Untersuchen Assemblierungsintermediate mit rekombinantem Archaeal Proteasomen und nicht denaturierenden PAGE: Die Argumente für einen kombinierten Ansatz

Dilrajkaur Panfair; Andrew R. Kusmierczyk

doi:10.3791/54860

Methodenartikel

Untersuchen Assemblierungsintermediate mit rekombinantem Archaeal Proteasomen und nicht denaturierenden PAGE: Die Argumente für einen kombinierten Ansatz

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DOI:

10.3791/54860

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17. Dezember 2016

Dilrajkaur Panfair¹ , Andrew R. Kusmierczyk¹

¹Department of Biology, Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll nutzt sowohl die Untereinheit Koexpression und postlysis Untereinheit für eine gründlichere Untersuchung der rekombinanten Assemblierungsintermediate mischen.

Zusammenfassung

Proteasomen sind in allen Bereichen des Lebens zu finden. Sie bieten den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbaus in Eukaryoten, obwohl ihre Montage nicht vollständig verstanden wird. Alle Proteasomen enthalten einen strukturell konservierten Kernpartikel (CP) oder 20S-Proteasoms, die zwei heptameren Ringe β-Untereinheit zwischen zwei heptameren α-Untereinheit Ringe eingeklemmt. Archaeal 20S Proteasomen sind kompositorisch einfacher im Vergleich zu ihren eukaryotischen Kollegen, aber sie beide teilen eine gemeinsame Montagemechanismus. Folglich weiterhin Archaea 20S Proteasomen wichtige Modelle für eukaryotische Assemblierungsintermediate zu sein. Insbesondere wurde die rekombinante Expression von Archaea-20S Proteasomen in Verbindung mit nicht-denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) viele wichtige Einblicke in Proteasom-Biogenese ergab. Hier diskutieren wir ein Mittel auf die übliche Strategie der Co-Expression von Archaea-Proteasom-α zu verbessern und ß-Untereinheiten vor nondenaturing PAGE. Wir zeigen, dass, obwohl eine schnelle und effiziente, eine Co-Expression Ansatz allein Schlüssel Assemblierungsintermediate verpassen. Im Falle des Proteasoms, Koexpression erlauben nicht Detektion des Halb Proteasom, ein Zwischenprodukt, enthaltend ein vollständiges α-Ring und eine vollständige β-Ring. Jedoch ist dieses Zwischenprodukt wird leicht über Lysat Mischen detektiert. Wir schlagen vor, dass die Co-Expression mit Lysat Mischung kombiniert einen Ansatz ergibt, die bei der Analyse der Montage gründlichere ist, bleibt doch Arbeit nicht-intensiven. Dieser Ansatz kann für die Untersuchung von anderen rekombinanten Multiproteinkomplexen nützlich sein.

Einleitung

Multiproteinkomplexen führen zahlreiche kritische zelluläre Aktivitäten ^1. Für viele dieser Komplexe wird über ihre Struktur und Funktion viel mehr bekannt als über ihre Montage ^2,3. Das Proteasom ist ein solcher Komplex und wird in allen Lebensbereichen zu finden. In Eukaryonten ist diese molekulare Maschine am Kern des Ubiquitin / Proteasom - System (UPS) und stellt den Hauptweg der intrazellulären Proteinabbau ^4. Die eukaryotische Proteasom (bezeichnet als 26S Proteasom) besteht aus zwei Hauptunterbaugruppen: eine 20S Proteasom oder Kernteilchen (CP) ^5, die durch einen 19S Regulatory Particle (RP) ⁶ an einem o....