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Methodenartikel

Anti-Krebs-Wirksamkeit der Photodynamischen Therapie mit Lungenkrebs-Targeted-Nanopartikel

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DOI:

10.3791/54865

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1. Dezember 2016

 ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine alternative Wahl zur Behandlung von Lungenkrebs. Um die therapeutische Wirkung der PDT zu erhöhen, wurden Nanopartikel entwickelt, die auf Lungenkrebs abzielen und mit einer Chemotherapie kombiniert werden. Sowohl in vitro als auch in vivo wurde die Wirksamkeit der PDT mit präparierten Nanopartikeln gegen Krebs untersucht.

Zusammenfassung

Photodynamische Therapie (PDT) ist eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Methode, die eine attraktive Alternative zur Behandlung von Lungenkrebs darstellt. Photosensibilisatoren reichern sich selektiv im Tumorgewebe an und führen in Gegenwart von Sauerstoff und der richtigen Wellenlänge des Lichts zum Absterben von Tumorzellen.

Um die therapeutische Wirkung der PDT zu erhöhen, haben wir sowohl mit Photosensibilisatoren als auch mit Antikrebsmitteln beladene Nanopartikel entwickelt, die auf Lungenkrebs abzielen. Es wurden sowohl das auf dem EPR-Effekt basierende passive Targeting als auch das auf Hyaluronsäure-CD44-Interaktion basierende aktive Targeting angewendet. CD44 ist ein bekannter Hyaluronsäure-Rezeptor, der häufig als Biomarker für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs eingeführt wird.

Darüber hinaus wird in der vorliegenden Studie eine Kombination aus PDT und Chemotherapie angewendet. Dieses Kombinationskonzept kann die therapeutische Wirkung gegen Krebs verstärken und Nebenwirkungen reduzieren.

Wir haben in dieser Studie Hypocrellin B (HB) als neuartigen Photosensibilisator gewählt. Es wurde berichtet, dass HB im Vergleich zu Hämatoporphyrinderivaten eine höhere Wirksamkeit der PDT gegen Krebs bewirkt1. Paclitaxel wurde als Krebsmedikament ausgewählt, da es sich als potenzielle Behandlung von Lungenkrebs erwiesenhat 2.

Die Antitumorwirksamkeit von Photosensibilisator (HB)-Lösung, Photosensibilisator-verkapselten Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikeln (HB-NPs) und sowohl Photosensibilisator- als auch Antikrebsmittel (Paclitaxel)-verkapselte Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel (HB-P-NPs) nach PDT wurden sowohl in vitro als auch in vivo verglichen. Die in vitro Phototoxizität in A549 (humanes Lungenadenokarzinom) und die in vivo Antitumorwirksamkeit in A549 tumortragenden Mäusen wurden untersucht.

Die HB-P-NP-Behandlungsgruppe zeigte nach der PDT die wirksamste Antikrebswirkung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in der vorliegenden Studie hergestellten HB-P-NPs ein potenzielles und neuartiges Photosensibilisatoren-Verabreichungssystem bei der Behandlung von Lungenkrebs mit PDT darstellen.

Einleitung

Photodynamische Therapie (PDT) setzt sich aus drei Hauptfaktoren zusammen: Photosensibilisatoren, Licht und Sauerstoff. Die PDT gilt als vielversprechende Behandlung für verschiedene Krebsarten3. Wenn die Photosensibilisatoren dem Krebspatienten verabreicht werden, reichern sie sich selektiv im Tumorgewebe an. Wenn die richtige Wellenlänge des Lichts angewendet wird, führen der hochreaktive Singulett-Sauerstoff und andere freie Radikale zu einer Schädigung der Tumorzellen4.

Lungenkrebs wurde als eine der ersten Anwendungen für PDT in den frühen 1980er Jahren eingeführt5. Die PDT bietet mehrere Vorteile bei der Behandlung von Lungenkrebs. Da es sich bei der PDT um eine nicht-invasive und nicht-chirurgische Behandlung handelt, ist sie eine attraktive Alternative für Patienten, bei denen eine chirurgische Resektion nicht geeignet ist.

Es gab viele Herausforderungen, um die krebsbekämpfende Wirksamkeit der Photosensibilisatoren zu verbessern. Die Erhöhung der Akkumulation von Photosensibilisatoren in Krebsherden und die Verringerung der Akkumulation in normalem Gewebe sind die identischen Ziele für die Krebs-Targeting-Studien. Eine Vielzahl von zielgerichteten Wirkstoffabgabesystemen, wie Polymere, Liposomen und Nanopartikel, werden als Photosensibilisatorenträger eingesetzt6-8. In unseren früheren Studien erhöhten Nanopartikel effektiv die krebsbekämpfenden Fähigkeiten der Photosensibilisatoren9,10. Nanopartikel sind ideale Träger für die Krebsbekämpfung, da sie sowohl passive als auch aktive Targeting-Fähigkeiten besitzen. Die undichten Tumorgefäße bieten die Möglichkeit, dass sich Träger in Nanogröße leicht in Tumoren anreichern können, was als verbesserter Permeabilitäts- und Retentionseffekt (EPR) bekannt ist11,12. Die Interaktion zwischen den Nanopartikeln und den spezifischen Rezeptoren auf Krebszellen ermöglicht ein aktives Targeting von Krebs. In dieser Studie haben wir Nanopartikel auf Hyaluronsäurebasis so hergestellt, dass sie mit CD44 interagieren, dem wichtigsten Hyaluronsäurerezeptor, der auf Lungenkrebszellen überexprimiert wird13.

Um die Wirksamkeit gegen Krebs zu maximieren, wird in der vorliegenden Studie eine Kombination aus PDT und Chemotherapie angewendet. Dieses Kombinationskonzept kann eine erhöhte therapeutische Wirkung ermöglichen. Darüber hinaus können verringerte Dosen sowohl des Photosensibilisators als auch des Krebsmedikaments Nebenwirkungen verringern. In der vorliegenden Studie haben wir Hypocrellin B (HB) als neuen Photosensibilisator ausgewählt. HB wird aus dem chinesischen Heilpilz Hypocrella bambuase isoliert. Shang et al. berichteten, dass die HB-basierte PDT im Vergleich zur auf Hämatoporphyrinderivaten basierenden PDT1 eine höhere Wirksamkeit gegen Krebs besitzt. Paclitaxel wurde als Krebsmedikament ausgewählt, da es sich als potenzielle Behandlung für verschiedene Krebsarten, einschließlich Lungenkrebs, erwiesenhat 2.

Hierin haben wir die Antikrebswirksamkeit von Photosensibilisatoren (Hypocrellin B, HB) Lösung, Photosensibilisatoren-verkapselten Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikeln (HB-NPs) und sowohl Photosensibilisator- als auch Antikrebsmittel (Paclitaxel)-verkapselte Hyaluronsäure-Ceramid-Nanopartikel (HB-P-NPs) nach PDT verglichen. Die in vitro Phototoxizität in A549 (humanes Lungenadenokarzinom) und die in vivo Antitumorwirksamkeit in A549 tumortragenden Mäusen wurden untersucht.

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Protokoll

HINWEIS: Alle Tierstudie Protokolle, die von der Institutional Animal Care und Use Committee von der Seoul National University Bundang Krankenhaus genehmigt wurden (BA1308-134 / 072-01).

1. Synthese von Hyaluronsäure-Ceramid (HACE)

  1. Solubilisieren 12,21 mmol von Hyaluronsäure (HA) Oligomeren und 9,77 mmol Tetra- n -butylammonium Hydroxid (TBA) in 60 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW). Rühre 30 min.
  2. Um die DS-Y30-Linker synthetisiert, aufzulösen 8,59 mmol DS-Y30 Ceramid und 9,45 mmol Triethylamin in 25 ml Tetrahydrofuran (THF). Mix mit 8,59 mmol 4-Chlormethylbenzoylchlorid in THF. Rühre 6 Stunden bei 60 ° C.
  3. Löse das synthetisierte 8.10 mmol HA-TBA und 0,41 mmol des DS-Y30 Linkers in einem Gemisch aus THF und Acetonitril (4: 1, v / v). Rühre 5 Stunden bei 40 ° C.
  4. Entfernen von Verunreinigungen mit einem Filtermittel Filterung und Beseitigung des organischen Lösungsmittels durch Vakuumverdampfung. Reinige das Produkt eine Dialysemembran (Molekulargewichts-Cut-off: 3,5 kDa) und lyophilisieren.

2. Herstellung der Nanoteilchen

  1. Man löst 1 mg HB und 1 mg Paclitaxel in 0.5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) und Mischung mit 0,5 ml DDW durch Vortex-Mischen für 5 min. Dann solubilisieren HACE in diesem Gemisch durch Wirbelmischen für weitere 5 min.
  2. Um das Lösungsmittel, Wärme bei 70 ° C für 4 Stunden unter einem schwachen Stickstoffgasstrom zu eliminieren.
  3. Resuspendieren Film, der aus HACE, HB, und Paclitaxel mit 1 ml DDW. Filter mit einem Spritzenfilter (0,45 & mgr; m Porengröße) zu offenen Drogen zu entfernen.

3. In - vitro - Phototoxizität

  1. Aufnahme von Nanopartikeln in Lungenkrebszelllinien
    1. Bereiten RPMI-1640-Medium enthaltenden 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 1% (w / v) Penicillin-Streptomycin.
    2. Seed A549 - Zellen in 24-well Zellkulturplatten in einer Dichte von 1 × 10 5 Zellen / Vertiefung (Triplikaten für jedeGruppe). In einem befeuchteten 5% CO 2 und 95% Luftatmosphäre bei 37 ° C für 24 Stunden inkubieren.
    3. Nach Zellanheftung, um das Medium zu entfernen und die Zellen zu waschen, indem 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    4. Man löst die Nanopartikel in PBS auf eine Endkonzentration von 2 & mgr; M / ml HB. Dann brüten die Zellen mit 1 ml PBS, leer NPs, HB-NPs oder HB-P-NPs in jeder Vertiefung für 4 Stunden im Dunkeln.
    5. Entfernen all der Lösung und Waschen der Zellen durch Zugabe von 1 ml kaltem PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. In frischem Kulturmedium.
  2. Die Lebensfähigkeit der Zellen-Assay
    1. Legen Sie die Zellkulturplatte unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser zum Brunnen). Tragen Laserschutzbrille und beleuchten die Zellen mit einem PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) im Dunkeln für verschiedene Zeiträume: 0, 5, 10, 20, 30 und 40 Sekunden (0, 2, 4 , 8, 12 und 16 J / cm 2). Dann brüten die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln.
    2. Saugen Sie das Medium und waschen, indem die Zellen mit 1 ml kaltem PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
    3. Fügen Sie 10 & mgr; l der Zytotoxizität Messlösung in jede Vertiefung. Inkubieren im Dunkeln für 2 Stunden.
    4. Messen Sie die Absorption bei 450 nm im Mikrotiterplatten-Reader.
  3. Die mikroskopische Analyse
    1. Legen Sie die Zellkulturplatte unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser zum Brunnen). Tragen Laserschutzbrille und beleuchten die Zellen mit einem PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) im Dunkeln für 0, 20 oder 40 Sekunden (0, 8, oder 16 J / cm 2). Dann brüten die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln.
    2. Saugen Sie das Medium und waschen, indem die Zellen mit 1 ml kaltem PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
    3. Je 50 ul von Annexin V-FITC und 50 ul 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1,5 ug / ml). Die Platte vorsichtig schütteln und für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
      HINWEIS: Verwenden Sie Annexin V-FITC aus dem Fluoreszenzmikroskop-Kit.
    4. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml kaltem PBS. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal. Halten Sie die Zellen in frischem PBS. Identifizieren Sie die apoptotischen Zellen unter Verwendung von Lichtmikroskopie bei 100-facher Vergrößerung.
  4. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) -Analyse
    1. Legen Sie die Zellkulturplatte unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser zum Brunnen). Tragen Laserschutzbrille und beleuchten die Zellen mit einem PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) für 0, 20 oder 40 Sekunden (0, 8, oder 16 J / cm 2). Dann brüten die Zellen 24 Stunden lang im Dunkeln.
    2. Saugen Sie das Medium und waschen, indem die Zellen mit 1 ml kaltem PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschschritt noch einmal.
    3. Resuspendieren der Zellen in 1 ml 1 × Bindungspuffer (verdünnt 1 Teil des 10x Bindungspuffer, 0,1 M Hepes / NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, und 25 mM CaCl 2 bis 9 Teile destilliertes Wasser) und den Transfer 100 ul der Probenlösung auf eine 5-mlKulturröhrchen.
    4. In 5 ul von Annexin V-FITC und 5 ul Propidiumiodid (PI). Ziehen Sie das Rohr verwirbeln und für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln inkubiert. In 400 ul 1 × Bindungspuffer.
      HINWEIS: Verwenden Sie Annexin mit V-FITC und PI aus dem Fluoreszenzmikroskop-Kit.
    5. Identifizieren Sie die apoptotischen Zellen durch FACS unter Verwendung von 14. Die Anregungslaserlinien von PI und Annexin V-FITC sind 488 nm und 635 nm. Messen der Fluoreszenzemission von PI und Annexin V-FITC bei 610 ± 20 nm und 660 ± 20 nm. Sammeln Sie die erworbenen Zellen auf dem Durchflusszytometer pro 10.000 Veranstaltungen.

4. In vivo Wirksamkeit gegen Krebs in Tumor-tragenden Mäusen

  1. Lungenkrebs-induzierte Mausmodell
    1. Vorbereitung 1 × 10 6 A549 - Zellen in 0,1 ml RPMI-1640 - Medium; halten Sie es in Eis.
    2. Anästhesieren die Mäuse mit einer ip Injektion eines Xylazin und einer Mischung von Tiletamin und Zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch sanft eine kleine Falte der Mäusehaut Kneifen. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
      HINWEIS: Wenn keine Bewegung festgestellt wird, ist das Tier ausreichend narkotisierten die Experimente zu starten.
    3. Injizieren Sie die Zellen subkutan in die linken Flanken von Balb / C männliche Nacktmäuse (6 - 7 Wochen alt, 20 bis 22 g).
    4. Halten Sie die Mäuse beobachtet, bis sie um den Käfig zu bewegen beginnen.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt hat Brustlage zu halten. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt hat. Halten Sie die Mäuse unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen.
    5. Messen Sie die Größe des Tumors mit täglich Sätteln. Berechnen Sie den Tumorvolumen (mm 3) als (Länge × Breite 2) / 2. Wenn die Tumorgröße etwa 200 mm 3 im Volumen erreicht, das Experiment zu starten.
  2. Anti-Krebs-Wirksamkeitsstudie
    1. Teilen Randomly die Mäuse in 4 Gruppen (n = 10 pro Gruppe).
    2. Anästhesieren die Mäuse mit einer ip Injektion eines Xylazin und einer Mischung von Tiletamin und Zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch sanft eine kleine Falte der Mäusehaut Kneifen. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
      HINWEIS: Wenn keine Bewegung festgestellt wird, ist das Tier ausreichend narkotisierten die Experimente zu starten.
    3. Man löst die Nanopartikel in PBS auf eine Endkonzentration von 2 mg / ml HB. Injizieren PBS, frei HB, HB-NPs oder HB-P-NPs über die Schwanzvene (2 mg / kg als HB) zweimal an den Tagen 0 und 7.
    4. Halten Sie die Mäuse beobachtet, bis sie um den Käfig zu bewegen beginnen.
      HINWEIS: Verwenden Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt hat Brustlage zu halten. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren, bis sie vollständig durchlaufen hatzurückgewonnen. Halten Sie die Käfige dunkel und unter bestimmten Bedingungen SPF.
    5. 24 Stunden nach jeder Injektion anästhesieren die Mäuse mit einer ip Injektion eines Xylazin und einer Mischung von Tiletamin und Zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch sanft eine kleine Falte der Mäusehaut Kneifen. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
      HINWEIS: Wenn keine Bewegung festgestellt wird, ist das Tier ausreichend narkotisierten die Experimente zu starten.
    6. Platzieren Sie den Tumor unter der PDT-Faser (mit 1 cm Abstand von der PDT Faser auf den Tumor). Tragen Laserschutzbrille, drehen Sie den Schalter ab und beleuchten den Tumor mit einer PDT - Laser (630 nm, 400 mW / cm 2) für 500 sec (200 J / cm 2) zweimal an den Tagen 1 und 8.
    7. Halten Sie die Mäuse beobachtet, bis sie um den Käfig zu bewegen beginnen. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Nicht ein Tier zurück, die Renovierungsarbeite hate Chirurgie an der Gesellschaft von anderen Tieren, bis sie vollständig erholt.
    8. Halten Sie die Käfige unter SPF Bedingungen. Pflegen Sie die Käfige im Dunkeln für 24 Stunden nach der Laserbehandlung.
    9. Optisch überwachen jeden Tag das Tumorvolumen und die Änderungen an der Tumorstelle. Messen Sie die Größe des Tumors mit einer Schieblehre, und berechnen Sie die Lautstärke (Länge × Breite 2) / 2 (mm 3). Machen Sie Fotos von den Tumorstellen für Tumoroberflächenveränderungen nach der PDT jeden Tag überprüfen.
    10. Am Tag 16, opfern fünf Mäuse pro Gruppe von Terminal Anästhesie mit Isofluran.
    11. Mit einer Pinzette und Schere, schneiden Sie die Außenhaut und setzen die Tumore 15. Sorgfältig ernten. Fix sie in 10% Formalin, betten sie in Paraffin und färben sie mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) für die histologische Analyse 16.
    12. Nach 45 Tagen der Überwachung, opfern, um die restlichen Mäuse durch Klemme Narkose mit Isofluran.

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Ergebnisse

Wir bereiteten sowohl HB-NPs und HB-P-NPs mit den oben genannten Techniken. Die mittleren Durchmesser von HB-NPs und HB-P-NPs waren 220,9 ± 3,2 nm und 211,9 ± 1,6 nm.

Die Lebensfähigkeit der Zellen von A549 - Zellen nach 4 h Inkubation mit PBS, leere NPs, HB-NPs und HB-P-NPs durch Bestrahlung mit Licht gefolgt (0 bis 16 J / cm 2) ist in Abbildung 1. Ohne Licht gezeigt, ist die HB-NP zeigte Behandlun...

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Diskussion

Der wichtigste Schritt in dieser Studie ist die Auswahl der richtigen Laserbedingungen: Wellenlänge, Leistung und Bestrahlungszeit. Die richtige Wellenlänge des Lichts, geeignet für die spezifische Photosensibilisator für die PDT notwendig. Wir haben eine 630-nm - Laser, der für Hypokrellinverbindung B. Die Ausgangsleistung angemessen war , war ein weiterer wichtiger Faktor, der bei 400 mW / cm 2 basiert auf vielen Pilotstudien festgelegt wurde. Ausgangsleistungen von mehr als 400 mW / cm 2 , um di...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde von Zuschuss nicht unterstützt. 14-2014-017 von der SNUBH Research Fund.

Die Autoren danken J. Patrick Barron, Professor Emeritus, Tokyo Medical University und Adjunct Professor, Seoul National University Bundang Krankenhaus für seine Pro - bono - Bearbeitung dieses Manuskript.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Oligo-HyaluronsäureBioland Co., Ltd._
DS-Y30 (Ceramid 3B; hauptsächlich N-oleoyl-phytosphingosin)Doosan Biotech Co., Ltd._
Adipinsäure-DihydrazidSigma AldrichA0638
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′ -ethylcarbodiimidSigma Aldrich39391
4-(chlormethyl)benzoylchloridSigma Aldrich270784
Tween 80Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0546
SpritzenvorsatzfilterSartorius Stedim Biotech GmbH17762 15mm, RC, PP, 0,45 µ m
TriethylaminSigma AldrichT0886
Mini-GeBAflex SchläucheGene Bio-Application Ltd.D070-12-100
PaclitaxelTaihua Corporations_
RPMI-1640Gibco Life Technologies, Inc.11875
Penicillin– StreptomycinGibco Life Technologies, Inc.15070
Fötales RinderserumGibco Life Technologies, Inc.
Celite (Filtermittel)Sigma Aldrich6858Siehe Schritt 1.4
16140071

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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