Summary
Não faltam modelos pré-clínicos que avaliam a terapia adjuvante visando metástases de câncer de mama. Para abordar isso, desenvolvemos um modelo murino de metástase de adenocarcinoma mamário pulmonar de novo , em que as terapias administradas na configuração adjuvante (ressecção pós-cirúrgica de tumores primários) podem ser avaliadas quanto à eficácia no impacto de metástases pulmonares previamente semeadas.
Introduction
As mulheres na América do Norte têm um risco de vida de até 12% de desenvolver câncer de mama 2 ; A maioria destes indivíduos terá tumores primários removidos por cirurgia e, dependendo do subtipo de câncer, receberá terapia direcionada, endócrina, quimioterapia e / ou radioterapia na configuração adjuvante 3 . Exemplos incluem, mulheres diagnosticadas com câncer de receptores hormonais positivos que recebem terapias anti-estrogênio e mulheres com tumores HER2-positivos que recebem terapias direcionadas a HER2 com radiação / quimioterapia, enquanto que não há terapias direcionadas ainda disponíveis para tumores triplos negativos 3 . Apesar dos avanços em terapias de radiação, quimioterapia, terapias hormonais personalizadas que complementam a ressecção cirúrgica, a doença se repete em 30-70% das mulheres diagnosticadas com doença do estágio II ou III 4 , pois as terapias são em grande parte ineficazes na erradicação da doença metastática em órgãos distantes, inclusive Pulmão, osso, bChuva e / ou fígado 5 . Isto é especialmente significativo dado que, quando a doença metastática ocorre na ausência de rebrota primária do tumor, isso implica que as células malignas disseminadas provavelmente já estão presentes nos órgãos secundários no momento da cirurgia definitiva. Assim, as terapias capazes de erradicar ou retardar o crescimento de tumores metastáticos são urgentemente necessárias.
Enquanto de novo modelos de ratinho de cancro mamário têm sido notavelmente informativo em revelar os mecanismos que regulam a progressão neoplásica 1, os modelos existentes também têm várias limitações. Um deles é o fato de que os modelos transgênicos de novo tipicamente desenvolvem tumores primários em múltiplas glândulas mamárias, em que a carga tumoral primária limita a duração dos estudos. Enquanto a fuga de células tumorais primárias e a amadurecimento metastático provavelmente ocorrem precocemente na progressão neoplásica nestes modelos, o desenvolvimento franco de tumores metastáticos ocorre tarde e dependendo deNo modelo do mouse e no fundo da tensão, muitas vezes é parcialmente penetrante 1 . Isto limita ainda mais a utilidade de modelos de novo para a descoberta de moléculas que regulam a metástase em órgãos secundários e para avaliar a eficácia pré-clínica da terapêutica no ambiente adjuvante.
Para contornar essas limitações, desenvolvemos um modelo autônomo de novo de metástase de carcinoma mamário em pulmões. As fêmeas transgênicas parentais ( isto é , MMTV-PyMT no fundo da cepa FVB / n para os estudos aqui descritos) que levam tumores mamários de novo em estágio de novo são envelhecidos para ~ 100 dias 6 , altura em que seus tumores primários são ressecados cirurgicamente e se dissociaram enzimaticamente Suspensões de célula única. As suspensões (1 x 10 6 células) são, por sua vez, explotadas ortotópicamente em camundongos singênicos receptores de 6-7 semanas de idade, onde os tumores mamários primários isolados se desenvolvem ao longo de um período de 38 a 60 dias ( mm3), os ratinhos receptores são anestesiados e tumores primários são cirurgicamente ressecado de tal modo que o crescimento do tumor no local da cirurgia é minimizado, consistente com a cirurgia em mulheres (Recurso Figura 1). No fundo da tensão FVB / n, os camundongos desenvolvem focos metastáticos histologicamente detectáveis em pulmões com 45% de penetrância por ~ 115 dias após a cirurgia ( Figura 1B ). Com esta latência prolongada de crescimento de tumores metastáticos, o modelo está em posição única para a administração de terapia adjuvante e para elucidar e avaliar a biologia subjacente que influencia a progressão metastática após a remoção cirúrgica de tumores primários.
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Protocol
Os animais utilizados no seguinte protocolo são cobertos pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Saúde e Ciência da Oregon (IACUC), que é projetado para ser compatível com os regulamentos da Lei de Bem-Estar Animal e com a Política do Serviço de Saúde Pública (PHS).
Manutenção de condições estéreis: instrumentos esterilizados devem ser utilizados e entre ratos, devem ser limpos com gaze estéril, enxaguados em PBS, seguido de esterilização com desinfectante a 70% de etanol durante pelo menos 15 minutos. Uma gola cirúrgica, uma faca, vestido e luvas devem ser usadas para cirurgias de sobrevivência. A preparação pré-operatória do animal para cirurgias de sobrevivência está incluída no seguinte protocolo. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista de reagentes e equipamentos.
1. Isolamento e preparação de suspensões monocelulares de tumores mamários primários
- Anestesiar os ratinhos transgênicos MMTV-PyMT (FVB / n) transgênicos de 100 dias do sexo doador e manter sob cSedação ontinuosa administrando 2% de isoflurano através de uma máscara de anestesia. Confirme se o mouse está devidamente anestesiado com um reflexo de pitada do pé ausente.
- Em um ambiente estéril, resectam tumores mamários primários de ratos MMTV-PyMT femininos transgênicos (FVB / n) de 100 dias, separando o tumor mamário da pele subjacente e tecido adiposo adjacente e / ou linfonodos usando tesoura estéril. Eutanizar os camundongos anestesiados por luxação cervical.
- Com tesoura estéril ou um bisturi, mole os tumores primários manualmente em pequenos pedaços (~ 1,0 mm 3 ). Coloque peças tumorais em 3,0 mg / mL de colagenase A e 4,0 U / mL de DNase I dissolvidas em DMEM. Use ~ 10 mL do meio de digestão acima por tumor de 1,0 cm de diâmetro.
- Execute a digestão em um frasco estéril de 25 mL com uma barra de agitação estéril a ~ 125 rpm e 37 ° C durante 40 min.
- Pare a digestão adicionando soro bovino fetal (FBS) a uma diluição final de 10% e coloque toda a mistura em wE o gelo onde é mantido.
- Filtre a suspensão do tumor digerido através de um filtro de nylon de 0,7 μm em um tubo cônico de 50 mL e descarte qualquer tumor restante no filtro. Centrifugar o sobrenadante a 300 xg a 4 ° C.
- Ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM por tumor de 1,0 cm e re-filtrar através de um filtro de nylon de 0,7 μm. Contagem de concentração de células, depois centrifugue a 300 xg a 4 ° C.
- Resuspender o sedimento em 10% de sulfóxido de dimetilo com 90% de FBS a uma concentração de 2 x 10 7 células vivas / mL. Armazene suspensões monocelulares de tumor primário inteiro a -80 ° C.
2. Injeção orotópica de tumor mamário
- Parcialmente descongelar suspensões tumorais primárias congeladas a 37 ° C até que o sedimento congelado possa ser liberado do tubo criogênico em 20 mL de DMEM e contar as células. Centrifugação a 300 xg a 4 ° C e ressuspender as células em um DMEM 1: 1: fator de crescimento - preparação de membrana basal solubilizada reduzida eExtraído do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) em uma concentração de 1 x 10 7 células / mL (ver Tabela de Materiais ).
- Coloque o lado ventral do lado singênico feminino do receptor anestesiado para cima e mantenha-se sob sedação contínua administrando 2% de isoflurano através de uma máscara de anestesia.
- Esterilizar o 4º local de injeção da glândula mamária direita utilizando etanol 70% em aerossol e aplicar Poly (vinilpirrolidona) - Iodina com um cotonete de algodão estéril.
- Injetar 100 μL (1 x 10 6 células vivas a partir de suspensões tumorais primárias congeladas) lado biselado para cima na glândula mamária direita não esclerada do fVB / n feminino de 6 a 10 semanas usando uma seringa de insulina de 29 g 0,3 mL.
3. Ressecção cirúrgica do tumor ortopopear mamário
- 38-60 dias após a injeção de células tumorais, eutanizar camundongos que não exibam volumes de tumor ortotópico variando entre 172 a 450 mm 3 em volume [comprimento x (largura 2
- Coloque ratos anestesiados que exibam o lado ventral adequado do lado ventral sob sedação contínua, administrando 2% de isoflurano através de uma máscara de anestesia e confirme que o mouse está devidamente anestesiado com um reflexo de pitada do pé ausente. Aplique pomada veterinária aos olhos para prevenir a secura enquanto estiver sob sedação.
- Pulverize 70% de etanol para esterilizar a área cirúrgica que envolve o tumor primário e, em seguida, aplique Poli (vinilpirrolidona) - Iodina com um cotonete de algodão estéril.
NOTA: A remoção do cabelo no local cirúrgico resultou em escoriações e / ou infecções da pele para ~ 5% de camundongos e, portanto, foi excluída desta etapa (dados não mostrados). - Conforme mostrado na Figura 1C , faça uma incisão inicial da pele usando tesouras bruscas medial-caudal ao tumor.
- Em seguida, faça uma excisão superior da pele ( Figura 1C ) medial ao tumor. Preste atenção à necessidade de cauterizar qualquer vasculatura fePuxando o tumor localizado na pele antes de estender a incisão.
- Continue a incisão da pele lateralmente (posterior ao tumor), em seguida, faça uma excisão da pele superior (lateral ao tumor) e a excisão medial (superior ao tumor) ( Figura 1C ).
- Depois que a pele foi excisada circunferencialmente em torno do tumor ( Figura 1C ), levante a pele sobreposta ao tumor usando fórceps enquanto dissimulam o tumor distante da musculatura da parede abdominal e mantendo as glândulas mamárias intactas.
- Identificar (por dissecção romba) e cauterizar os vasos grandes que funcionam através das glândulas mamarias 4 e 5 th th.
- Especial de consumo de aproximadamente metade dos 4 e 5 th th glândulas mamárias no local de cauterização para libertar o tumor, sobrepondo-se a pele, e os segmentos das glândulas mamarias (Figura 1C).
- Em caso de sangramento, identifique hemorragia ativamenteVasos e imediatamente cauterizá-los. Se perder mais de 250 μL de sangue, exclua o mouse do estudo e faça uma eutanásia.
- Feche os locais de excisão com clipes de ferida usando um aplicador de clip de ferida ( Figura 1C ).
NOTA: Remova os grampos da ferida 10 dias após a cirurgia com um removedor de grampo da ferida. - Administrar solução salina estéril quente por via subcutânea (4% do peso corporal do animal) e manter o animal quente com uma lâmpada de calor. Verifique os animais a cada 5-10 min durante a recuperação da anestesia.
NOTA: A administração de bupivacaína ou lidocaína aumentou a mortalidade pós-operatória (dados não apresentados). Ratos que apresentavam sinais de dor (hunching, não desejoso de se mover, falta de noivo) 1 h após a cirurgia foram eutanasiados.- Uma vez que o mouse se tenha recuperado completamente, devolva-o à empresa de outros ratos.
4. Isolamento e processamento de sangue e pulmão para citometria e histologia de fluxo
<Ol>NOTA: Os estoques congelados de bromodesoxiuridina dissolvida são utilizados no prazo de 1 mês após a preparação.
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Representative Results
Mais do que 75% de ratinhos receptores que receberam 1 x 10 6 culas de tumores mamários primários derivados de ratinhos MMTV-PyMT, desenvolver adenocarcinomas mamários individuais que variam em tamanho de 172-450 mm3 dentro de 38-60 dias (dados não mostrados). Os ratos elegíveis para randomização são então matriculados em grupos de estudo após ressecção cirúrgica de tumores primários, como mostrado ( Figura 1C ). O crescimento primário do tumor foi identificado em menos de 2% dos ratos submetidos à ressecção cirúrgica do tumor primário ( Figura 1 suplementar ). 45% dos camundongos receptores avaliados por este protocolo desenvolveram focos metastáticos histologicamente detectáveis no dia 115 ressecção pós-tumoral ( Figura 1B ). Para afirmar histologia de metástases em áreas identificadas contendo células metastáticas por coloração de H & E, as seções de tecido adjacentes foram avaliadas por PCR PyMT (dados nãomostrando).
Figura 1 : ressecção pós-cirúrgica de tumores primários e desenvolvimento de metástase pulmonar de novo . ( A ) Esquema experimental do modelo de metástase do adenocarcinoma mamário murino. † indica que todos os camundongos foram perfundidos cardíacos e injetados com BrdU no dia da eutanásia. ( B ) Representante H & E onde a detecção de focos metastáticos foi avaliada por corte em série do tecido pulmonar FFPE com lóbulos separados. Os focos metastáticos (> 5 células) foram determinados por coloração de H & E a cada 100 μm, refletindo 1.300 μm de tecido. Pulmões de 11 ratos foram analisados. ( C ) Esquema da ressecção cirúrgica do tumor mamário primário. Os números vermelhos e as setas indicam a ordem e a direção das incisões cutâneasFronteira com o tumor primário (esquerda). Os direita 4 e 5 th th glândulas mamárias com grandes vasos são mostrados ligados ao tumor primário (meio), seguido por fecho de feridas com agrafos (direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Isolamento, perfusão e fixação do pulmão. A imagem (esquerda) eo desenho correspondente (direito) são mostrados de isolamento, perfusão e fixação do pulmão. (A) Uma incisão na linha média é mostrada com imagem ampliada visualizadas pele retraída expondo a direita 4 e 5 de glândulas mamárias (seta). ( B ) A parede abdominal é mostrada aberta ao diafragma. ( C ) Após a retração oPara o intestino, a aorta abdominal (ponta seta) é identificada e cortada. ( D ) O diafragma e os lados laterais da caixa torácica são cortados para expor a cavidade torácica. ( E ) O pulmão é perfundido através do ventrículo direito do coração até os pulmões ficarem inteiramente brancos ( F ). ( G ) A traqueia exposta é identificada seguida de injeção de formalina ( H ) na traquéia até os pulmões se expandirem ( I ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura complementar 1 : Recuperação tumoral primária no local cirúrgico. Representante H & E (em cima) e (inferior) imagens brutas do 4 e 5 de glândula mamária pós-cirurgia direita remanescente, que mostra a ausência de TUReumatamento morto com linfonodo inguinal ( AB ) e glândula mamária com rebrota primária tumoral ( CE ). Clique aqui para baixar esta figura.
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Discussion
Modificações e solução de problemas:
Quando o tumor dissecante contundente longe da parede abdominal, o tumor pode permanecer aderente à parede abdominal. Isto foi observado em <5% de ratinhos injetados com tumor (dados não apresentados). Para camundongos com tumores aderentes à parede abdominal, o mouse deve ser eutanásico, pois a ressecção é difícil sem recriação tumoral primária.
Limitações do modelo / técnica:
Enquanto outros pesquisadores relataram a presença de células metastáticas únicas marcadas com fluorescência disseminadas para fígado, rim, baço e cérebro, além do pulmão, após o reimplante de gemas terminais mamárias derivadas de ratos MMTV-PyMT 7 , além do pulmão, observamos várias Ratos com focos metastáticos no fígado, cuja penetração ainda não foi determinada. Outros locais de potencial fator metastático, como o linfonodoS, baço, osso e cérebro, não foram avaliados. Uma limitação desta técnica também incluiu escoriações pós-operatórias e infecção da pele ao raspar o local cirúrgico. Por isso, a esterilidade do local cirúrgico foi limitada à aplicação de 70% de etanol seguido de Poli (vinilpirrolidona) -Idina.
Passos críticos dentro do protocolo:
A dissecação brusca do tumor longe da parede abdominal é um passo crítico (passo 3.7) onde a evitação dos vasos dentro da glândula mamária deve ser realizada. As etapas 3.8 e 3.9 também são passos críticos onde há maior risco de sangramento não controlado. As porções proximais e distais distanciadas do vaso devem ser identificadas pós-cauterização para visualizar facilmente fontes de sangramento.
Importância em relação aos métodos existentes:
Modelos de mouse de câncer humano que imitam estágios da doençaProgressão, cinética e histopatologia fornecem ferramentas inestimáveis para identificar e avaliar novos alvos para terapia, bem como a eficácia potencial de novos agentes terapêuticos visando essas moléculas / caminhos. Embora a ingesta de veia caudal e / ou injeção cardíaca de linhas celulares de câncer estabelecidas seja freqüentemente usada como modelos experimentais de metástase, elas não conseguem recapitular passos críticos no processo metastático e, em vez disso, refletem ensaios de colonização de órgãos ectópicos, onde os aspectos da sobrevivência das células tumorais podem ser avaliados 8 . Além disso, enquanto alguns modelos de ratos transgênicos existentes de desenvolvimento de carcinogênese mamária de novo fornecem sistemas modelo que permitem o estudo de etapas envolvidas em metástases, a carga tumoral primária significativa normalmente limita a duração do estudo. Assim, os grupos injetaram células neoplásicas cultivadas derivadas de tumores primários MMTV-PyMT para permitir a ressecção cirúrgica 9 . Nosso método se expande a partir dessas técnicas, pois dNão é selecionado para linhas celulares neoplásicas cultivadas a partir de tumores in vitro e apresenta diretamente o tumor primário completo e heterogêneo a camundongos receptores. Além disso, a longa latência da formação de metástases pulmonares em nosso modelo permite uma melhor janela terapêutica para vários estudos de tratamento.
Aplicações futuras:
Quanto à avaliação da eficácia da terapêutica nestes modelos, porque os tumores primários normalmente se desenvolvem em todas as glândulas mamárias, a ressecção cirúrgica de todos os tumores primários e a avaliação adjuvante de terapias destinadas a minimizar o crescimento de colônias metastáticas não é possível. Devido a estas questões, desenvolvemos um modelo autóctone de disseminação metastática em que a disseminação metastática de células tumorais ocorre de novo e, após a ressecção cirúrgica do tumor primário, é estabelecido um período de latência prolongada que permite a identificação de metástases no pulmão. Assim, esse modeloEspelha a metástase do câncer de mama humano e oferece um sistema único para avaliar a eficácia das terapias adiposas administradas por impacto na regulação da sobrevida livre de doença e / ou sobrevivência global com pontos finais definidos por diretrizes da IACUC.
Uma vez que uma grande proporção de mulheres com câncer de mama são tratadas por ressecção cirúrgica de tumores primários 10 , e aqueles que progridem posteriormente desenvolvem metástases distal, isso implica que a disseminação e a semente ocorreram antes da ressecção cirúrgica. Os microambientes de órgãos distal fornecem nichos exclusivos para células metastáticas sobreviventes e / ou proliferantes 11 . Assim, é imperativo que os sistemas modelo imitam essas facetas, de modo que moléculas e caminhos operacionais em sites secundários, que são provavelmente distintos dos tumores primários, podem ser identificados, estudados e terapias que os direcionem com precisão para avaliar a eficácia. O modelo aqui desenvolvido fornece esses aspectos para estudo.
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Disclosures
Os autores não apresentam divulgação de conflito com os dados aqui apresentados.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Jo Hill por assistência de histopatologia, o Dr. John Gleysteen para instrução em técnica cirúrgica, Tessa Diebel para assistência em videografia, todos os membros dos laboratórios de Wong e Coussens para insights críticos e discussões, e OHSU Knight Cancer Institute para apoio financeiro. Os autores reconhecem o apoio de T32GM071388-10 e T32CA106195-11 para CEG, o NCI / NIH, o Departamento de Defesa do Programa de Pesquisa sobre o Câncer de Mama, a Fundação Susan G Komen, a Fundação de Pesquisa sobre o Câncer de Mama e uma Fundação Stand Up To Cancer - Lustgarten Subvenção de Pesquisa Translacional da Equipe de Sonhos de Convergência de Câncer de Pâncreas (SU2C-AACR-DT14-14) para a LMC, um Prêmio da Fundação de Doação Feminina da MHW e o Centro Brenden-Colson para Saúde do Pâncreas para MHW e LMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
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