Method Article

Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von

DOI:

10.3791/54879

December 25th, 2016

In This Article

Summary

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Stickstoffmonoxid (NO) ist ein wichtiges Signalmolekül in der vaskulären Homöostase. NEIN, die Produktion in vivo ist zu gering für eine direkte Messung. Die Chemilumineszenz bietet nützliche Einblicke in den NO-Zyklus durch die Messung seiner Vorläufer und Oxidationsprodukte, Nitrit und Nitrat. Die Nitrit-/Nitratbestimmung in Körpergeweben und -flüssigkeiten wird erläutert.

Abstract

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Stickstoffmonoxid (NO) ist einer der wichtigsten Reglermolekülen in der vaskulären Homöostase und auch ein Neurotransmitter. Enzymatisch erzeugte NO wird durch Wechselwirkungen mit verschiedenen Oxy-Häm-Proteine ​​und andere noch nicht bekannte Wege in Nitrit und Nitrat oxidiert. Der umgekehrte Vorgang, Reduzierung von Nitrit und Nitrat in NO hatte bei Säugetieren in den letzten zehn Jahren entdeckt worden, und es gewinnt Aufmerksamkeit als einer der möglichen Wege entweder zu verhindern oder eine ganze Reihe von Herz-Kreislauf-, Stoffwechsel- und Muskelerkrankungen lindern, die gedacht sind mit verminderter NO-Spiegel in Verbindung gebracht werden. Es ist daher wichtig, die Menge von NO und seinen Metaboliten in verschiedenen Kompartimenten abzuschätzen - Blut, Körperflüssigkeiten und den verschiedenen Geweben. Blut, aufgrund seiner leichten Zugänglichkeit ist die bevorzugte Fach für die Abschätzung der NO-Metaboliten verwendet. Aufgrund seiner kurzen Lebensdauer (einige Millisekunden) und niedrige subnanomolarer Konzentration, direkte zuverlässige Messungen des Blut NO <em> in vivo vor große technische Schwierigkeiten. Somit wird keine Verfügbarkeit in der Regel bezogen auf die Menge der Oxidationsprodukte, Nitrit und Nitrat geschätzt. Diese beiden Metaboliten werden immer separat gemessen. Es gibt mehrere gut etablierte Methoden ihre Konzentrationen in biologischen Flüssigkeiten und Geweben zu bestimmen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Chemilumineszenz-Methode (CL) bezogen auf spektrophotometrische Detektion von NO nach Nitrit oder Nitrat-Reduktion durch Triiodid-oder Vanadium (III) chlorid-Lösungen, respectively. Die Empfindlichkeit für Nitrit und Nitrat-Erkennung ist in niedrigen nanomolaren Bereich, der CL als die empfindlichste Methode setzt derzeit zur Verfügung stehenden Änderungen der NO Stoffwechselwege zu bestimmen. Wir erklären im Detail, wie Proben aus biologischen Flüssigkeiten und Geweben herzustellen, um zu bewahren ursprünglichen Mengen an Nitrit und Nitrat anwesend zum Zeitpunkt der Sammlung und wie ihre jeweiligen Mengen in Proben zu bestimmen. Einschränkungen der CL-Technik sind auch explained.

Introduction

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Nitrite und zu einem weniger verlängern Nitrat-Spiegel im Blut reflektieren Gesamtzustand der Körper nicht den Stoffwechsel. Nitrit-Konzentrationen in Blut und die meisten Organe und Gewebe sind nur in hohen nanomolaren oder niedrigen mikromolaren Bereich, Nitrat in wesentlich höheren Mengen in der Regel vorhanden ist - in mikromolaren Bereich. Änderungen in der Nitritwerte wegen Krankheitsprogression oder Veränderungen der Ernährungsgewohnheiten sind recht klein und kann nur über eine sehr empfindliche Methode gemessen werden. Aufgrund ihrer sehr unterschiedlichen Ebenen und mit unterschiedlichen Stoffwechselprozesse, separate Bestimmung von Nitrit und Nitratgehalt ....

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Protocol

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Alle Protokolle Verwendung von Tieren, einschließlich wurden für die Verwendung von NIDDK Animal Care und Use Committee genehmigt und menschlichem Blut wurde aus NIH Blutbank von gesunden Spendern erhalten.

1. Probenvorbereitung

  1. Herstellung von Nitrit Konservierungslösung
    1. Bereiten einer Lösung , die 890 mM Kaliumferricyanid (K 3 Fe (CN) 6) und 118 mM NEM (N-Ethylmaleimid) in destilliertem Wasser. Man löst gut, bis es keine Kristalle vorhanden gelb klar. In NP-40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol) in einer 1: 9-Verhältnis (v / v, NP-40 / Lösung). Vorsichtig mischen zu vermeiden, Sc....

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Results

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Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse von Normen gesammelt und fünf verschiedenen Proben. Wie in dieser Figur gezeigt, Photomultiplier Spannung steigt unmittelbar nach nitrithaltigen Lösung (Standards oder Proben) in Reduktionslösung eingespritzt wird und kehrt zu dem Ausgangswert, sobald alle Nitrit in der injizierten (Injektionen Zeiten werden durch rote Pfeile unterhalb der Kurve angegeben) Lösung wurde reduziert. Es ist auch klar aus dieser Figur, die eine gena.......

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Discussion

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Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Aliquots aller Lösungen (einschließlich Wasser), die zur Herstellung, verdünnt oder anderweitig Originalproben zu behandeln haben für mögliche Nitrit oder (häufiger) Nitratbelastung gespeichert und überprüft werden. Wir fanden, dass die meisten Verunreinigungen von Wasser kommt, und viele Chemikalien verwendet Probe (ferricyanide insbesondere) zur Behandlung auch erhebliche Menge an Nitratbelastung in einigen Partien enthalten, die mit dem endogenen N.......

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Disclosures

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Dr. Alan Schechter als Miterfinder auf mehrere Patente erteilt aufgeführt zu den National Institutes of Health für die Verwendung von Nitritsalze zur Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen. Er erhält Lizenzgebühren auf Basis von NIH Lizenzierung dieser Patente für die klinische Entwicklung, aber keine andere Entschädigung.

Acknowledgements

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Autoren wollen bei der Entwicklung der Verwendung von Nitrit Konservierungslösung für die Nitrit-Messungen in Blut kritischen Beiträge von Dr. A. entstören und MM Pelletier zu bestätigen.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kaliumferricyanid; K3Fe(CN)6Sigma702587
NEM; N-EthylmaleimidSigma4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylenglykolSigma74385
Sulfanilamid ; AS SigmaS9251
HClSigmaH1758
Essigsäure, EiszeitSigmaA9967
AscorbinsäureSigmaA7506
Kaliumiodid; KISigma60399
Jod; I2Sigma207772lichtempfindliches, giftiges
Natriumnitrit; NaNO2Sigma563218
Vanadium(III)-chlorid; VCl3Sigma208272lichtempfindliche, giftige
GentleMacMiltenyi
Sievers NOA 280iGE
CLD 88Y  Ökophysik 

References

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  1. Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
  2. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measure....

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Nitric Oxide MetabolitesChemiluminescence MethodNitrite DetectionNitrate DetectionTriiodide SolutionVanadium ChlorideBiological Sample PreparationNitric Oxide AnalyzerStandard Curve ConstructionSensitivity Limit

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