Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression einer großen Reihe von Genen auf der klonalen Ebene zu bewerten. Einzellige RT-qPCR produziert höchst zuverlässige Ergebnisse mit einer starken Empfindlichkeit für Hunderte von Proben und Gene.

Abstract

Die Genexpression Heterogenität ist ein interessantes Feature in lymphatischen Populationen zu untersuchen. Genexpression in diesen Zellen variiert während der Zellaktivierung, Stress oder Stimulation. Einzelzell - multiplex Genexpression ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung von zehn Gene ^{1, 2, 3.} Auf der Ebene einzelner Zellen, Multiplex - Genexpression bestimmt Bevölkerung Heterogenität ^{4, 5.} Es ermöglicht die Unterscheidung der Bevölkerungs Heterogenität durch sowohl die wahrscheinliche mix von unterschiedlichen Vorstufen unter reifen Zellen und auch die Vielfalt von Zellantworten auf Stimuli zu bestimmen.

Angeborene lymphatischen Zellen (ILC) wurden als eine Population der angeborenen Effektoren der Immunantwort ^{6, 7} kürzlich beschrieben. In diesem Protokoll Zell Heterogenität der ILC erPatic Fach wird während der Homöostase untersucht.

Derzeit ist die am weitesten verbreitete Technik Genexpression zu bewerten ist RT-qPCR. Bei dieser Methode wird die Genexpression nur ein Gen zu einem Zeitpunkt. Darüber hinaus kann dieses Verfahren nicht Heterogenität der Genexpression abzuschätzen, da mehrere Zellen für einen Test benötigt werden. Dies führt zu der Messung des mittleren Genexpression der Bevölkerung. Wenn eine große Zahl von Genen, die Beurteilung, RT-qPCR wird ein zeit-, reagenzien und Probenaufwändige Methode. Daher begrenzen die Trade-offs, die Anzahl der Gene oder Zellpopulationen, die ausgewertet werden können, wodurch das Risiko von der globalen Bild fehlt.

Diese Handschrift beschreibt, wie Einzelzellen-Multiplex-RT-qPCR verwendet werden können, um diese Beschränkungen zu überwinden. Diese Technik wurde von den letzten Mikrofluidik technologischen Fortschritt profitiert ^{1, 2.} Reaktionen auftreten in Multiplex-RT-qPCR-Chips nicht EXCNano--Ebene eed. Daher können Einzelzell Genexpression sowie gleichzeitige multiple Genexpression in einer reagenziendurchgeführt werden, Proben- und kostengünstige Weise. Es ist möglich , Zellen Gen - Signatur Heterogenität an der klonalen Ebene zwischen den Zell - Untergruppen in einer Population in verschiedenen Entwicklungsstadien oder unter verschiedenen Bedingungen ^{4, 5} zu testen. Die Arbeit an seltenen Populationen mit einer großen Anzahl von Bedingungen auf der Ebene einzelner Zellen ist nicht mehr eine Einschränkung.

Introduction

In den letzten Jahren, angeborene lymphatischen Zellen (ILC) wurden zunehmend untersucht. Trotz ihres Mangels an antigenspezifischen Rezeptoren, sie gehören zu der lymphoiden Abstammungslinie und stellen wichtige sentinels für Gewebe-Homöostase und Entzündung. ILCs werden derzeit in drei Gruppen unterteilt auf der Grundlage ihrer Expression spezifischer Transkriptionsfaktor - Kombinationen und auf ihrer Fähigkeit , Cytokine ^{7 6,} zu erzeugen.

ILCs tragen zu zahlreichen Homöostase und pathophysiologischen Situationen in den verschiedenen Organen über spezifische Zytokin - Produktion ^{8, 9.} Um die Rolle dieser Zellen zu verstehen, ist es wichtig, die verschiedenen Subpopulationen ILC pro Organ zu bestimmen und deren Entwicklungsbeziehungen zu identifizieren. Zusätzlich wurden Phänomene der Plastizität zwischen den verschiedenen Untergruppen verwandt. Durch die Heterogenität des Studiumsder Zellen, die in einem Organ, ist es möglich, die Reifungsstufe zu begrenzen und ihre spezifischen Funktionen zu unterscheiden.

Um die Technik der Single-Cell - Multiplex - RT-qPCR illustrieren, wurden Leber ILCs gewählt, mit einem besonderen Schwerpunkt auf ihre Heterogenität innerhalb der gleichen ILC Gruppe (Typ 1 ILC) ^10. Zuerst wird durch die Verwendung von Durchflusszytometrie, drei verschiedene ILC-Populationen wurden in der Leber gekennzeichnet. Gruppe 1 ILC entspricht rund 80% der angeborenen Effektoren, während die beiden anderen Populationen sind selten Leber ILC Populationen (weniger als 5% der angeborenen Effektoren). Diese Populationen wurden unter Verwendung allgemein ausgedrückt Zelloberflächenmarker von ILC Populationen sortiert. Als Ergebnis sortiert ILC-Populationen in der Leber weitgehend ähnlich aussehen einem zum anderen.

Einzellige Multiplex - RT-qPCR hat sich als eine der besten Techniken entstanden, umgehend die Heterogenität dieser Populationen ¹¹ untersuchen . Zwei Hauptmerkmale werden bestimmt, indem die Vorteile der Single-Cell-Multiplex-RT-qPCR-Technik nehmen. Erstens, indem auf der klonalen Ebene sucht, ist es möglich, zellspezifischen Genexpression für einen Vergleich zwischen den Zellen, die offenbar zeigen ähnliche Entwicklungsstadien zu erholen. Dann wird durch bei einer vorgewählten Kombination von Genexpressions suchen, werden wir neue Gensignaturen basierend auf simultanen Genexpressionsmuster zu einem Zeitpunkt bestimmen. Diese Aspekte ermöglichen die Sammlung einer großen Vielzahl von Expressionsdaten für eine große Anzahl von Zellen, auch bei seltenen Populationen, da die Technik auf der klonalen Ebene durchgeführt wird. Dadurch werden kann ILC Heterogenität in der Leber ausreichend bewertet.

Als nächstes wird durch alle Zellen mit einem globalen ILC Phänotyp Sortierung, eine breite Übersicht über die Mehr Genexpression der Leber ILC Populationen erhalten wird, auch wenn sie extrem selten Populationen repräsentieren. Ein Mikrofluidik-basierten Chip ermöglicht das Experimentieren mit selbsteine geringe Menge an Zellmaterial. Als Folge können die Genexpressionsprofile von seltenen Zellpopulationen erhalten werden. Mit Online-Gen-Signatur-Analyse-Software, Zellpopulation Cluster und mögliche Zell Beziehungen untersucht werden. Folglich können Funktionstests durchgeführt werden , um die Cluster - Daten auf der in - vivo - Ebene zu überprüfen.

Zehn Genexpressionen werden könnten gleichzeitig auf Hunderte oder mehr einzelne Zellen auf dem gleichen Chip ^{3, 11, 12} bewertet. Design des Assays ist der längste und wichtigste Teil des Experiments. Die Bestimmung der Gene, die für die Hypothese getestet werden, ist von größter Bedeutung relevante Ergebnisse zu erhalten. Zweitens, die interne Kontrolle (wie bekannte Oberflächenmarker für das Sortieren verwendet) und spezifische Kontrollen erforderlich sind. Dies ist entscheidend, um die Primer-Amplifizierung Spezifität zu testen, die Effizienz der Amplifikation und ter ohne Primer Wettbewerb. Daher arbeitet mit Einzelzell Multiplex-RT-qPCR ist ein zeitsparendes Verfahren, das als Multiple-Genexpression einer Zelle zur gleichen Zeit beurteilt wird.

Mit dem gleichen Chip und Mischung von Reagenzien für alle Zellen begrenzt die möglichen Fehler der Manipulation und ermöglicht die Reproduzierbarkeit zwischen den Proben. Insgesamt lassen sich die verschiedenen Aspekte der Einzelzellen-Multiplex-RT-qPCR zur Herstellung von hochzuverlässige Ergebnisse auf der klonalen Ebene mit einem hohen Grad an Empfindlichkeit für eine Vielzahl von Proben und Genen. Die erzielten Ergebnisse bieten leistungsfähige und robuste Daten für biostatistischen Tests.

Dies kann aufgrund der mikrofluidischen Aspekt des Verfahrens erreicht werden, was auf sehr geringe Mengen an Material für die Arbeit ermöglicht und führt zu erschöpfende Ergebnisse. Schließlich Online-Software verwenden, ist es möglich, die gewünschten Populationen zu vergleichen.

Protocol

Alle Tierversuche wurden vom Institut Pasteur Sicherheitsausschuss in Übereinstimmung mit dem Französisch Landwirtschaftsministerium und die EU-Richtlinien genehmigt.

1. Bereiten Sie eine 96-Well-Einzellige Sortierplatte

1. Bereiten Vorverstärkung Mischung in einem 1,5-ml-Röhrchen durch Zugabe von 5,0 ul spezifischen Retrotranskriptionspuffer 1,3 & mgr; l niedrigen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) TE-Puffer (10 mM TE-Lösung, pH 8, und 0,1 mM EDTA-Lösung, 0,2 & mgr; M filtriert ) und 0,2 ul Taq DNA - Polymerase pro Vertiefung (Abbildung 1a).
2. Auf einer 96-Well-Platte, verteilen 6,5 ul Vorverstärkung Mischung in jeder Vertiefung (bis zu 48 Wells). Diese Platte ist der 96-Loch-Einzelzellsortierplatte.
   HINWEIS: eine elektronische Pipette wird für dieses Protokoll empfohlen. Es ermöglicht eine genaue und reproduzierbare Volumenmessungen und spart Zeit.

(A) Auf der 96-Well - Einzelzellsortierung Platte, die Vorverstärkung Mischung zuerst durch die 0,2x Testansatz anschließend verteilt wird. (B) Die Aufzeichnung jeder einzelnen Zellenposition sollte auf einer Kalkulationstabelle gehalten werden. Ein gut ohne eine Zelle ist ein "no-Eingang" gut bezeichnet und kann als Kontrolle verwendet werden. Zwei Reihen können Primer Effizienz zu steuern , mit cDNA - Verdünnung (sequentiell ein-in-zehn Verdünnungen aus dem Äquivalent von 10 ⁵ Zellen zu einer Zelle) eingespart werden. (C) Auf der 96-Well - Testplatte wird das Assay - Reagenz Lade erste verteilte, durch die Zugabe der Primer gefolgt. Vergessen Sie nicht, ein Layout der einzelnen Primer Position zu halten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Bereiten Sie einen 0,2x - Assay - Mix in einem 1,5 - ml - Röhrchen durch Zugabe von 1,4 ul jeder Primer (Primer 20x; bis zu 48 verschiedene Sonden, siehe Tabelle 1). Stellen Sie das Endvolumen auf 140 ul mit niedrigem EDTA TE-Puffer.
4. 2,5 ul der 0.2x-Assay-Mix zu den 48 Brunnen in der 96-Well-Einzelzellensortierplatte Verteilen Sie die Vorverstärkung Mix.
   HINWEIS: Das Endvolumen in jeder Vertiefung der 96-Well-Probenplatte sollte 9 & mgr; l sein.
5. Verschließen Sie die Platte mit einer Abdeckfolie. Vortex, um die Platte und drehen Sie es bei 280 × g für 45 Sekunden nach unten. Lagern Sie den 96-Loch-Einzelzellsortierplatte bei -20 ° C oder es sofort verwenden.

2. Einzel Zelldissoziationsmedium

1. Mit Hilfe eines CO ₂ Zuführsystem, einschläfern eine Maus durch Hypoxie. Befestigen Sie die Maus auf einer Dissektion Platte und öffnen Sie die Bauchhöhle längs einer Schere.
2. Recover ILCs aus der Leber.
   1. Vor der Leber Isolation bündig LIVer-zirkulierenden Zellen.
      1. Um die Pfortader bringen, bewegen Sie den kleinen und den Dickdarm auf die linke Seite der Maus; die Pfortader erscheint als die größte Vene in der Bauchhöhle.
      2. Mit einer 10-ml-Spritze und ein 0,45 mm-Nadel, spülen Sie die Leber mit phosphatgepufferter Salzmedium (PBS) durch die Pfortader. Um Leberspülung erleichtern, schneiden Sie den Magen-Arterie mit einer Schere.
      3. Um die Gallenblase zu entfernen, kneifen die Basis der Gallenblase mit einer Pinzette und es von der Leber mit einer Schere trennen.
      4. Um die Leber zu isolieren, kneifen die Basis der Leber mit einer Pinzette und mit einer Schere, trennen Sie die Leber aus dem Rest der Bauchhöhle.
      5. Transferieren, die Leber in einem Potter-Röhrchen mit 5 ml Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 2% fötales Kälberserum (FCS).
3. Distanzieren die Leber mit einem mechanischen Dissoziation einen Stößel. Übertragen Sie das Medium auf eine 15-ml-Tube. Bringen Sie das Gesamtvolumenauf 14 ml mit RPMI 2% FCS. Lassen Sie die Zellsuspension auf Eis für 15-20 min die Hepatozyten zu dekantieren.
4. Gewinnen Sie den Überstand (ohne die Hepatozyten) in einem neuen 15-ml-Röhrchen eine 1 ml-Pipette (12 ml Überstand zu rechnen). Zentrifugieren bei 120 xg für 7 min bei 10 ° C. Entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation.
5. Resuspendieren des Pellets in Schritt 2.4 in 14 ml Dichtegradientenmedium (beispielsweise Percoll 40%). Zentrifugieren bei 600 xg für 20 min bei 20 ° C. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen.
6. Resuspendieren des Pellets in 1 ml Kaliumacetat (ACK). Lassen bei Raumtemperatur für 1 min. Nach 1 min, bringt das Gesamtvolumen auf 14 ml mit Hanks Balanced Salzlösung (HBSS) 2% FCS. Zentrifugieren bei 120 xg für 7 min bei 10 ° C. Überstand verwerfen.
7. Beflecken die Zellen.
   1. Das Pellet in 300 ul biotinylierten Antikörper - Mix (die Werkstoff - Tabelle sehen, fügen Sie alle biotinylierten Antikörper erwähnened) und übertragen Sie die Zellen in 1,5 ml-Tube. Lassen Sie es im Dunkeln für 20 min bei 4 ° C.
   2. Bringt das Gesamtvolumen auf 1 ml HBSS mit 2% FCS. Zentrifugieren bei 120 xg für 7 min bei 10 ° C. Das Pellet in 300 ul Fluorochrom-gekoppelte Antikörper - Mix und fluorochromkonjugierten Streptavidin (die Werkstoff - Tabelle sehen, fügen Sie alle Fluorochrom-gekoppelte Antikörper erwähnt). Lassen Sie es im Dunkeln für 20 min bei 4 ° C.
8. Bringt das Gesamtvolumen auf 1 ml HBSS mit 2% FCS. Zentrifugieren bei 120 xg für 7 min bei 10 ° C. Entfernen Sie den Überstand einer 1 ml Pipette. Das Pellet in 1 ml HBSS und Propidiumiodid (Pi; 1: 4000).
   HINWEIS: Wenn die weithin ausgedrückt ILC Zelloberflächenmarkern, 3 Populationen sind definiert: NKp46 ⁺ IL-7Rα ^-, NKp46 ⁺ IL-7Rα ⁺ und NKp46 ^- IL-7Rα ^+. Alle Populationen sind sortiert Linie ^- CD3 ^- CD4 ^- CD45.2 ^+.

3. Einzellige Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

1. Verwenden Sie FACS einzelnen Zellen ¹³ zu sortieren.
   HINWEIS: Verschiedene Zelltypen können auf dem gleichen 96-well Einzelzellsortierplatte (2) sortiert werden.
   1. Verwenden Sie FACS eine Zelle zu sortieren pro Vertiefung der 0.2x-Assay-Mix enthält, und die Vorverstärkung Mischung auf dem 96-Loch-Einzelzellsortierplatte. Verwenden Sie eine frisch zubereitete 96-Well-Einzelzellensortierplatte oder tauen sie bei -20 ° C, wenn gespeichert.
      1. Setzen Sie einen versiegelten 96-Well-Platte auf dem FACS Schildhalter. Verwenden Sie eine leere 96-Well-Platte als Test. Positionieren Sie die Platte mit dem A1-gut auf der linken Seite und in Richtung der Experimentator.
      2. Stellen Sie den Plattenhalter einen Tropfen in der Mitte des A1-gut mit Verifikations Perlen zu erhalten.
      3. Wiederholen Sie Schritt 3.1.1.2 mit allen Vertiefungen in der Linie A.
      4. Entfernen Sie die Dichtung von der 96-Well-Platte und sortieren 100 Überprüfung Perlen pro Vertiefung. Überprüfen Sie für drop Bildung in der Mitte der Vertiefungen.
      5. Bei richtiger Einstellung, stellen Sie den 96-Loch-Einzelzelle auf dem Plattenhalter Sortierplatte. Zeichnen Sie die Plattenlayout und sortieren 1 Zelle pro Vertiefung.
         HINWEIS: Die richtige Positionierung jeder Zelle auf der 96-Loch-Einzelzellsortierplatte ist von wesentlicher Bedeutung. Eine Platte Layout sollte auf einem Tabellenkalkulations-Software gehalten werden. Die Plattenlayout wird in den nächsten Schritten (Abbildung 1b) ¹⁴ verwendet werden. Eine Vertiefung enthält 0,2x Assay-Mix und Vorverstärkung-Mix auf der 96-Well-Probenplatte ohne Zellen. Das gut als nicht-Eingangskontrolle verwendet. Verlassen zwei Reihen von 6 Vertiefungen für eine cDNA-Verdünnung. Diese Vertiefungen werden als Kontrollen für die Primereffizienz (1b) verwendet.
      6. Lagern Sie den 96-Loch-Einzelzellsortierplatte bei -20 ° C oder es sofort verwenden.

4. Vorverstärkung

1. Verwenden Sie einen frisch oder aufgetaut 96-Well-Einzelzellensortierplatte obtained in Schritt 3.1.1.6. Vortex, um die Platte und drehen Sie es nach unten (280 × g für 45 sec).
2. Legen Sie die 96-Loch-Einzelzellensortierplatte auf dem Thermocycler. Führen der reversen Transkription und Vorverstärkung gemäß dem genannten Programm in Abbildung 3 und Tabelle 2.

Abbildung 3: Vorverstärkung Programm. Um genügend Material, Pre-Amplifikation spezifischer Zielgene auf sortierte Einzelzellen aufweisen muss. Die 96-Loch-Einzelzellensortierplatte wird auf einem Thermocycler geladen, um die Vorverstärkung Programm zu folgen. Die vorge Amplifikationsprodukte werden dann mit niedrigen EDTA TE-Puffer verdünnt und kann sofort oder bei -20 ° C eingefroren werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Verdünnen Sie die Pre-AmpProben Personal vorgenommen werden um 36 & mgr; l niedrig EDTA TE-Puffer Zugabe in jede Vertiefung.
4. Verschließen Sie die Platte mit einer Abdeckfolie. Vortex, um die Platte und drehen Sie es nach unten (280 g für 45 sec). Bewahren Sie die vorverstärkten, 96-Loch-Einzelzellsortierplatte bei -20 ° C oder es sofort verwenden.

5. Bereiten Sie eine 96-Well-Probenplatte

1. Bereiten Sie 191 ul Master-Mix durch Zugabe von 175 & mgr; l von qPCR-Mastermix und 17,5 ul Probenbeladung Reagenz.
2. Auf einer neuen 96-Well-Platte, verteilen 3,6 ul Master-Mix in jeder Vertiefung (bis zu 48 Wells). Dies ist die 96-Well-Probenplatte.
3. Übertragen 2,9 ul vorverstärkten cDNA aus der 96-Well-Probenplatte in das neue 96-Well-Platte. Halten Sie die gleiche Position für jede Probe zwischen dem 96-Einzelzellsortierplatte und der 96-Well-Probenplatte.
4. Verschließen Sie die Platte mit einer Abdeckfolie. Vortex, um die Platte und drehen Sie es nach unten (280 × g für 45 sec). Setzen Sie die neue 96-Well-Platte auf Eis vor Licht geschützt. Lagern Sie die 96-Well-sreichliche Platte bei -20 ° C oder es sofort verwenden.

6. Bereiten Sie eine 96-Well-Assayplatte

1. Auf einer neuen 96-Well-Platte, verteilen 3 ul Assay Laden Reagenz in jeder Vertiefung (bis zu 48 Wells). Diese Platte ist der 96-Well-Assayplatte genannt.
2. Hinzufügen 3 ul Primer in jede Vertiefung. Halten Sie ein Layout auf einem Tabellenkalkulations - Software (Abbildung 1c und Tabelle 1; verwenden , um alle aufgelisteten Primer , die in Tabelle 1). Die richtige Positionierung der einzelnen Primer auf der 96-Well-Assayplatte ist für die nächsten Schritte.
   1. Wenn die Anzahl der Proben unter 48 ist, fügen Sie Wasser anstelle von Primern an nicht verwendeten Wells.
3. Verschließen Sie die Platte mit einer Abdeckfolie. Vortex, um die Platte und drehen Sie es nach unten (280 × g für 45 sec). Lagern Sie die 96-Well-Testplatte bei -20 ° C oder es sofort verwenden.
   HINWEIS: Zum wiederholtem Einfrieren und Auftauen der Primer zu vermeiden, verteilen die Primer für die Vorverstärkung Mischung und für die 96-well Assayplatte zur gleichen Zeit.

7. Einzelzellen-Gen-Expression Chip

1. Platzieren Sie den integrierten mikrofluidischen Schaltung (IFC) auf der Bank und überprüfen Sie die Ventile des verkappten Spritze. Öffnen Sie die Spritze, legen Sie sie senkrecht auf das Ventil, und drücken Sie sie fest. Der O-Ring sollte bewegen. Füllen Sie den Chip mit Steuerleitung Flüssigkeit (0,3 ml Tuberkulin).
2. Wiederholen Sie Schritt 7.1 mit dem zweiten Ventil.
   HINWEIS: Keine Flüssigkeit sollte über den Chip verschüttet werden.
3. Entfernen Sie die blaue Folie von der Unterseite des Chips. Laden Sie den Chip in den IFC Controller. Auf der IFC Controller-Bildschirm, wählen Sie "PRIME" und dann auf "Ausführen". Die Steuerung der Mikrofluidik-Linien letzten 10 min.
4. Werfen Sie die Chip und wieder verschließen die blaue Folie auf der Unterseite des Chips.

Abbildung 4: Ein-Zellen - Multiplex - Gen-Expression Chip Laden. Diese Schritte erfordern great Präzision, vor allem während der Übertragung der 96-Well-Platte in die Einzelzellen-Multiplex-Gen-Expression-Chip. Um das Laden von Fehlern und Fehlstellungen zu vermeiden, ist es dringend empfohlen, sequentiell zu arbeiten. Das Volumen für jede Übertragung genommen sollte während des Pipettierprozeß gesteuert werden. Schließlich ist es wichtig, jegliche Luftblasen zu vermeiden, und sie im Falle der Bildung zu entfernen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Mit einem 8-Kanal-Pipette, Transfer 5 ul von der 96-Well-Assayplatte auf der A1 Seite (linke Seite) des Chips. Füllen Sie die linke Seite des Chips, wie in Abbildung 4 dargestellt. Achten Sie darauf, immer das gleiche Volumen in die Spitzen ziehen.
   1. Nicht Blasen erstellen. Wenn Blasen auftreten, entfernen Sie diese 10 ul Tipps. Ändern Tipps für jede Vertiefung des Chips.
6. Wiederholen Sie Schritt 7.5 auf der rechten Seite of der Chip unter Verwendung von 5 & mgr; l aus der 96-Well-Probenplatte.
7. Entfernen Sie die blaue Folie von der Unterseite des Chips. Laden Sie den Chip in den IFC Controller. Auf der IFC Controller-Bildschirm, wählen Sie "RUN SCRIPT" und dann auf "Ausführen". Die Beladung der mikrofluidischen Linien dauert 45 min.
8. Werfen Sie die Chip und wieder verschließen die blaue Folie auf der Unterseite des Chips.

8. Führen Sie den Chip

1. Auf der Mikrofluidik-qPCR-Computer, wählen Sie die "Datensammlung" Software. Sobald es gestartet wird, wählen Sie "Neu Ausführen".
2. Wählen Sie "Eject", entfernen Sie die blaue Folie von der Unterseite des Chips und den Chip laden. Platzieren Sie den Chip auf der A1 und auf der linken Seite zu gelangen und in Richtung der Experimentator.
3. Ein "Projekteinstellung" die Option "Keine" und dann auf "Weiter".
4. Wählen Sie "Neu-Chip laufen", "Neue Chip-Verzeichnis" (Erstellen Sie einen Ordner für das Experiment) und "Weiter".
5. On "Genexpression" wählen "; Passive reference = ROX "(Carboxy-X-Rhodamin) und" Single-Sonde, "den richtigen Filter wählen die Primer entsprechend wählen." Weiter ".
6. Wählen Sie "Durchsuchen" und wählen Sie das richtige Programm nach den verwendeten Primer.
   HINWEIS: "Default-10min-Hotstart.pcl" ist der am häufigsten verwendete Programm für die Einzelzell-Multiplex-RT-qPCR.
7. Wählen Sie "Start Run". Die Reaktion dauert etwa 90 min.
8. Sobald Sie fertig sind, wählen Sie "Eject-Fertig."

9. Datenanalyse

1. Öffnen Sie die "Real-Time PCR-Analyse" Software, wählen Sie "Datei" und "Öffnen", finden das Experiment Ordner, und wählen Sie "ChipRun.bml-Datei."
2. Klicken Sie auf "Analyse-Ansicht", "Ergebnistabelle" und "Heat Map View;" Boxen mit einem "X" gekennzeichnet sind, sind unterhalb des Schwellenerkennungspegel und / oder schlechte Amplifikationskurven hatte.
3. Nennen Sie die Proben. Gehen Sie auf "Sample Setup" und select "New SBS 96." Klicken Sie auf "Mapping" und wählen Sie "..." Kopieren Sie den Beispiel Layout-Design aus dem Tabellenkalkulationssoftware. Definieren Sie den eingefügten Layout als "Sample Name."
4. Nennen Sie die Tests. Wiederholen Sie Schritt 9.3 mit den Primer-Namen in "Detektor-Setup." Definieren Sie den eingefügten Layout als "Detektor Name".
5. Klicken Sie auf "Analyse Ansicht" und "Analysieren"; Die Probe und Primer - Namen werden auf den Proben und Primer (Abbildung 7) zurückgeführt automatisch.
6. Berechnen Ct, Delta Ct, und Falten Sie ändern für jede Probe. Verwenden Sie ein Housekeeping - Gen als eine interne Kontrolle (hier GAPDH):
   ACt = Ct _Probe - Ct _{interne Kontrolle}
   Fold Change = 2 ^{- (ΔCtsample-ΔCtnegative Kontrolle)}
   1. Klicken Sie auf "Detector Setup" und wählen Sie das auch ohne Eingangskontrolle (verwenden Sie das Housekeeping-Gen als eine interne Kontrolle der Genexpression zu normalisieren). Wählen Sie "Editor "," Referenz zu definieren "und" Update ".
   2. Wählen alle Vertiefungen, auf die die oben definierte interne Kontrolle angewendet. Wählen Sie "Editor" und "definieren Sie als Test." Wählen Sie eine entsprechende Referenz-Gen und klicken Sie auf "Update".
   3. Wählen Sie "Sample Setup" und die negative Kontrolle zu wählen. Wählen Sie "Editor" und definieren "Reference." Klicken Sie auf "Update".
   4. Wählen Sie "Analysis View" und "Analyse"; der Delta-Ct und Fold Change wird automatisch berechnet.
7. Exportieren Sie die Daten. Wählen Sie "Datei" und "Export, speichern unter" Tabelle Ergebnisse ", wählen Sie den Zielordner, und klicken Sie auf" Speichern "und" Exit ".
8. Wiederholen Sie Schritt 9.7, aber statt "Tabelle Ergebnisse," Speichern unter "HeatMap Ergebnisse."

Results

Lymphatische Populationen zeigen eine große Vielfalt in der Genexpression. In diesem Protokoll wurde ILC Kompartiment Leber Heterogenität untersucht unter Verwendung von Expressionseinzelzell-Multiplex-RT-qPCR-Gens. Im Gegensatz zu anderen Techniken Genexpression ermöglicht Single-Cell-Multiplex-RT-qPCR Genexpression Arbeiten an mehreren Populationen, auch die seltensten, zugleich. Diese Spezifität, gekoppelt mit einer hohen Empfindlichkeit bei der klonalen Ebene, ermöglicht die Untersuc...

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie erschöpfend Genexpression Informationen auf der klonalen Ebene zu erhalten. Hier untersuchten wir ILC Kompartiment Heterogenität Leber. Nach einer Einzelzellsortierung verschiedener ILC Populationen (basierend auf weit ILC Oberflächenmarker ausgedrückt) wurden die Proben für bestimmte vorgewählte Gene vorverstärkt. Dann wurden die erhaltenen cDNA-Primer und geladen auf ein Multiplex-RT-qPCR mikrofluidischen Chip. Schließlich erhalten wir die Expression von 48 verschiedenen Genen aus 48 E...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells Direct One Step qRT-PCR Kit	Angewandte Biosysteme	11753100	Primer-Sonden-Detektionskit. Enthält 2x Reaktionsmix, SSIII Platinium Enzym.
Low TE EDTA Buffer	Affymetrix	75793 100ML
96-Well-Platten	Thermofisher Scientific	AB 1100	96-Well-Platten geeignet für Zellsortierung und Thermocycling
Deckfolie	Dominique Dutscher	106570	Aluminium-Deckfolie; Vermeidung von Kontamination und Verdunstung
Actb	Thermofisher Scientific	Mm00607939_s1	20x Primer
Aes	Thermofisher Scientific	Mm01148854_s1	20x Grundierung
Ahr	Thermofisher Scientific	Mm00478932_s1	20x Grundierung
Bcl2	Thermofisher Scientific	Mm00477631_s1	20x Grundierung
c-myc	Thermofisher Scientific	Mm00487804_s1	20x Grundierung
Cbfb	Thermofisher Scientific	Mm01251026_s1	20x Grundierung
Cd27	Thermofisher Scientific	Mm01185212_s1	20x Grundierung
Cd49a	Thermofisher Scientific	Mm01306375_s1	20x Grundierung
CD49b	Thermofisher Scientific	Mm00434371_s1	20x Grundierung
Cxcr5	Thermofisher Scientific	Mm00432086_s1	20x Grundierung
Cxcr6	Thermofisher Scientific	Mm02620517_s1	20x Grundierung
Eomes	Thermofisher Scientific	Mm01351985_s1	20x Grundierung
Ets1	Thermofisher Scientific	Mm01175819_s1	20x Grundierung
Foxo1	Thermofisher Scientific	Mm00490672_s1	20x Grundierung
Gapdh	Thermofisher Scientific	Mm03302249_s1	20x Grundierung
Gata3	Thermofisher Scientific	Mm00484683_s1	20x Grundierung
Gm-csf	Thermofisher Scientific	Mm01136644_s1	20x Grundierung
Hes1	Thermofisher Scientific	Mm01342805_s1	20x Grundierung
Hprt	Thermofisher Scientific	Mm00446968_s1	20x Grundierung
Id2	Thermofisher Scientific	Mm01293217_s1	20x Grundierung
Il-12rb2	Thermofisher Scientific	Mm00711781_s1	20x Grundierung
Il-18r1	Thermofisher Scientific	Mm00515178_s1	20x Grundierung
Il-1rl1	Thermofisher Scientific	Mm00434237_s1	20x Grundierung
Il-22	Thermofisher Scientific	Mm001226722_s1	20x Grundierung
Il-23r	Thermofisher Scientific	Mm00519943_s1	20x Grundierung
Il-2ra	Thermofisher Scientific	Mm01340213_s1	20x Grundierung
Il-2rb	Thermofisher Scientific	Mm01195267_s1	20x Grundierung
IL-7r	Thermofisher Scientific	Mm00434295_s1	20x Grundierung
Klr5	Thermofisher Scientific	Mm04207528_s1	20x Grundierung
Lef1	Thermofisher Scientific	Mm00550265_s1	20x Grundierung
Ncr1	Thermofisher Scientific	Mm01337324_s1	20x Grundierung
Nfil3	Thermofisher Scientific	Mm01339838_s1	20x Grundierung
Notch1	Thermofisher Scientific	Mm00435249_s1	20x Grundierung
Notch2	Thermofisher Scientific	Mm00803069_s1	20x Grundierung
Rora	Thermofisher Scientific	Mm01173766_s1	20x Grundierung
Rorc	Thermofisher Scientific	Mm01261022_s1	20x Grundierung
Runx3	Thermofisher Scientific	Mm00490666_s1	20x Grundierung
Tbx21	Thermofisher Scientific	Mm01299453_s1	20x Grundierung
Tcf3	Thermofisher Scientific	Mm01175588_s1	20x Grundierung
Tcf7	Thermofisher Scientific	Mm00493445_s1	20x Grundierung
Tle1	Thermofisher Scientific	Mm00495643_s1	20x Grundierung
Tle3	Thermofisher Scientific	Mm00437097_s1	20x Grundierung
Tsc22d3	Thermofisher Scientific	Mm01306210_s1	20x Grundierung
Tnfrsf11a	Thermofisher Scientific	Mm00437132_s1	20x Grundierung
Tox	Thermofisher Scientific	Mm00455231_s1	20x Primer
Zbtb16	Thermofisher Scientific	Mm01176868_s1	20x Primer
Zbtb7b	Thermofisher Scientific	Mm00784709_s1	20x Primer
qPCR Master Mix	Applied BioSystems	P/N 4304437
2x Assay Loading Reagenz	Fluidigm	P/N 85000736	Spezifische Dichte Medium zu Load Assays in Multiplex-RT-qPCR Mikrofluidik-Chip.
2x Probenladereagenz	Fluidigm	P/N 85000735	Medium mit spezifischer Dichte zum Laden von Proben in einen Multiplex-RT-qPCR-Mikrofluidik-Chip.
48.48 multiplex RT qPCR Mikrofluidik-Chip	Fluidigm	BMK-M-48.48	48.48 Dynamic Array IFC für die Genexpression; Chip für Einzelzell-Multiplex RT-qPCR-Reaktion
48.48 multiplex RT qPCR mikrofluidischer Chip-Controller	Fluidigm	89000020	48.48 IFC Controller; Steuerung des Chips internes fluidisches System, Laden von Proben und Assays in Reaktionskammern
multiplex RT qPCR mikrofluidischer Thermocycler	Fluidigm	GE48.48	48.48 Dynamic Array IFC Thermocycler
96-Well-Platten	Thermofisher Scientific	AB 1100	96-Well-Platten, geeignet für Zellsortierung und Thermocycling
C57Bl/6 Mäuse	Janvier	C57Bl/6 miceJ@RJ
10 ml Spritze	BD Biosciences	309639
PBS	Life Technologies	14040174
HBSS	Life Technologies	24020133
RPMI	Life Technologies	61870044
FCS	CVFSVF000U	Eurobio Abcys	Standard fötales Kälberserum
Potter Tube	N/A
15 ml Tube	Corning	352097
1,5 ml Tube	Sigma-Aldrich	T9661-1000EA
FACS Maschine	N/A
Zentrifuge	Thermofisher Scientific	75004538
1.000 &Mikro; l Tipps	Fisher Scientific	10313272
P1000	Gilson	F123602
Percoll	Dominique Dutscher	17-0891-01
Facs Tube	Falcon	352235
Anti-CD8 Biotin Maus Antikörper	Sony	1103520	Linie
Antikörper Anti-CD19 Biotin Maus Antikörper	Sony	1177520	Linie Antikörper
Anti-TCRab Biotin Maus Antikörper	BioLegend	Antikörper	109204-Linie
Anti-TCRgd Biotin Antikörper für die Maus	BD Biosciences	553176	Linie Anti-Ter119
Biotin Antikörper für die Maus	BD Biosciences	der 553672	Linie Anti-Gr1
Biotin Maus	BD Biosciences	Antikörper der	553125-Linie
Anti-CD45.2 PerCPCy5.5 Antikörper für die Maus	BioLegend	109828
Anti-IL7ra PeCy7 Maus-Antikörper	ebioSciences	25-1271-82
Anti-CD3 BV510 Maus-Antikörper	BD Biosciences	563024
Anti-CD4 BV786 Maus-Antikörper	BD Biosciences	563727
Anti-NKp46 PE Maus-Antikörper	ebioSciences	12-3351-82
Streptavidin	Sony	2626025
Propidium Iodid	Sigma-Aldrich	P4864-10ML
Elektronische Pipette	Eppendorf	4986000017
Combitips 0,1 ml	Eppendorf	30089405
Mehrkanalpipette	Rainin	L8-10XLS+
Accudrop	BD Biosciences	345249	Verifizierungsbeads für FACS