Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Summary

Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.

Abstract

Elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA) sind eine instrumentale Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und deren Ziel-DNA-Sequenzen zu charakterisieren. Die Radioaktivität ist die vorherrschende Methode der DNA-Markierung in EMSA gewesen. Allerdings haben jüngste Fortschritte in der Fluoreszenzfarbstoffe und Scanverfahren die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung von DNA als Alternative zu den Radioaktivität für den Vorteilen der leichten Handhabung Aufforderung, Zeitersparnis und reduziert die Kosten und die Verbesserung der Sicherheit. Wir haben vor kurzem fluoreszierende EMSA (FEMSA) erfolgreich adressieren eine wichtige biologische Frage verwendet. Unsere Analyse liefert FEMSA mechanistischen Einblick in die Wirkung einer Missense-Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG Transkriptionsfaktor SOX-2 auf olfaktorische Neuronen Typ Streuung. Wir fanden , dass mutierte SOX-2 ^G73E Protein spezifische DNA - Bindungsaktivität verändert, wodurch olfaktorischen Neuronen Identität Transformation verursacht. Hier stellen wir ein optimiertes und kostengünstiges Schritt-für-Schritt-Protokollfür FEMSA mit Infrarot - Fluoreszenz - Farbstoff-markierten Oligonukleotiden , die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen und gereinigt SOX-2 - Proteine (WT und Mutanten - SOX-2 ^G73E Proteine) als biologisches Beispiel enthält.

Introduction

EMSAs verwendet , durch Verwendung nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen zu analysieren , um eine Mischung aus einem Protein von Interesse und eine markierte DNA - Sonde enthält , potentielle Zielstellen des Proteins ¹ zu lösen. Eine DNA-Sonde mit Protein gebunden langsamer wandert mit einer freien DNA-Sonde verglichen wird, und daher verzögert in seine Wanderung durch eine Polyacrylamid-Matrix. Die radioaktive Markierung von DNA durch ³² P hat die vorherrschende Methode zur Detektion in EMSA gewesen. Obwohl die Anwendung von radioaktiven Markierung in der biochemischen Forschung vorteilhaft....

Protocol

HINWEIS: EMSAs fluoreszenzmarkierten DNA - Sonden oder andere Formen von markierten DNA die gleichen Protokolle für Protein oder Zellextraktzubereitung, Protein-DNA - Bindungsreaktion und PAGE Gelzubereitung und Ausführen (1A) verwendet wird . Die wichtigsten Unterschiede sind DNA-Markierungsverfahren, post-run Gel Verarbeitungsschritte und Nachweismethoden.

1. Gel Zubereitung

1. Bereiten 5% nativen Polyacrylamidgel, enthaltend 0,5 × TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA) und 2,5% Glycerin, ein Mini-Protein-Gel-System (8,3 cm Breite x 7,3 cm Länge x 0,75 mm Dicke).
   1. Zur Herstellung von 30 ml Gel-Lösung für 4 Gele, mischen 5 ml 30% ....

Results

Orange G loading dye (6x: 0.12 g Orange G in 100 ml 30% Glycerol) können vor dem Laden in die Bindungsreaktion zugesetzt werden, um das Fortschreiten der Elektrophorese sichtbar zu machen. Weitere Lade- Farbstoffe Bromphenolblau einschließlich wird während des Scannens und daher interferieren Bildanalyse (1B) detektiert werden.

In einigen Fällen von EMSAs, insbesondere wenn die Kernextraktzubereitung verwendet.......

Discussion

fEMSAs sind ein leistungsfähiges Werkzeug Protein-DNA-Wechselwirkungen, und sind eine Alternative zur radioaktiven Markierung von DNA zu untersuchen. Fluoreszenzfarbstoffe, wie beispielsweise Infrarot-Farbstoffe sind im Handel erhältlich und bieten einen sicheren und umweltfreundlichen Verfahren im Vergleich zur radioaktiven DNA-Markierung. EMSA unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden erfordern keine Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte und somit Zeit und Kosten im Vergleich zu ande.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamid ist schädlich und giftig.
6x-His-Epitop-Tag-Antikörper (HIS. H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 Antikörper	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Rinderserumalbumin (BSA) Molekularbiologie	England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-markierte DNA-Oligos	Integrierte DNA-Technologien	Kundenspezifisches DNA-Oligo Diese	werden im Manuskript als "5'-Farbstoff-markierte oder infrarote fluoreszierende Farbstoff-markierte DNA-Oligos" bezeichnet. Das Unternehmen wird 5'-IRDye-markierte DNA-Oligonukleotide kundenspezifisch synthetisieren. Erfordert mindestens 100  μ Synthese im M-Maßstab und HPLC-Aufreinigung.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN  Vertikale Elektrophorese-Zelle	Bio-Rad	1658000FC	Dies wird in der Handschrift als "Mini-Protein-Gel-System" bezeichnet. Jedes elektrophoretische System kann verwendet werden, solange es sich um Klarglasplatten mit einer Größe von weniger als 25 cm x 25 cm handelt.
Odyssey CLx Infrarot-Bildgebungssystem	LI-COR Biotechnologie	Odyssey CLx Infrarot-Bildgebungssystem	Dies wird im Manuskript als "fortschrittliches Infrarot-Bildgebungssystem" bezeichnet.
Odyssey Fc Bildgebungssystem	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	Dies wird im Manuskript als "Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebungssystem hauptsächlich für westliche Blots" bezeichnet.
Image Studio Software (Version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio Software	Dies wird im Manuskript als "besondere Bildgebungssoftware" bezeichnet.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange Ladefarbstoff			0,25% Orange G; 30% Glycerin
0,5x TBE			45 mM Tris-Borat; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
5x Bindungspuffer			50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM DVB-T; 250 μ g/mL BSA