Beobachtung und Quantifizierung der Paarungsverhalten in der Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Summary

Ein Protokoll zur Untersuchung des Paarungsverhaltens des Kiefernfadenwurms, Bursaphelenchus xylophilus, wird vorgestellt. Verhaltensmerkmale von B. xylophilus werden im Paarungsprozess beschrieben.

Abstract

Ein Verfahren zur Beobachtung und das Paarungsverhalten des Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus Quantifizierung wurde unter einem Stereomikroskop etabliert. Um die Paarungseffizienz von B. Xylophilus verbessern und die Chancen der Paarung Beobachtung zu erhöhen, waren virgin Erwachsene kultiviert und verwendet für die Untersuchung. Die Eier wurden, indem sie die Nematoden in Wasser erhalten und damit die Weibchen für 10 min Eier zu legen. Die zweite Stufe Jugendliche (J2) wurden im Dunkeln, und die frühe J4 erhalten wurden bei 25 ° C für 24 h durch Inkubation der Eier synchronisiert durch die J2 Kultivierung mit Grauschimmel Botrytis cinerea, für eine weitere 52 h. Zu diesem Zeitpunkt konnten die meisten J4 Nematoden klar unterschieden werden als männlich oder weiblich ist, ihre Genital Morphologie verwendet wird. Die männlichen und weiblichen J4 wurden gesammelt und kultiviert getrennt in zwei verschiedenen Petrischalen für 24 h virgin erwachsenen Nematoden zu bekommen. Eine Jungfrau männliche und eine jungfräuliche Weibchen wurden in einem Tropfen wat gepaarter in die Vertiefung einer konkaven Folie. Das Paarungsverhalten wurde mit einem Videorecorder unter einem Stereomikroskop gefilmt. Die ganze Periode des Paarungsprozesses war 82,8 ± 3,91 min (Mittelwert ± SE) und konnte in 4 verschiedene Phasen unterteilt werden: die Suche, Kontaktaufnahme, Kopulation und lang anhaltend. Die mittleren Minuten Dauer waren 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 und 7,2 ± 0,5. Elf Unter Verhaltensweisen wurden beschrieben: kreuzen, nähern, begegnen, berühren, hooping, Ortung, Befestigung, ejakulieren, trennen, quiescence und Roaming. Interessanterweise offensichtlich intra sexuellen Wettbewerb wurde beobachtet, wenn ein Weibchen mit 3 Männchen oder ein Männchen mit drei Frauen gruppiert wurde. Dieses Protokoll ist nützlich und wertvoll, nicht nur das Paarungsverhalten von B. xylophilus bei der Untersuchung, sondern auch als Referenz für ethologischer Studien anderer Nematoden in wirken.

Introduction

Der Kiefernfadenwurm, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner und Bührer) Nickelle, ist eine der zerstörerischsten invasiven Arten, die das Welken und schließlich den Tod von Kiefern verursacht. Es wird angenommen, dass dieser pathogene Nematode in den USA beheimatet ist, aber er wurde in mehrere Länder transportiert, darunter China, Japan, Südkorea und Portugal. Kürzlich wurde es auch in Spanien gemeldet, das Millionen von Kiefern mit enormen wirtschaftlichen Verlusten tötete und die Waldproduktion und die ökologische Stabilität bedrohte^1-5.

Sobald eine Wirtskiefer von Kiefernfadenwürmern befallen ist, vermehren sich Tausende von Millionen Nachkommen schnell im Stamm. Dies führt zu einer Xylemdysfunktion, die zum Welken und schließlich zum Absterben des Wirtsbaums^{führt 6}. Derzeit gibt es jedoch keine wirksame Möglichkeit, diese Krankheit zu kontrollieren. Das Paarungsverhalten könnte eine wichtige Rolle für die hohe Fruchtbarkeit dieses Fadenwurms spielen⁷. Wir untersuchten daher das Paarungsverhalten von B. xylophilus im Labor und versuchten, einen effektiven Weg zu finden, um seine Paarung zu stören und seine Fruchtbarkeit zu verringern.

Dieses Protokoll soll die detaillierten Methoden vorstellen, wie man die jungfräulichen adulten Tiere von B. xylophilus erhält und wie man das Paarungsverhalten mit einem Videorekorder und einem Stereomikroskop beobachtet und analysiert. Dieses Protokoll kann auch als Referenz für Verhaltensstudien an anderen Nematoden verwendet werden.

Protocol

1. Erwerb von Virgin Adult Nematoden

1. Pinewood Nematoden - Isolat und Kulturbedingungen
   Hinweis: Um die B. xylophilus isolieren Nxy61 ursprünglich von einem erkrankten Pinus massoniana im Ningbo Gebiet der Provinz Zhejiang in China extrahiert wurde.
   1. Bereiten Sie Kartoffel - Dextrose - Agar (PDA, siehe Tabelle der Materialien) Platten für den Anbau von Botrytis cinerea.
   2. Zur Inokulation ein Stück Pilz-Matte mit einem Durchmesser von 10 mm aus einem B. cinerea Matte Punsch und es in der Mitte eines neuen PDA - Platte setzen. Kultur der B. cinerea für 5 d bei 25 ° C im Dunkeln.
   3. Kultur die pinewood Nematoden in die vorbereitete Petrischale mit B. cinerea bei 25 ° C im Dunkeln.
2. Erwerb von B. xylophilus Eier
   1. Legen Sie eine geklemmt Gummischlauch unter einen Trichter und halten Sie die vorbereiteten Trichter in einem Rack die zusammenBaermann Trichtervorrichtung. Platzieren zwei Schichten von Filterpapier anstelle von Gaze in den Mund des Trichters.
   2. Übertragen Sie die Pilzkulturen auf den Trichter Setup und Wasser hinzufügen, bis die Pilzmatte eingetaucht ist. Warten Sie 2 h, und Nematoden aus der Pilzkultur herauskommen wird, kreuzen Sie das Filterpapier, und sich in den untersten Teil des Baermann-Trichter nach unten.
   3. Sammeln Sie die ersten paar Tropfen Wasser aus dem Boden des Röhrchens in ein 15 ml-Röhrchen und sammeln Nematoden langsam auf dem Rohr die Klemme freigegeben wird.
   4. Zentrifugieren Sie die oben Sammlungen bei 3000 × g für 2 min bei RT.
   5. Entfernen Sie die obere Schicht aus Wasser mit einer Pipette und resuspendieren es mit 1 ml sterilem doppelt destilliertem (dd) H ₂ O.
   6. Mit einer Pipette die oben Aufwirbelung auf ein neues Glas-Petrischale (6 cm Durchmesser). 3 ml steriler dd H ₂ O in die Petrischale , um sicherzustellen , dass die Nematoden frei schwimmen können.
   7. Halten Sie die Nematoden im Glass Petri bei 25 ° C im Dunkeln für 10 min Schale. Eier werden von schwangeren Frauen gelegt werden. Aufgrund ihrer Glykoprotein Oberfläche, klebt die Eier an der Unterseite der Glaspetrischale.
   8. Entfernen Sie das Wasser und Würmer vorsichtig, ohne die Eier zu stören. 3 ml steriler dd H ₂ O auf die Glaspetrischale unmittelbar um die Eier zu verhindern , vor dem Austrocknen.
   9. Wiederholen Sie Schritt 1.2.8 3x zu entfernen Sie alle Larven und Erwachsene, und erhalten die reinen Eier. Fügen Sie eine zusätzliche 2 ml (5 ml insgesamt) steriler dd H ₂ O zu der Petrischale.
3. Der Erwerb der vierten Stufe Jugendlichen (J4 Larven)
   1. Hatch die gesammelten Eier für 24 h im Dunkeln bei 25 ° C J2 Larven zu erhalten.
   2. Übertragen Sie die J2-Larven mit einer Pipette in ein 15 ml-Röhrchen, Zentrifuge bei 3000 × g für 2 min, und entfernen Sie die obere Wasserschicht.
   3. Resuspendieren J2 - Larven mit 200 ul steriler dd H ₂ O, und dann übertragen zudie PDA - Platte B. cinerea enthält.
   4. Kultur der J2-Larven für 52 h bei 25 ° C im Dunkeln. Zu diesem Zeitpunkt werden die meisten J2-Larven in der frühen Phase der J4 Larven entwickelt.
4. Erwerb von nativem erwachsenen Nematoden
   1. Bereiten Sie eine Nadel für Nematoden Aufnehmen durch eine Glaskapillare zeichnen, nachdem sie über einen Spiritusbrenner erhitzt wird.
      HINWEIS: Die Spitze dieses Kapillarnadel benötigt normalerweise 50 & mgr; m im Durchmesser sein, etwa der Körperbreite eines erwachsenen Nematoden, so daß sie als Werkzeug zum Aufnehmen eines einzelnen Nematoden verwendet werden kann.
   2. Bauen Sie eine Baermann-Trichter und extrahieren Nematoden aus den Pilzkulturen für 2 h, wie 1.2.1 in den Schritten - 1.2.3.
   3. Übertragen Sie die J4 mit Wasser in eine saubere Petrischale.
   4. Beachten Sie die Nematoden unter einem Stereomikroskop und zu unterscheiden zwischen Männern und Frauen von Genitalmorphologie, wie von Mamiya und Kiyohara ⁸ (Abbildung 1 ). Pick-up eine Nematode des gewünschten Geschlechts mit der vorbereiteten Kapillarnadel und übertragen sie an den entsprechenden Pilz-Kulturplatte für Männer oder Frauen.
      HINWEIS: Es gibt mehr Frauen als Männer, wobei der Anteil der Frauen bei 60 bis 70%. Die weibliche Vulva ist offensichtlich von dem männlichen spicule. Im Vergleich zu den Erwachsenen ist die spicule oder Vulva in der Frühphase J4 kleiner, aber sie können immer noch leicht zu erkennen und zu unterscheiden. Die Nematoden bewegt sich immer im Wasser, die manchmal die Schwierigkeit erhöht sich bei Männern und Frauen unterscheiden.
   5. Kultur der J4 Larven für weitere 24 h bei 25 ° C im Dunkeln.
      Hinweis: Alle Nematoden zu Erwachsenen entwickeln sollte, aber da sie nicht zusammengefügten sind, werden sie als Jungfrau Erwachsene angesehen.
   6. Montieren Sie zwei Baermann-Trichter und extrahieren Sie die jungfräuliche Erwachsene aus den Pilzkulturen für 2 h, wie in den Schritten 1.2.1 - 1.2.3, und übertragen Sie die Jungfrau erwachsenen Männern und Frauen in zwei getrennte, saubere Petrischalen.

2. Beobachtung und Videoaufzeichnung von Paarungsverhalten

1. Bereiten Sie mehrere konkave Dias und mit 200 & mgr; l sterilem dd H ₂ O zu jedem ihrer Brunnen.
2. Pick-up die vorbereitete Jungfrau erwachsenen männlichen oder weiblichen und mit einer Kapillare Nadel und stellen nur eine Nematode in das Wasser jedes konkaven Folie.
3. Halten Sie die Jungfrau Erwachsene im Inneren des gut 1 h, damit sie auf die neue wässrige Umgebung anzupassen.
4. Paar eine Jungfrau männlich und weiblich von einem von ihnen von einer Vertiefung zur anderen zu übertragen mit einer Pipette.
5. Beobachten Sie das Paarungsverhalten der 1♀ + 1♂ Kombination in der konkaven Objektträger unter einem Stereomikroskop.
6. Um die Paarungseffizienz von nativem Erwachsene analysieren, berechnen ihre Paarungserfolgsrate (R) und vergleichen Sie es mit dem von zufällig ausgewählten Erwachsenen-Paare. Berechnen R als der Prozentsatz von Replikaten in denen Kopulation beobachtet wurde, verglichen mit der Gesamtzahl der untersuchten Replikaten.
Um Paarung Wahl und intra Wettbewerb, Gruppen- und beobachten virgin Nematoden von zwei verschiedenen Kombinationen untersuchen.
7. Um Daten für die qualitative und quantitative Analyse zu sammeln, zu filmen das Paarungsverhalten Videomikroskopie. Normalerweise, wenn die ganze Paarungsprozess, von der Zeit, die Nematoden in der Vertiefung des konkaven Schlitten auf den Moment gestellt werden, wenn sie weg nach der Kopulation bewegen, wird innerhalb von 2 h abgeschlossen. Daher nehmen Sie das passende Verfahren kontinuierlich für mindestens 2 h als eine Replikation. Komplette mindestens 30 Wiederholungen insgesamt für jede Kombination.
   HINWEIS: In steriler dd H ₂ O ( in der Regel 50 & mgr; l) alle 0,5 h auf die gut für die Verdampfung während des Aufzeichnungsprozesses zu kompensieren.

3. Datenerfassung

1. Alle Videos sorgfältig auf einem Computer-Bildschirm und zeichnen die Unter Verhaltensweisen qualitativ.
2. Messen Sie die Dauer der Paarung mit the Frame-by-Frame-Funktion des Videorecorders. Manuell subtrahieren von dem Endpunkt der Startzeit.
3. Für die 1♀ + 1♂ Kombination, analysieren jede Videoaufzeichnung und messen die Dauer der folgenden Ereignisse:
   1. Messen Sie die Dauer der Suche (dh die Zeit aus , wenn die weiblichen und männlichen sind in den Brunnen des konkaven Schlitten eingeführt zu dem Moment , sie begegnen und einander berühren).
   2. Messen der Dauer des In- Kontakt (dh die Zeit vom ersten Kontakt bis zu dem Moment , wenn das männliche genau an der Vulva des Weibchens positioniert ist zum ersten Kopulation).
   3. Messen der Dauer der Kopulation (dh die Zeit von , wenn das männliche genau an der Vulva des Weibchens positioniert ist , bis er aus dem weiblichen Körper nach der Ejakulation gleitet nach unten). Hinweis: Einige Nematoden mehrmals in 2 h kopulieren können. In solchen Fällen messen die Dauer der Kopulation von der ersten Kopulation bis zum Ende des last ein, einschließlich der Zeit dazwischen.
   4. Messen Sie die Dauer des Verweilens (dh die Zeit nach der Kopulation , bis die männlichen und weiblichen Bad voneinander entfernt und sind durch einen Abstand von mehr als der Nematoden Körperlänge ( in der Regel 1 mm) getrennt).
4. Zählen Sie die Kopulation Häufigkeit und Dauer jeder Kopulation und die durchschnittliche Dauer aller Paarungen in 2 h für jede der verschiedenen Kombinationen (dh 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ und 1♀ + 3♂).
5. Berechne den Paarungserfolgsrate für den ersten Kontakt (P) für die verschiedenen Kombinationen als die Erfolgsrate der Paarung nach dem ersten Kontakt, der unmittelbar und ohne Unterbrechung durchgeführt wird. In der Kontaktphase kann mehrere Kontakte vor der eigentlichen Kopulation beobachtet werden.
   1. Wenn der Abstand zwischen zwei Individuen mehr als die Körperlänge ist, sollten einen Kontakt über sein. Für ein Replikat, Rekord P als 100%, wenn der Kopulation is beobachtet unmittelbar nach dem ersten Kontakt, ohne Pause, oder 0,00%, wenn keine Kopulation beobachtet wurde oder wenn es Kopulation aber nach zwei oder mehrere Kontakte.
      HINWEIS: Es wurden 30 Wiederholungen für jede Kombination hier beschrieben.

Results

Die Paarungserfolgsrate (R) von nativem Erwachsenen war 86,67% im Durchschnitt, was die deutlich höher war als der zufällig ausgewählten Erwachsenen: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Abbildung 2). Dieser Befund legt nahe , dass es einfacher ist , das Paarungsverhalten von B. xylophilus mit nativem Erwachsenen als bei zufällig ausgewählten Erwachsenen zu beobachten.

We...

Discussion

Verhaltenstests sind ein grundlegender Aspekt der chemischen Ökologie, Neurobiologie, Molekularbiologie und Genetik. Nematoden und insbesondere C. elegans, sind für ein Studium in diesen Bereichen intensiv genutzt. Das Paarungsverhalten von C. elegans wurde zuvor ^10-11 untersucht. Allerdings ist B. xylophilus gonochoristic und unterscheidet sich von den Zwitter C. elegans und seine Paarung hat verschiedene Verhaltensmerkmale ^9. Vor kurzem wurde das Paarungsverhal...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilusIsolat Nxy61			Extrahiert aus Pinus massoniana in der Gegend von Ningbo in China
Grauschimmelstamm			Gewonnen von der Forestry Academy of China
Baermann-Trichter Sengong-Falkenröhrchen
	Sengong
Pipette	Sengong
steril dd H2O			Sterilisiert durch hohen Dampfdruck bei 121 > C für 30 Min.
Petrischalen	Sengong
PDA medium	Huankai Bio.	021050
Inkubator	Sengong
Laminar Flow	Sengong
Glaskapillare	Sengong
Stereoskop	Leica	LED5000 RL
inverses Stereomikroskop	Zeiss	A1
konkave Objektträger	Sengong