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EMSAs verwendet , durch Verwendung nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen zu analysieren , um eine Mischung aus einem Protein von Interesse und eine markierte DNA - Sonde enthält , potentielle Zielstellen des Proteins 1 zu lösen. Eine DNA-Sonde mit Protein gebunden langsamer wandert mit einer freien DNA-Sonde verglichen wird, und daher verzögert in seine Wanderung durch eine Polyacrylamid-Matrix. Die radioaktive Markierung von DNA durch 32 P hat die vorherrschende Methode zur Detektion in EMSA gewesen. Obwohl die Anwendung von radioaktiven Markierung in der biochemischen Forschung vorteilhaft war, sind Methoden der alternativen DNA-Markierung mit vergleichbarer Empfindlichkeit wird aufgrund der Risiken Gesundheit und Sicherheit beschäftigt im Umgang mit Radioaktivität in Verbindung gebracht. Diese alternativen Verfahren umfassen die Konjugation von DNA mit Biotin 2 oder Digoxigenin (DIG) 3 (beide werden dann durch Chemilumineszenzsystemen erkannt), SYBR Grün - Färbung der PAGE - Gels 4,oder direkte Detektion von DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate durch das Gel 5,6 scannen.
Die aufgelösten Gele von EMSA unter Verwendung von radioaktiv markierten DNA - Sonden erfordern Nachlauf Verarbeitung durch Autoradiographie Filme oder ein Phosporimager System radioaktiven Signale 1,7 erfassen. Gele EMSAs Biotin- 2 oder DIG-konjugierten 3 DNA - Sonden müssen ebenfalls verarbeitet und auf eine geeignete Membran übertragen und dann durch Chemilumineszenz 6 detektiert. SYBR grüne Färbung des Gels erfordert Nachlauf Gel - Färbung und einen fluoreszierenden Scanner 4. Da Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte zur EMSAs unter Verwendung dieser DNA-Markierungstechniken benötigt werden, kann die aufgelöste Gel nur einmal getestet werden. Im Gegensatz dazu markierten DNA-Sonden mit Fluorophoren direkt in dem Gel in den Glasplatten durch einen Scanner detektiert werden kann. Daher können die DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrmals zu verschiedenen Zeitpunkten während des Laufs überwacht und analysiert werden, diedeutlich reduziert Zeit und Kosten. Die DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate , die für EMSAs verwendet wurden , umfassen Cy3 6,8, 6,8 Cy5, Fluorescein 9 und Infrarot - Fluoreszenzfarbstoffe 4-6.
Transkriptionelle Regulation erfordert Protein-DNA-Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren und ihre Zielgene. Die Koordination dieser Interaktionen erzeugt diverse Zelltypen aus einem gemeinsamen Vorläufer bei Tierentwicklung. Eine unvoreingenommene vorwärts genetisches Screening identifizierten eine Missense - Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG DNA-Bindungsdomäne des SOX-2 Caenorhabditis elegans Transkriptionsfaktor. Die Mutation führt zu einer Zellidentität Transformation von AWB olfaktorischen Neuronen in AWC Riechzellen auf molekularer, morphologischen und funktionellen Ebenen 5,10. SOX-2 regelt differentiell die terminale Differenzierung von AWB und AWC Neuronen mit kontextabhängigen Partner Transkriptionsfaktoren interagieren und die jeweiligenDNA - Zielstellen 5,10. SOX-2 Partner mit LIM-4 (LHX) in Terminal AWB neuronale Differenzierung, während SOX-2 Partner mit CEH-36 (OTX / OTD) in Terminal AWC neuronale Differenzierung. Luziferase - Reporter - Assays zeigen , dass SOX-2 und mutierten SOX-2 G73E Proteine haben kooperative Wechselwirkungen mit Transkriptions Cofaktoren LIM-4 und CEH-36 einen Promotor in AWB und AWC Neuronen zu aktivieren. Allerdings SOX-2 und mutierten SOX-2 G73E angezeigt Differentialaktivierungseigenschaften des Promotors. Um die molekulare Basis der differentiellen DNA - Bindungsaktivitäten von SOX-2 und SOX-2 G73E untersuchen, fEMSAs wurden mit diesen Proteinen und deren potentielle Zielstellen durchgeführt.
Zunächst wurde ein Ansatz Bioinformatics die biologisch relevante DNA-Bindungssequenzen innerhalb des 1 kb-Promotorregion in der Luciferase-Assay verwendet, zu identifizieren. Da mehrere potenzielle SOX-2 Bindungsstellen im gesamten Promotor anwesend waren, konzentrierten wir unsauf den vorhergesagten SOX-2-Bindungsstellen neben mutmaßlichen CEH-36 oder LIM-4-Bindungsstellen und evolutionär zwischen verschiedenen Nematodenarten konserviert. Diese Sequenzen wurden deletiert oder mutiert und anschließend in vivo auf ihre Aktivität getestet , um GFP reporter Transgenen in AWB oder AWC Neuronen exprimieren. Durch diesen Ansatz identifizierten wir Potential LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen , die speziell die für die Expression von GFP in AWB und AWC Neuronen sind jeweils 5. Wir untersuchten die möglichen Unterschiede in der DNA - Bindung von SOX-2 und SOX-2 G73E mit FEMSA mit den identifizierten LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen. Unsere EMSA - Analyse zeigte , dass SOX-2 G73E nicht die DNA - Sonde hat binden die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen (erforderlich für die Genexpression in AWB) so effizient wie WT SOX-2 tat enthält. Allerdings SOX-2 und SOX-2 G73E hatte keinen Unterschied in der Bindung der DNA - Sonde die CEH-36 / SOX-2 a enthält ,djacent Zielstelle (erforderlich für die Genexpression in AWC) 5,10. Unsere FEMSA Analysen für die AWB-to-AWC Zellidentität Phänotyp Transformation in beeinflussen spezifische DNA - Bindungsaktivität mechanistischen Einblick in die Natur des SOX-2 G73E - Mutation bereitstellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll von FEMSA unter Verwendung von gereinigtem 6xHis-SOX-2 oder 6 × His-SOX-2 G73E zusammen mit Infrarot - Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA - Sonden mit den LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen als Fallstudie in Angriff zu nehmen eine wichtige biologische Frage.