100 ug / ml Thymidin Supplementierung entsprechend verwendet.
3. Makrophagen-Infektion
   1. In Testverbindungen von Interesse (Screening-Verbindungen und positive und negative Kontrollen für die bakterielle Wachstumshemmung und eukaryotischen Zell-Lyse). Vorzugsweise Stammlösungen bei ≥500x in DMSO (Dimethylsulfoxid) oder einer wässrigen Lösung zu ermöglichen, eine ausreichende Verdünnung des Fahrzeugs zu lösen.
      1. Obwohl Stammlösungen können eingefroren gelagert werden, vermeiden Sie Frost-Tau-Zyklen für labile Verbindungen und antimikrobielle Mittel.
   2. Verdünnte Leuchtbakterien von 2,5 x 10 ⁶ CFU (koloniebildende Einheit) / m und fluoreszierende Reporter-markierten Bakterien bis 1,0 x 10 ⁷ CFU / ml in Gewebekulturmedium zum Ziel und geeigneten nicht-toxischen hinzuzufügen, membran impermeant, Nukleinsäure- bei 2,5x Endtestkonzentration bindenden Farbstoff.
   3. In 20 ul Mischung zu jeder J774A.1 Kultur gut, Endassayvolumen50 & mgr; l, letzte Bakterienkonzentration 1 × 10 ⁶ KBE / ml (lux - Operon - Reporter) oder 4 x 10 10 ⁶ KBE / ml (fluoreszierendes Protein Reporter).
   4. Bei 37 ° C inkubieren , für 1-3 Tage in 5% CO ₂ bei 100% relativer Luftfeuchtigkeit Verdunstungsrandeffekte zu vermeiden.
4. Assay Ablesbarkeit
   1. Bakterienwachstum Lesen und eukaryotische Zelltoxizität auf einem Mikroplatten-Luminometer und Fluorimeter als geeignet für Reporter verwendet wird.
      1. Um die Temperatur-assoziierten Randeffekte, thermisch äquilibrieren Mikrotiterplatten vor der Lumineszenz Lesung durch Platzierung in einer einzigen Schicht auf einem Labortisch mit Deckel halb offen für ca. 20 min (oder in einem biologischen Sicherheitsschrank mit Deckel ab ca. 10 min) zu vermeiden.
   2. Zurück Mikrotiterplatten Inkubator, wenn Echtzeit-Anzeige zu späteren Zeitpunkten erwünscht ist.

2. Datenanalyse

1. Normalisieren Daten auf positive und negative controllen Prozent zu berechnen oder Fold-Hemmung für die intrazelluläre bakterielle Wachstum und die prozentuale Zytotoxizität für eukaryotische Zellen.
2. Assay Robustheit beurteilen, Berechnen statistische Trennung zwischen den positiven und negativen Kontrollen sowohl für bakterielle Wachstumshemmung und Zytotoxizität unter Verwendung Z-Faktor (Z ') -Analyse , wobei Z' = 1-3 (σ _p + σ _n) / | & mgr; _p + & mgr; _n |. In dieser Gleichung σ _p und σ _n sind die Standardabweichungen für die positiven und negativen Kontrollvertiefungen sind; μ _p und & mgr; _n sind die Mittelwerte für die positiven und negativen Kontrollvertiefungen, respectively.
   1. Für Hochdurchsatz-Screening-Assays, berechnen Standard Z-Scores (oder eine andere Alternative, quantitative statistische Maßnahmen) Wirkungen der Testverbindungen von Interesse zu bewerten. Alternativ berechnen eine einfache Falte-Reduktion oder Log-fache Reduktion als potenziell physiologisch relevanter Maß für die Wirkung Größe für geometrisch replizierende Bakterien.

3. Single und Multi-dimensionale (dh Synergy) Dosis-Wirkungs-Prüfung und Interpretation der Daten

1. Bereiten Makrophagen und Bakterien wie in Protokollabschnitt 1 beschrieben.
2. Unmittelbar vor der Infektion oder axenischen Inkubation, antimikrobielle Mittel von experimentellen Interesse in einer seriellen hinzuzufügen Verdünnungsreihe Verdoppelung mit dem Ziel , spanning am oberen Ende mit einer Konzentration , die vollständig das Wachstum beseitigt (dh die minimale Hemmkonzentration oder MHK) und auf der Nieder Ende eine Konzentration, die keine offensichtliche Aktivität zeigt.
3. Verwenden eines automatisierten Liquid-Handling-System einzelne Dosis-Wirkungs-und kombinatorische Synergie-Test-Setup durch direkte, automatisierte Zugabe von antimikrobiellen Verdünnungen zu erleichtern dem Protokoll des Herstellers nach.
4. Betrachten wir die Verwendung von Sub-Verdopplungsverdünnungen, beispielsweise841 / 54841eq1.jpg "/> - Verdünnungsreihe falten und Test repliziert Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Daten zu erhöhen.
5. Für Makrophagen - Infektion, verdünnten Leuchtbakterien von 2,5 x 10 ⁶ CFU (koloniebildende Einheit) / ml in Gewebekulturmedium zu zielen. In 20 ul Mischung zu jeder J774A.1 Kultur gut, Endassayvolumen 50 & mgr; l, endgültige Bakterienkonzentration 1 × 10 ⁶ KBE / ml; und bei 37 ° C in 5% CO ₂ bei 100% relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert.
   1. Für axenic Wachstumstests, verdünnten Leuchtbakterien bis zu einer Endkonzentration von 1 x 10 & ^sup6 ; CFU / ml in Medium AYE, werden 50 & mgr; l in jede Vertiefung einer 384-Well - Platte und inkubiere bei 37 ° C in 5% CO ₂ bei 100% relativer Luftfeuchtigkeit.
6. Berechnen fraktionierte Inhibitor-Konzentration Index für antimikrobielle Kombinationen, die das Bakterienwachstum zu hemmen. Für jedes Medikament in der Kombination (a, b,.. N), die in vollständig oder> 99% Hemmung des Bakterien g ergibtrowth, die Berechnung der einzelnen fraktionierten inhibitorischen Konzentration (FIC _{a, b, n...)} wie folgt: FIC _a = die Konzentration der Verbindung "a" durch die minimale Inhibitor - Konzentration von "a" von selbst geteilt. _. Unter Verwendung der gleichen Formel, berechnen FIC _b, usw. Dann die kombinatorische FIC - Index berechnen oder FIC = FIC _a + _b + FIC. . .FIC _N für jede hemmende Kombination.
   1. Verwenden Sie die kombinatorischen Index, der am weitesten von 1,0 abweicht Synergien zu beurteilen. Betrachten wir ein Cutoff von ≤0.5 als konservative Angabe einer synergistischen Effekt und ≥4, eine antagonistische Wirkung. ¹²
   2. Plot Isobologramme, Isokontur Isobologramme und / oder Isofläche Isobologramme ⁶ als alternative grafische Darstellungen von kombinatorischen Wirkungen.

Intrazellulärer Wachstumstest für Mikroplatten

Abbildung 1 stellt die Assay-Schritte dar. Die gezeigten automatisierten Schritte können manuell ausgeführt werden. Der Durchsatz wird jedoch durch den Einsatz von Liquid-Handling-Systemen erheblich erleichtert.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse eines 384-Well-Mikrotiterplatten-Assays, Dual-Readout, Echtzeit-Intrazelluläres Wachstum und eukaryotische Zellzytotoxizität unter Verwendung eines Legionellenstamms (Lp02), der entweder mit einem Lux-Operon (Abbildung 2A, 2B) oder mNeptune2-Fluoreszenzprotein (Abbildung 2C, 2D) markiert ist) Reporter. Positiv- und Negativkontrollverbindungen (DMSO, Antibiotika, Saponin) wurden den Platten mit Hilfe eines Pin-Transferroboters zugesetzt, um die Leistung in einer Hochdurchsatz-Screening-Umgebung zu simulieren. Ein signifikantes Legionellenwachstum (Abbildungen 2A, 2C) kann im Vergleich zur Saponinlyse und bei Antibiotika-behandelten Kontrollen nach 24 bis 72 Stunden für lumineszierende Bakterien bzw. 48 bis 72 Stunden für mNeptune2-markierte Bakterien leicht unterschieden werden. Legionellen lysieren Wirtszellen in der Regel, nachdem sie sich 48 bis 72 Stunden lang repliziert haben. Dies kann in den Abbildungen 1B und 1D nachvollzogen werden, die eine erhöhte Fluoreszenz von SYTOX Green (einem repräsentativen, undurchlässigen, Nukleinsäure-bindenden Farbstoff und Marker für den Tod von Wirtszellen) im Laufe der Zeit zeigen. Die Zytotoxizität erreicht schließlich die maximale Menge, die im Detergens (Saponin), der Wirtszelllyse und der Positivkontrolle beobachtet wird. mNeptune2-markierte Organismen wurden mit einem vierfach höheren Inokulum als Lux-Operon-markierte Bakterien hinzugefügt, was wahrscheinlich für eine schnellere Abtötung der Wirtszellen und einen früheren damit verbundenen Anstieg des Fluoreszenzsignals in mNeptune2-Experimenten verantwortlich ist. Erwartungsgemäß verhinderte eine wirksame antimikrobielle Behandlung (Levofloxacin oder Azithromycin) sowohl das Bakterienwachstum als auch die Lyse der Wirtszelle. Umgekehrt könnten zytotoxische Verbindungen, die das intrazelluläre Wachstum durch Zerstörung der Wirtszelle begrenzen (z. B. Saponin), leicht durch eine Kombination aus niedriger Lumineszenz oder mNeptun-2-Fluoreszenz und hohem zytotoxizitätsassoziiertem Signal identifiziert werden. Darüber hinaus lieferte die Beobachtung einer kombinierten Abnahme sowohl der Lumineszenz als auch der mNeptun-Fluoreszenz (Bakterienwachstum) und der Zytotoxizität eine hinreichende Sicherheit, dass es sich bei einer Verbindung um einen echten intrazellulären Wachstumsinhibitor handelt (z. B. Azithromycin- und Levofloxacin-Positivkontrollen) und nicht um ein falsch positives Signal, das aus einer falschen Interferenz mit dem bakteriellen Reportersignal resultiert.

Tabelle 1-3 zeigt den repräsentativen Z' für drei verschiedene bakterielle Reporter (Lux-Operon, mNeptun2, tdTomato) und entsprechende Fluoreszenzmesswerte relativ zu Kontrollen. A Z' >0,5 weist auf einen statistisch robusten Assay hin, der für Hochdurchsatzeinstellungen geeignet ist. ein niedrigeres Z' kann jedoch in Abhängigkeit von experimentellen Zielen, d. h. der Fähigkeit, mehr oder weniger subtile Effekte von Testverbindungen oder Störungen zuverlässig zu unterscheiden, geeignet sein. Basierend auf den Ergebnissen aus Abbildung 2 war mNeptune2 ein nicht so empfindlicher Reporter wie das bakterielle Luciferase-Operon. Daher wurde erwartungsgemäß ein robuster Unterschied zwischen dem mNeptune2-Signal bei negativen (DMSO) und positiven (Levofloxacin, Azithromycin, Saponin) Wachstumshemmer-Kontrollen erst am Tag 2 oder 3 der Inkubation beobachtet, im Gegensatz zu einem frühen, einigermaßen robusten Signal von Lux-Operon-Reporterbakterien am Tag 1 nach der Infektion. Im Gegensatz dazu zeigte tdTomato, ein alternativer bakterieller fluoreszierender Reporter, während des gesamten Infektionsverlaufs suboptimales Z'. Suboptimale Fluoreszenzeigenschaften resultierten zum Teil daraus, dass die Fluoreszenzanregung und der Emissionsschwanz in den Bereich vordrangen, der für die optimale Auslesung des tdTomato-Signals verwendet wird. Dieser Eingriff kann anhand des positiven Z' abgelesen werden, das im Vergleich von tdTomato-Saponin und Levofloxacin gefunden wurde (was einen signifikanten Unterschied in der Bakterienzahl unter zwei Bedingungen impliziert, unter denen sich Bakterien nicht vermehren sollten). Dieses Ergebnis kann dadurch erklärt werden, dass die Saponinlyse ein starkes Fluoreszenzsignal verursacht, dessen Schwanz als tdTomato-Emission detektiert wird, was zu einer falschen Differenz zwischen der Saponin- und der Antibiotika-Kontrolle führt. Während die bakteriellen lux- und mNeptune2-Reporter in Kombination mit Fluoreszenz für lösungsbasierte Echtzeit-Assays mit Dual-Readout nutzbar erscheinen, ist dies bei der Kombination aus tdTomate und Fluoreszenz, zumindest ohne weitere mathematische Signaldekonvolution, nicht der Fall.

Abbildung 3 zeigt zuvor veröffentlichte Beispiele für Dosis-Wirkungs-Kurven bekannter antimikrobieller Wirkstoffe unter Verwendung von Lux-Operon, Reporter-markierten Organismen. 6 Bemerkenswert ist, dass Legionellen nicht in Gewebekulturmedium wachsen. Daher stellt die Replikation von Bakterien in Makrophagen-Infektionsassays ausschließlich intrazelluläres Wachstum dar. Legionellen wachsen jedoch axenisch in einem speziellen, natriumarmen, flüssigen ACES-Hefeextraktmedium (N-(2-acetamido)-2-aminoethansulfonsäure). 20 Hier wurden Effekte auf intrazelluläres und axenisches Wachstum verglichen. Unter Verwendung dieser beiden Wachstumssysteme haben wir beobachtet, dass polare antimikrobielle Mittel wie β-Lactame (Meropenem, Ceftriaxon) und Aminoglykoside (Daten nicht gezeigt) im Gegensatz zu ihren starken Effekten auf das axenische Wachstum schlechte Inhibitoren des intrazellulären Wachstums sind. Vermutlich beruht die schlechte Wirksamkeit bei Makrophagen-Infektionsassays auf der Unfähigkeit, auf die intrazelluläre Legionellen-Replikationsnische zuzugreifen. Im Gegensatz dazu zeigten eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe wie Chinolone (Levofloxacin) und Azithromycin eine starke Wirkung sowohl auf intrazelluläre als auch auf axenische Bakterien.

Darüber hinaus ermöglichte die Verwendung des Dual-Readout-Assays die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Kurven sowohl für die bakterielle Hemmung als auch für die eukaryotische Zytotoxizität im selben Experiment. Insbesondere können IC50 (Konzentration für 50% bakterielle Wachstumshemmung) und CC50 (Konzentration, die 50% eukaryotischen Zelltod induziert) bestimmt und die Selektivität CC50/IC50 berechnet werden. Alle drei Messungen sind wichtige Kriterien für die Progression von Wirkstoffen in der Wirkstoffforschung. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für solche dualen Dosis-Wirkungs-Kurven als Reaktion auf das Antibiotikum Doxycyclin, Daten, die im Laufe der Zeit aus denselben Screening-Vertiefungen gewonnen wurden. In Abbildung 4A ist am Tag 1 der Infektion eine etwa hundertfache bakterielle Replikation in den Null-Antibiotika-Testvertiefungen erkennbar, verglichen mit den höchsten Inhibitionsgraden, die bei Antibiotika beobachtet wurden. Es gab eine minimale assoziierte eukaryotische Zelltoxizität, außer bei sehr hohen Doxycyclinkonzentrationen (≥10 μg/ml). An Tag 2 (Abbildung 4B) war das bakterielle Lux-Signal etwa 10-mal größer als an Tag 1, wobei bei niedrigen antimikrobiellen Konzentrationen eine signifikante bakterielle Replikations-assoziierte Zytotoxizität beobachtet wurde. Erwartungsgemäß verläuft der durch bakterielle Replikation induzierte Wirtszelltod entlang der gesamten antimikrobiellen Dosis-Wirkungs-Kurve eng mit der Bakterienzahl (Lux-Signal). Bei höheren antimikrobiellen Konzentrationen ist die Zytotoxizität auf den Ausgangswert reduziert, bis zu sehr hohen Konzentrationen, bei denen Doxycyclin wieder toxisch erscheint, wie am Tag 1 beobachtet. Die offensichtliche Verschiebung der Lumineszenz-Dosis-Wirkungs-Beziehung hin zu etwas höheren antimikrobiellen Konzentrationen im Vergleich zu fluoreszenzbasierten Zytotoxizitätsmessungen wird etwas übertrieben, wenn man Lumineszenz und Zytotoxizität auf logarithmischen bzw. linearen Skalen aufzeichnet, wie gezeigt. IC50 für das Bakterienwachstum betrug ungefähr 100 ng/ml, während CC50 ungefähr 10 μg/ml betrug, was mit dem zuvor beschriebenen CC50 für die Doxycyclin-Behandlung der Leukozytenlinie, der HL-60-Zelllinie, übereinstimmt. 21 Daher betrug die Gesamtselektivität, die in diesem Dual-Readout-Experiment bestimmt wurde, etwa 100.

Abbildung 5 zeigt zuvor veröffentlichte Isokontur-Isobologramme in Verbindung mit zweidimensionalen Synergietests, in denen paarweise Kombinationen von antimikrobiellen Wirkstoffen auf eine verstärkte Wirkung gegen intrazelluläre L. pneumophila getestet wurden. 6 Obwohl Standard-Isobologramme die niedrigsten kombinatorischen Konzentrationen von Antibiotika verbinden, die das Wachstum vollständig hemmen, haben wir uns auf der Grundlage verfügbarer quantitativer Hemmdaten dafür entschieden, Punkte mit ähnlichem Hemmungsgrad mithilfe von Isokonturen zu verbinden. Die Isokontur ganz rechts in diesen Diagrammen entspricht der Standard-Isobologramm-Linie. Konkave Isobologramme weisen im Allgemeinen auf Synergie hin, während konvexe Isobologramme im Allgemeinen auf Indifferenz oder Antagonismus hinweisen. Beispiele für Synergie (Felder A-C) und Indifferenz (D-F) sind dargestellt, in diesem Fall entsprechend FIC-Indexwerten von <0,5 bzw. ≥1. 6

Bemerkenswert ist, dass paarweise Kombinationen von Azithromycin, Minocyclin und Rifampicin Synergien zeigten. Daher wurden diese Wirkstoffe zusammen in einer Drei-Wege-Kombination getestet, wie in Abbildung 66 gezeigt. Hier wurde eine Oberfläche gezeichnet, um die niedrigsten kombinatorischen Konzentrationen der drei antimikrobiellen Wirkstoffe zu verbinden, die zu einer Hemmung des intrazellulären Bakterienwachstums von >99 % führten. Die beobachtete konkav geformte Oberfläche, die an sich schon auf eine dreidimensionale Synergie hindeutet, entsprach einem niedrigen FIC-Index (0,325), was auf einen erheblichen Synergieeffekt hindeutet.

Tabelle 1: Z' für Lux-Operon-Reporter, Legionelleninfektion - Vergleich von Positiv- und Negativkontrollen. Z' entsprechen den in Abbildung 2A, 2B gezeigten Datenpunkten. Diese Tabelle wurde gegenüber Chiaraviglio und Kirby 2014 geändert. 4 Positive Lumineszenz Z' >0,25 werden mit gelben Zeichen auf schwarzem Hintergrund hervorgehoben.

Tabelle 2: Z' für mNeptune2-Reporter, Legionelleninfektion — Vergleich von Positiv- und Negativkontrollen. Z' entsprechen den in Abbildung 2C, 2D gezeigten Datenpunkten. Positive mNeptun-Fluoreszenz Z' >0,25 sind mit roten Zeichen hervorgehoben.

Tabelle 3: Z' für tdTomato-Reporter, Legionelleninfektion — Vergleich von Positiv- und Negativkontrollen. Positive tdTomato-Fluoreszenzwerte von Z' >0,25 sind mit roten Zeichen hervorgehoben. Falsch positive Z' >0,25 im Zusammenhang mit der Überlappung von SYTOX Green und tdTomato-Emission werden mit grünen Zeichen hervorgehoben.

Abbildung 1: Bildliche Darstellung des Dual-Reporter-Assay-Aufbaus. (A) Replattierung von J774A.1-Zellen, die in Suspension in 384-Well-Schalen gezüchtet wurden. (B) Zugabe von Verbindungen von Interesse zu Mikroplatten. (C) Gleichzeitige Infektion und Zugabe von Nukleinsäure-bindenden Farbstoffen; Inkubation; und Auslesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Duale Echtzeit-Auslesung des intrazellulären Bakterienwachstums und der eukaryotischen Zytotoxizität im Hochdurchsatzformat. Entsprechende Lumineszenz- (A) und Fluoreszenzsignale (B) während der intrazellulären Infektion von J774A.1-Zellen mit Lux-Operon-exprimierenden Legionella pneumophila. Entsprechende fluoreszierende Protein- (C) und fluoreszierende (D) Signale während der intrazellulären Infektion von J774A.1-Zellen mit mNeptune2-exprimierenden Legionella pneumophila. Es werden vier Behandlungen gezeigt: negative DMSO-Kontrolle (); positive Zytotoxizitätskontrolle, Saponin (); und positive Kontrollen der bakteriellen Wachstumshemmung, Azithromycin () und Levofloxacin (). Die Datenpunkte stellen den Mittelwert und die Standardabweichung von 96 Replikaten dar, die auf doppelten 384-Well-Platten durchgeführt wurden. Beachten Sie, dass die Fehlerbalken für die Standardabweichung für einige Datenpunkte minimal waren und daher in Datenpunktsymbolen verborgen waren. Die Tafeln A und B wurden gegenüber Chiaraviglio und Kirby 2014 modifiziert. 4 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Beispiele für eindimensionale Dosis-Wirkungs-Assays. J774A.1-Zellen wurden mit Lux-Operon-exprimierenden L. pneumophila infiziert und mit einer zweifachen Verdünnungsreihe von indizierten antimikrobiellen Mitteln (als "intrazellulär" gekennzeichnet) behandelt. Parallel dazu wurden die Lux-Operon-exprimierenden Legionellen auf die gleiche Endkonzentration in aces-Hefeextraktmedium (AYE) verdünnt und mit einer identischen, zweifachen Verdünnungsreihe (als "axenisch" bezeichnet) behandelt. Die Lumineszenz wurde zwei Tage nach der bakteriellen Inokulation gemessen und im Vergleich zur antimikrobiellen Konzentration aufgetragen. Panel A umfasst antimikrobielle Mittel, die üblicherweise zur Behandlung von Legionelleninfektionen eingesetzt werden. Panel B vergleicht die Aktivität verschiedener Makrolid-Antibiotika. Panel C umfasst mehrere verschiedene Klassen von antimikrobiellen Wirkstoffen mit unterschiedlicher und manchmal gegensätzlicher intrazellulärer und axenischer Wirksamkeit. Die Datenpunkte stellen die Durchschnittswerte und Standardabweichungen von drei separaten Testwells pro Bedingung dar. Diese Abbildung wurde gegenüber Chiaraviglio und Kirby 2015 modifiziert. 6 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beispiel für ein Dosis-Wirkungs-Experiment mit doppelter Auslesung zur Bestimmung von IC50, CC50 und Selektivität. Die Auswirkungen von Doxycyclin auf das intrazelluläre Wachstum und die Zytotoxizität der J774A.1-Zellen wurden an den Tagen 1 und 2 nach der Infektion bestimmt. Die Datenpunkte stellen die Durchschnittswerte und Standardabweichungen von drei separaten Testwells pro Bedingung dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Beispiel für zweidimensionale Synergie-Assays. Kombinatorische serielle Verdünnungen von Paaren antimikrobieller Wirkstoffe wurden auf Synergie gegen das intrazelluläre Wachstum von Legionellen in J774A.1-Makrophagen getestet. Isokonturlinien verbinden Punkte mit ähnlicher prozentualer Hemmung. Das Isobologramm ganz rechts verbindet Kombinationen mit vollständiger intrazellulärer Wachstumshemmung (>99% Lumineszenzreduktion im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen) und entspricht dem Standard-Isobologramm-Diagramm. Die Schattierung gibt die prozentuale Hemmung an, die durch den farbcodierten Schlüssel in jedem Diagramm dargestellt wird. Die Isokonturen von links nach rechts entsprechen einem Wachstum von 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 und 1 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Diese Abbildung wurde gegenüber Chiaraviglio und Kirby 2015 modifiziert. 6 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Beispiel für einen dreidimensionalen Synergie-Assay. Die niedrigsten kombinatorischen Konzentrationen von Azithromycin, Minocyclin und Rifampicin, die zu einer Wachstumshemmung von >99 % führten, wurden zu einem Isobologramm-Oberflächendiagramm verbunden. Diese Abbildung wurde gegenüber Chiaraviglio und Kirby 2015 modifiziert. 6 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.