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Untersuchen Assemblierungsintermediate mit rekombinantem Archaeal Proteasomen und nicht denaturierenden PAGE: Die Argumente für einen kombinierten Ansatz

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DOI:

10.3791/54860

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17. Dezember 2016

 , 
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll nutzt sowohl die Untereinheit Koexpression und postlysis Untereinheit für eine gründlichere Untersuchung der rekombinanten Assemblierungsintermediate mischen.

Zusammenfassung

Proteasomen sind in allen Bereichen des Lebens zu finden. Sie bieten den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbaus in Eukaryoten, obwohl ihre Montage nicht vollständig verstanden wird. Alle Proteasomen enthalten einen strukturell konservierten Kernpartikel (CP) oder 20S-Proteasoms, die zwei heptameren Ringe β-Untereinheit zwischen zwei heptameren α-Untereinheit Ringe eingeklemmt. Archaeal 20S Proteasomen sind kompositorisch einfacher im Vergleich zu ihren eukaryotischen Kollegen, aber sie beide teilen eine gemeinsame Montagemechanismus. Folglich weiterhin Archaea 20S Proteasomen wichtige Modelle für eukaryotische Assemblierungsintermediate zu sein. Insbesondere wurde die rekombinante Expression von Archaea-20S Proteasomen in Verbindung mit nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) viele wichtige Einblicke in Proteasom-Biogenese ergab. Hier diskutieren wir ein Mittel auf die übliche Strategie der Co-Expression von Archaea-Proteasom-α zu verbessern und ß-Untereinheiten vor nondenaturing PAGE. Wir zeigen, dass, obwohl eine schnelle und effiziente, eine Co-Expression Ansatz allein Schlüssel Assemblierungsintermediate verpassen. Im Falle des Proteasoms, Koexpression erlauben nicht Detektion des Halb Proteasom, ein Zwischenprodukt, enthaltend ein vollständiges α-Ring und eine vollständige β-Ring. Jedoch ist dieses Zwischenprodukt wird leicht über Lysat Mischen detektiert. Wir schlagen vor, dass die Co-Expression mit Lysat Mischung kombiniert einen Ansatz ergibt, die bei der Analyse der Montage gründlichere ist, bleibt doch Arbeit nicht-intensiven. Dieser Ansatz kann für die Untersuchung von anderen rekombinanten Multiproteinkomplexen nützlich sein.

Einleitung

Multiproteinkomplexen führen zahlreiche kritische zelluläre Aktivitäten 1. Für viele dieser Komplexe wird über ihre Struktur und Funktion viel mehr bekannt als über ihre Montage 2,3. Das Proteasom ist ein solcher Komplex und wird in allen Lebensbereichen zu finden. In Eukaryonten ist diese molekulare Maschine am Kern des Ubiquitin / Proteasom - System (UPS) und stellt den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbau 4. Die eukaryotische Proteasom (bezeichnet als 26S Proteasom) besteht aus zwei Hauptunterbaugruppen: eine 20S Proteasom oder Kernteilchen (CP) 5, die durch einen 19S Regulatory Particle (RP) 6 an einem oder beiden Enden verschlossen sein.

Das 20S-Proteasom ist ein großer compartmentalized Protease. Seine Quartärstruktur ist absolut in allen Lebensbereichen erhalten und besteht aus einem Stapel von vier siebengliedrige Ringe, die zwei Arten von strukturell verwandte Untereinheiten, α; und ß 5,7,8. In Eukaryoten sind die beiden Außenringe jeweils aus sieben verschiedenen α-Untereinheiten und die beiden Innenringe jeweils aus sieben verschiedenen β-Untereinheiten; proteolytische Aktivität liegt innerhalb drei der β-Untereinheiten. Im Gegensatz dazu werden die CP Ringe aus Archaea und Bakterien in der Regel nur aus einer Art von α und einer Art von β-Untereinheit zusammen. Archaeal Proteasomen sind ein wichtiges Modellsystem zum Studium Assemblierungsintermediate sowohl aufgrund ihrer kompositorischen Einfachheit zur Verfügung gestellt und ihre gemeinsame Montagemechanismus mit ihren eukaryotischen Pendants 9-13 teilen. Kurz gesagt, montieren α-Untereinheiten in α Ringe erste, die dazu dienen als Gerüst, auf die ß-Untereinheiten zusammenstellen. Die resultierenden Halb Proteasomen (α 7 β 7) dimerisieren Hierdurch entstehen zu komplett montierten CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Während Dimerisierung präsentieren die Propeptide auf ß-Untereinheitenautokatalytisch entfernt werden, um die katalytischen N-terminalen Threonine auszusetzen. Die Verwendung von Archaea - Proteasomen Baugruppe Modell nimmt häufig die Vorteile der Herstellung von rekombinanten Proteinen archaeal Proteasom in Escherichia coli. Dies ist eine sinnvolle Annäherung, weil es ermöglicht, die Untereinheiten in verschiedenen Kombinationen hergestellt werden, da sowohl WT und Mutanten-Versionen in einem Wirtsorganismus, der keine eigene Proteasomen erzeugt.

Die Überwachung der Montage von Multiproteinkomplexen erfordert biochemisch eine Art Fraktionierung Methode, die vollständig zusammengebaut Komplexe von Montage Zwischen- und Vorprodukte trennt. Aufgrund ihrer überlegenen Fähigkeit der Lösung, wurde nicht - denaturierenden Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) in der Fraktionierung der verschiedenen großen Multiproteinkomplexe besonders nützlich 14-17 erwiesen. Die Kombination von rekombinanten Archaea Proteasom Produktion und nicht denaturierenden PAGE hat sich zu einem leistungsfähigen Ansatz in dissectin werdeng Assemblierungsintermediate 9,11,12,18. Jedoch ist das übliche Verfahren , mit dem dieser Ansatz angewendet (dh. Über die rekombinante Koexpression von α und β - Untereinheiten) hat einen wichtigen Nachteil. Montage Reaktionen sind kooperativ und stark konzentrationsabhängig 3. Da die Proteinkonzentration innerhalb der Zellen ist sehr hoch 19, aufgrund ausgeschlossen Volumeneffekte, Montage Reaktionen verlaufen schnell in vivo. Daher ist es möglich, wichtige Assemblierungsintermediate wenn α und β-Untereinheiten koexprimiert werden zu verpassen.

Hier streiten wir für einen kombinierten Ansatz bei der Untersuchung von Assemblierungsintermediate rekombinanten Archaea Proteasom-Untereinheiten verwendet wird. In diesem Ansatz werden beide Koexpression und Lysat Mischverfahren eingesetzt. Erstere ermöglicht eine schnelle Analyse der Montage, da die Co-Expression weniger arbeitsintensiv ist. Letzteres hängt von getrennten Expression von α und β-Untereinheiten, gefolgt von Mischen. Obwohl dieser requires etwas mehr Aufwand als Koexpression, ist es mehr als kompensiert durch die Fähigkeit, Zwischenprodukte zu erfassen, die während der Coexpression verpasst werden. Zusammen können diese beiden Methoden, um ein vollständigeres Bild der Assemblierungsintermediate liefern.

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Protokoll

1. Bakterielle Expression.

Anmerkung: Expressionsplasmide in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 1 beschrieben. Lösungen, Medien und Puffer in dieser Studie verwendet wurden, sind in Tabelle 2 beschrieben. Die Klonierung von Archaea - Proteasom - Untereinheit - Gene und die Erzeugung von Expressionsplasmiden sind an anderer Stelle beschrieben 18,20. Kurz gesagt, Plasmide für die rekombinante Koexpression von Untereinheiten verwenden eine bizistronischen Operon - Strategie , die bei der Beschaffung von 18,20 vergleichbaren Expressionsniveaus der einzelnen Untereinheiten hilft. Die Expressions unten aufgeführten Parameter wurden empirisch bestimmt für die Proteasom-Untereinheiten in dieser Studie als optimal. Es kann notwendig sein Ausdruck für andere Proteasom-Mutanten zu optimieren, für Proteasomen aus anderen Archaea Arten oder für andere rekombinante Protein-Komplexe (siehe Diskussion).

  1. Verwandeln Expressionsplasmid von Interesse in chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3) Zellen.
  2. In 1 bis 2 & mgr; l Plasmid (in der Regel 50 bis 100 ng) zu einem Aliquot von DE3-Zellen, die frisch auf Eis aufgetaut wurden, und weiter auf Eis für 20 Minuten inkubiert.
  3. Hitzeschock die Zellen bei 42 ° C für 45 s und das Rückrohr Eis für additionl 2 min.
  4. 1 ml LB-Medium und Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln (150 Upm) für 1 h.
  5. Verteilt 100-200 & mgr; l des Transformationsgemisch auf LB-kan-Platten (Platten, die festes LB-Medium, supplementiert mit Kanamycin (alle Plasmide, die in dieser Studie encode Resistenz gegen dieses Antibiotikum verwendet wird)). Die Platten bei 37 ºC O / N.
  6. Am nächsten Morgen, eine einzelne Kolonie von der LB-kan Platte in 3 ml flüssiges LB-kan Medien in einem Glaskulturröhrchen impfen. bei 37 ºC inkubieren unter Schütteln (150 rpm) für etwa 2,5 bis 3 h, oder bis die Trübung beobachtet.
  7. Messen der optischen Dichte der Kultur bei 600 nm (OD 600) in einem Spektralphotometer. Verdünnen Sie die Zelle Kulture mit einer geeigneten Menge von vorgewärmtem LB-kan - Medium auf eine OD 600 von 0,4 in einem Endvolumen von 6 ml. Lebenslauf bei 37 ºC für 40 min schütteln.
  8. Induzieren die Proteinexpression in den Flüssigkulturen durch IPTG aus einer Stammlösung bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt wird. bei 37 ºC inkubieren unter Schütteln (150 rpm) für ca. 6 - 7 h.
  9. Ernte Bakterienzellkulturen in ihrer Gesamtheit in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
  10. 1,5 ml einer Kultur in Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min.
  11. Überstand verwerfen und fügen Sie weitere 1,5 ml der gleichen Kultur zu dem Pellet. Zentrifuge bei 10.000 × g für 1 min.
  12. Wiederholen Sie Schritt 1.11, bis die gesamte Kultur in das Mikrozentrifugenröhrchen geerntet.
  13. Lagern Sie die induzierten Pellets bei -80 ° C bis Lyse.

2. Bakterienlyse und Lysate Mischen.

Hinweis: Für Proben, über die Co-Expression untersucht, Abschnitt 2.1 (und seinen Unterabschnitten) folgen. Für Proben Lysat Mischen erfordern, folgen Sie Abschnitt 2.2 (und seine Unterabschnitte). Der TSP (Total, Lösliche, Pellet) Analyse, die im Protokoll enthalten ist, ist nützlich in der Proteinexpression zu optimieren, die die α und β-Untereinheiten während des Lysats kombiniert mischen (siehe Diskussion) dazu beitragen kann etwa gleiche Mengen an. Es bietet auch eine wichtige Kontrolle , wenn Downstream - Ergebnisse nicht wie erwartet (dh überprüft er , dass Protein exprimiert wurde und löslich). Daher empfehlen wir dringend zunächst TSP Analyse. Sobald ein optimales Protokoll für eine bestimmte Untereinheit-Kombination erreicht worden ist, wird TSP Analyse nicht unbedingt erforderlich, weshalb er als optional weiter unten beschrieben wird.

  1. Lyse von Bakterienzellen und Herstellung von löslichen Fraktionen.
    1. Auftauen induzierte Zellpellet auf Eis für 5 min. Resuspendieren des Pellets in 600 & mgr; l Lyse-Puffer.
    2. IncUbate der Suspension bei 30 ºC unter Schütteln (150 Upm) für 30 min Gesamt Rohlysat zu erzeugen.
      Hinweis: Der folgende Schritt und dem Unterabschnitt , die optional sind folgende.
    3. Entfernen Sie die zwei 25 & mgr; l-Aliquots aus dem gesamten Rohlysat in getrennte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und führen TSP-Analyse wie folgt.
      1. Um einen der zwei 25 ul Aliquots, 5X SDS-Probenpuffer zu einer Endkonzentration von 1X hinzu. Das Röhrchen mit "T" für "total Rohlysat".
      2. Inkubieren Sie die "T" Probe bei 100 ºC für 5 Minuten, um vollständig Proteine ​​denaturieren.
      3. Inzwischen nehmen Sie die zweite 25 - ul - Aliquot und bei 10.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert werden . Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne das winzige Pellet zu stören, und übertragen sie auf ein neues Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml. Beschriften Sie diese neue Röhre "S" für "lösliche Fraktion".
      4. Um die winzigen Pellet links behind im vorherigen Schritt, fügen Sie 25 ul Lysepuffer und Wirbel wieder zu suspendieren. Beschriften Sie diese Röhre "P" für "Pellet-Fraktion".
      5. In 6 ul 5X SDS-Probenpuffer auf die "S" und "P" Rohre und Inkubation bei 100 ° C, wie oben beschrieben.
        Hinweis: Wenn die TSP Proben werden an diesem Tag nicht verwendet werden , um Expression zu analysieren, können sie bei -20 ° C eingefroren werden , bis sie benötigt werden . Einmal aufgetaut, müssen sie bei 100 ºC werden reinkubiert, wie oben beschrieben, unmittelbar vor dem Laden auf ein 12% und / oder 15% Standard-SDS-PAGE-Gel.
    4. Während die TSP - Analyse durchgeführt wird, Zentrifuge die restlichen 550 & mgr; l Gesamt Rohlysat für 10 min bei 10.000 × g (oder der gesamten 600 & mgr; l Gesamt Rohlysat wenn TSP Analyse nicht durchgeführt wird ). Sammeln Sie den Überstand in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Dies ist das lösliche Lysat, das zur Reinigung verwendet wird.
  2. Lysate Mischung.
    1. Führen Sie Lyse wie in den Schritten 2.1.1 und 2.1.2.
    2. Mischen Sie 600 & mgr; l der gesamten Rohlysat von Bakterien die gewünschte α-Untereinheit mit 600 & mgr; l der gesamten Rohlysat von Bakterien exprimiert das gewünschte β-Untereinheit exprimieren. bei 37 ºC inkubieren langsam mit Schütteln für 30 min.
      Hinweis: Es kann notwendig sein , um die Inkubationszeit zu optimieren maximale Anordnung während des Lysats zu erreichen Mischen (siehe Diskussion). Die Zeit und die Temperatur hier vorgestellten sind optimal für die rekombinanten Proteine in dieser Studie und wurden an anderer Stelle 18 bestimmt.
    3. Zentrifuge das gemischte Lysat bei 10000 × g für 10 min löslichem Material von unlöslichen Pellet zu trennen. Den Überstand in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie diese gemischten löslichen Lysat zur Proteinreinigung.

3. Proteinaufreinigung über immobilisiertem Cobalt Affinity Resin(ICH AUTO).

  1. Äquilibrieren des Harzes.
    1. Gründlich Resuspendieren des Harzes durch die Flasche Invertieren und Übertragung 50 & mgr; l der Aufschlämmung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 700 × g für 2 min zu Pellets Harz. Sorgfältig absaugen Überstand.
      Hinweis: Wir führen Pipette Aspiration eine blaue 1 ml Pipettenspitze mit der Masse der Flüssigkeit zu entfernen. Eine weiße 2 ul Spitze wird zur Feinsteuerung der Entfernung des verbleibenden Überstand verwendet, um eine sehr dünne Schicht aus flüssigem verlassen die Perlen bedeckt.
    2. 1 ml Puffer A Mix sanft zu resuspendieren Harz und Zentrifuge bei 700 × g für 2 min Harz zu pelletieren. aspirieren vorsichtig den Überstand und wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.
  2. Anwenden zuvor erhaltenen löslichen Lysat in Abschnitt 2.1 oder 2.2 auf die äquilibrierte Harz. Inkubieren Sie die Röhrchen mit leichter Rotation bei 4 ° C für 60 min. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g </ Em> für 5 min und den Überstand vorsichtig absaugen.
  3. Das Harz wird als nicht-spezifisch gebundene Proteine ​​zu entfernen, folgt.
    1. Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer A und Inkubation mit sanftem für 10 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.
    2. Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer B (Puffer A mit 5 mM Imidazol) und Inkubation mit sanftem für 5 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.
    3. Resuspendieren Harz mit 1 ml Puffer C (Puffer A mit 10 mM Imidazol) und Inkubation mit sanftem für 5 min bei 4 ° C zu schaukeln. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 700 × g für 5 min und aspirieren vorsichtig den Überstand.
  4. Eluieren des Proteins durch Zugabe von 400 ul Puffer E (Puffer A mit 200 mM Imidazol) to das Harz. Inkubieren mit sanften bei 4 ° C für 5 min zu schaukeln. Zentrifuge bei 700 × g für 5 min.
  5. Übertragen Überstand mit gereinigtem Protein in ein neues 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
  6. Desalt das gereinigte Protein durch serielle Zentrifugation wie folgt.
    1. Bis 400 & mgr; l gereinigtes Protein, mit 100 & mgr; l Puffer A (dies reduziert Imidazole Konzentration von 200 mM bis 160 mM). Anwenden gereinigtem Protein auf 0,5 ml Ultrazentrifugalmühle Filter mit einem 10 kDa Molekulargewicht cut-off. Zentrifuge bei 14000 × g für 5 min.
    2. Entsorgen Sie das Filtrat und fügen 400 ul Puffer A des Retentats und Zentrifuge wieder zu verdünnen. Weiter die Zyklen der Zentrifugation / Verdünnung bis Imidazolkonzentration unter 4 mm fällt. Als ein Beispiel, wenn jede Zentrifugierung 500 ul konzentriert bis auf ~ 70 & mgr; l (oder ca. 7-fach), dann zwei Zyklen des Ausgangs 160 mM Imidazol-Konzentration (7 × 7 = 49-fach) reduzieren auf ca.oximately 3,3 mM.
    3. Messung der Proteinkonzentration der entsalzte Probe unter Verwendung des BCA - Assay 21.
      Anmerkung: Die Entsalzung erforderlich Imidazole Ebenen unter der Toleranzgrenze für den BCA - Assay zu reduzieren, wie in der Anleitung des Herstellers beschrieben. Unser Labor bevorzugt den BCA-Assay, da sie empfindlich ist, hat einen großen dynamischen Bereich und zeigt deutlich weniger Protein-zu-Protein-Variante. Jedoch können andere Verfahren der Proteinkonzentration zu bestimmen, kann für die BCA-Assay ersetzt werden. Der Schlüssel ist, der jedes Methoden Vorteile und Grenzen zu beachten.
  7. In 5X nativen Probenpuffer auf eine Endkonzentration von 1X und fahren Sie mit der Elektrophorese. Alternativ Proben bei -20 ° C für eine spätere Analyse.

4. nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE).

Achtung: Unpolymerisiertes Acrylamid ist ein Neurotoxin. Tragen Sie geeignete Schutz gear.

  1. Bereiten Sie die nicht-denaturierenden PAGE-Gel wie folgt.
    1. Bereiten Sie die Gel-Kassette für die Verwendung von sauberen Glasplatten Gießen und Gießen stehen. Platzieren Sie Steigung Hersteller auf der Spitze eines kleinen Magnetrührer und legen Sie eine kleine Rührstab in jede Kammer.
    2. Unter Verwendung von 40% (w / v) Acrylamid und 2% (w / v) Bisacrylamid-Stammlösungen, bereiten 5% und 10% (w / v) Acrylamid-Gel-Lösungen in einem nativen Auflösungspuffer. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von Gesamt Acrylamid zu Bisacrylamid beträgt 37,5: 1. Chill auf Eis vor dem Gießen.
      Anmerkung: Die nicht - denaturierenden PAGE - System verwendet dabei im wesentlichen identisch mit dem Laemmli SDS-PAGE - System ist, mit SDS 22 weggelassen.
    3. Hinzufügen Ammoniumpersulfat (von einer 10% (w / v) Stammlösung in Wasser hergestellt) mit den Acrylamidlösungen Polymerisation zu initiieren. Endkonzentration Ammoniumpersulfat 0,1% (w / v).
    4. Gießen Sie die Acrylamid-Lösungen in den beiden Kammern des Gradienten ausgestattet. Mit dem Ablaufschlauch eingeführt bwischen die Platten der Gel-Kassette, aktivieren Sie den Magnetrührer und die Gradienten-Hersteller Ventile öffnen. Gießen Sie mit dem 5 - 10% nicht-denaturierenden Gradienten-Gel.
    5. Einmal gegossen, überlagern das Gel mit einer dünnen Schicht aus Isopropanol und erlauben das Gel für 30 min zu polymerisieren. Während dieser Zeit, bereiten Sie frisches 5% Acrylamid-Gel-Lösung in nativen Lösung Puffer. Nachdem das Gel-Sets, gießen Isopropanol aus und die Spitze des Gels mit VE-Wasser aus einer Spritzflasche spülen.
    6. Zum 5% Gel-Lösung oben hergestellt, fügen Ammoniumpersulfat (genau wie in 4.1.3 beschrieben) und gießen Sie auf der Oberseite des polymerisierten Gels bis Glasplatten voll sind. Legen Sie Gelkamm. Erlauben es dem überlagerten Gel für weitere 30 min zu polymerisieren.
    7. Sobald Gel polymerisiert wird, Gel-Kassette in Elektrophorese-Vorrichtung montieren. Alternativ speichern Sie das Gel bei 4 ° C, für den Einsatz in angefeuchteten Papiertüchern und Plastikverpackung, bis sie bereit gewickelt.
  2. Sobald nicht denaturierenden PAGE-Gel in elec zusammengebauttrophorese Gerät, füllen den Tank mit 1X nativen Laufpuffer frisch zubereitet von einem 10fach nativen Laufpuffer Lager.
  3. Last 10 ug gereinigtes Protein, am Ende des Abschnitts 3 erhalten, in jedes Well ein Glas Spritze.
  4. Last 2 & mgr; l mit hohem Molekulargewicht native Protein-Standard (verdünnt in 1X nativen Laufpuffer) in einem der Brunnen.
  5. Führen Gel bei 55 V und 4 ° C, bis die Farbstofffront läuft das Gel aus (ca. 4-4,5 h).
  6. Zusätzlich zu dem nicht - denaturierenden Gel, Analyse Aliquots des gereinigten Proteins , das durch Standard - SDS-PAGE 22.
    1. Mischungs Aliquots (10 & mgr; g) der gereinigten Proteinproben, am Ende der Sektion 3 erhalten, mit 5X-SDS-Probenpuffer zu einer Endkonzentration von 1X.
    2. 5 min bei 100 ºC inkubieren und auf Standard - 12% und / oder 15% SDS-PAGE - Gelen 22 laden.
    3. für 20 Minuten bei 80 V laufen und dann bei 120 V, bis die Farbstofffront das Gel läuft weg (das ist etwa ein Additional 75 min für eine 12% Gel und 120 min für eine 15% Gel).

5. Visualizing Aktivität und Protein-Färbung.

  1. Nach der Elektrophorese sorgfältig getrennte Glasplatten und übertragen Sie die nicht-denaturierenden Gel auf eine Gelträger, der 50 ml VE-Wasser. Spülen Sie Gel mit sanfter 5 min zu schaukeln. Entsorgen Sie Wasser und wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.
  2. Führen Substrat Overlay-Assay wie folgt.
    1. 1 mL Puffer für die Entwicklung des fluorogenen Peptidsubstrats Suc-LLVY-AMC enthält und verteilt gleichmäßig über das Gel. für 30 min bei 37 ºC inkubieren.
      Hinweis: Ein Glasstab oder ein Gel Ausrücker (kleinen Keil aus Kunststoff zur getrennten Glasplatten verwendet wird ) verwendet werden kann , um die Flüssigkeit auf das Gel zu verteilen.
    2. übertragen Sie vorsichtig das Gel auf den UV-Transilluminator des Gels Abbildungssystem und beobachten Fluoreszenz aufgrund der gespaltenen Peptidsubstrats. Nehmen Bild. übertragen Sie vorsichtig die Gel back zur Gelträger.
    3. Spülen Sie das Gel zweimal mit 50 ml VE-Wasser für 5 min unter leichtem Schütteln.
    4. Beflecken das Gel mit 10 ml einer kolloidalen Coomassie-Färbung Reagenz für 60 min unter leichtem Schütteln. Entfärben Gel mit 50 ml Wasser, bis Hintergrund wird klar. Diese Färbung Schritt gilt für die Standard-SDS-PAGE-Gelen als auch.

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Ergebnisse

Assemblierungsintermediate (Abbildung 1) beginnt , wenn alpha - Untereinheiten zu bilden Ringe 9 zu kombinieren. Dies kann veranschaulicht werden , wenn & agr; -Untereinheiten von der archaeon Methanococcus maripaludis S2 in E. coli exprimiert werden , wie C-terminal Hexahistidin - markierte (His-tagged) -derivate (Tabelle 1). Wenn die rekombinante α-His - Protein durch ICAR und analysiert wurde gereinigt durch nicht - denaturierende PAGE, zwei Banden be...

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Diskussion

Wir zeigen den Nutzen eines kombinierten Ansatzes Assemblierungsintermediate zur Analyse von PAGE unter Verwendung von rekombinanten Archaea Proteasomen nicht denaturierenden. Die übliche Methode 9,11 von bakteriellen Co - Expression von Proteasom - Untereinheiten ermöglicht eine schnelle Analyse kann aber keine Schlüssel Assemblierungsintermediate offenbaren. Wir schlagen vor, die Kombination von Co-Expression mit Lysat Mischen ein umfassenderes Bild von Montage Ereignisse zu entwickeln.

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch einen Research Support Funds Grant (RSFG) von der Indiana University-Purdue University, Indianapolis, und teilweise durch eine Auszeichnung von der American Heart Association 14GRNT20390154, zu ARK unterstützt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Acrylamid (40%) LösungBiorad1610104Unpolymerisiertes Acrylamid ist ein Neurotoxin. Tragen Sie die richtige Schutzausrüstung
Amicon ultra 0,5 mL ZentrifugalfilterEMDMilliporeUFC501024
AmmoniumpersulfatSigmaA3678
ATPSigmaA7699
BCA AssayKit Pierce23225
Bisacrylamid (2%) LösungBiorad1610142
BromphenolblauSigmaB8026
DNaseISigmaDN25
Dithiothreitol (DTT)Thermo FisherBP172
E. coli BL21 kompetente ZellenEMD Millipore69450
GelCode BlueThermo Fisher24592Kolloidales Coomassie-Färbereagenz für Gele
Gel doc EZ SystemBiorad1708270Gel-Dokumentationssystem
GelabscheiderBiorad1653320Keilförmiger Kunststoff zur Trennung von Gelplatten; nützlich zum Verteilen von Flüssigkeiten.
GlasstabThermo Fisher11-380B
GlycerolSigma49767
GlycinThermo FisherBP3865
Hamilton SpritzeThermo Fisher14-813-38Glasspritze zum Laden von Gelen
HEPESUS BiologicalsH2010
HMW Natives KalibrierkitGE Healthcare170445-01Proteinstandards mit hohem Molekulargewicht
Hoefer SG30Thermo Fisher03-500-277Gradientenmacher
ImidazolUS Biologicals280671
IPTGUS BiologicalsI8500Zur Induktion der Proteinexpression
IsopropanolThermo FisherBP26181
KanamycinsulfatUS BiologicalsK0010
LysozymeSigmaL6876
MgCl2Fluka analytical630680
Mini Protean Tetra CellBiorad1658002EDUGel-Elektrophoresegerät
NaClThermo FisherS640-3
NaOHThermo FisherS318-1
Pefabloc SCRoche11429876001Proteaseinhibitor
pET42EMD Millipore70562Expression Plasmid
Precision plus all bluestandard Biorad1610373Molecular protein standard for SDS-PAGE
Quickchange MutageneseKit Agilent Technologies200521
Natriumdodecylsulfat (SDS)Thermo FisherBP166
Suc-LLVY-AMCEnzo lifesciencesBML P802-0005Fluorogenes Substrat
Talon Metal Affinity ResinClontech635502Immobilisiertes Kobalt-Affinitätsharz
TEMEDSigmaT7024
TrisUS BiologicalsT8600
Triton-X100Sigma93426
TryptonBacto BD
UV-ProbentablettBiorad1708271Für die UV-Bildgebung von Gelen
HefeextraktBacto BD212720
211699

Referenzen

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