Research Article
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Diese Studie beschreibt ein Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.
Der Mikroneutralisations-Assay (MN) ist eine Standardtechnik zur Messung der Infektiosität des Influenzavirus und der Hemmung der Virusreplikation. In dieser Studie stellen wir das Protokoll eines bildgebenden MN-Assays vor, um die wahren antigenen Beziehungen zwischen Viren zu quantifizieren. Im Gegensatz zu typischen Plaque-Reduktions-Assays, die auf sichtbaren Plaques beruhen, quantifiziert dieser Assay die gesamte infizierte Zellpopulation jeder Vertiefung. Das Protokoll gleicht den Virustyp oder -subtyp mit der Auswahl der Zelllinien ab, um eine maximale Infektiosität zu erreichen, was den Probenkontrast während der Bildgebung und Bildverarbeitung erhöht. Die Einführung der quantitativen Titration definiert die Menge der zu neutralisierenden Eingangsviren und ermöglicht es, die Ergebnisse verschiedener Experimente vergleichbar zu machen. Das Imaging-Setup mit einem Flachbettscanner und kostenlos herunterladbarer Software macht den Ansatz mit hohem Durchsatz, kostengünstig, benutzerfreundlich und in den meisten Laboren einfach zu implementieren. Unsere Studie zeigt, dass der verbesserte MN-Assay gut mit den aktuellen zirkulierenden Influenzaviren A(H1N1)pdm09, A(H3N2) und B-Viren funktioniert, ohne signifikant durch Aminosäuresubstitutionen in der Neuraminidase (NA) von A(H3N2)-Viren beeinflusst zu werden. Es ist besonders nützlich für die Charakterisierung von Viren, die entweder zu einem niedrigen HA-Titer heranwachsen und/oder eine abortive Infektion durchlaufen, die dazu führt, dass in kultivierten Zellen keine Plaques gebildet werden können.
Mikroneutralisation (MN) Assays werden in der Virologie für die Quantifizierung von neutralisierenden Antikörpern und antivirale Aktivitäten. Als Alternative der Hämagglutinations - Inhibitions (HALLO) -Assays können MN - Assays überwinden nicht-antigen durch die Affinitätsänderungen Rezeptorbindungs in Influenza - Viren beeinflusst Effekte, die die Interpretation der Ergebnisse HALLO 1,2,3 erschweren können. Bis vor kurzem wurden die meisten MN Assays basierend auf cytopathische Effekte (CPE) oder Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) 4,5. MN - Assays auf Basis von Fokus und Plaque - Reduktion wurden 1990 6.7.8 entwickelt. Plaque-Reduktionstests beruhen auf Zählen sichtbare Plaques Infektiosität zu quantifizieren. Jedoch visuelle zählt decken nur große Plaques, die durch das menschliche Auge auflösbare sind, obwohl die Mehrheit der Plaques sind klein und unsichtbar für viele aktuelle zirkulierenden Viren. Diese unvollständige Abdeckung kann erhebliche Unterschiede zwischen den Prüfern und zwischen den Experimenten führen, was zu incomparable Ergebnisse. Es ist auch nicht möglich, die Methode zu verwenden, wenn einige Viren abortive Infektion einzelner Zellen zeigen oder sehr kleine Plaques.
Die schlechte Zählauflösung kann durch die Einführung eines bildbasierten Protokolls verbessert werden. Mit den Fortschritten in der Technologie, optische Mikroskopie und Hochdurchsatz - Well-Platte Leser können genaues Mittel zur Verfügung stellen , die infizierten Zellen 9 zu zählen. Unter einem trans beleuchtet Mikroskop, mit bestimmten Markern markiert infizierten Zellen können durch ihre Absorption oder Fluoreszenzkontrast in subzellulärer Auflösung visualisiert werden. Eine Probe kann dann auf einem Computer ausgewertet werden.
Leider aufgrund der Beschränkung auf das Sichtfeld, mehr als hundert gekachelte Bilder eine einzelne gut zu decken sind erforderlich. eine Platte mit 96 Vertiefungen Analyse würde die Bildgebung und Verarbeitung von etwa zehntausend Bilder erfordern. Solch ein mühsamer Prozess ist zeitaufwendig und teuer, und die Auflösung in den Gattungen gewonnen istl unnötig für Routine Charakterisierung von viralen Infektionen. kann Laboratories mit einem begrenzten Budget zu finden, dass die rund um einen Flachbettscanner gebaut Ansatz eine kosteneffektive bietet, Hochdurchsatz-Alternative.
In diesem Papier beschreiben wir eine verbesserte Plaquereduktions MN-Assay, der für die antigenen Charakterisierung einer großen Anzahl von Viren und zur quantitativen Messung der antiviralen Aktivitäten und Neutralisationsantikörper geeignet ist. Der Assay hat mehrere Vorteile: Zum einen ist es eine Abbildungsbasierten Assay, der, unabhängig von Plaquegröße in der Lage, Virus-Infektionen auf zellulärer Ebene zu messen. Zählen der Gesamt infizierte Zellpopulation (ICP) in einem gut erhöht die Erfassungsempfindlichkeit, die es ermöglichen, die Viren mit geringen Infektiosität zu charakterisieren. Zweitens wird eine genauere quantitative Titration vor der Neutralisation eingeführt, um die Menge von Eingangs Virus zu bestimmen. Die quantitative Eingangs Virus reduziert signifikant die variation zwischen verschiedenen Experimenten und stellt die Ergebnisse besser vergleichbar zwischen den Laboratorien. Drittens kann Neutralisationstiter direkt Bilder durch die Analyse bestimmt werden, so dass die Quantifizierung schnell und benutzerfreundlich. Schließlich bietet das Protokoll eine kostengünstige und Hochdurchsatz-Alternative mit der erforderlichen Auflösung und Genauigkeit. Die Quantifizierung basiert auf einem Flachbettscanner und kostenlose Software zur Datenverarbeitung. Die gesamte Einrichtung hat eine kleine Stellfläche und ist einsetzbares in den meisten Labors.
Das Protokoll in diesem Papier besteht aus vier Hauptschritten, einschließlich Virus-Titration Titration Quantifizierung, Virusneutralisations- und Neutralisierung Quantifizierung. Virustitration eine Zubereitung Experiment, das die Menge von Eingangs Viren bestimmt in der Neutralisation verwendet werden. Während einer Titration wird eine Anzahl von viralen Konzentrationen zu den Zellmonoschichten in einer Platte mit 96 Vertiefungen aufgetragen. Die infizierten Zellen werden dann in Abschnitt 2. Die virale Dilu quantifizierttion, die 20% bis 85% erzeugt wird ICP wiederum als Input-Viren auf die entsprechende Neutralisierung angewendet in Abschnitt 3. Die Titer des Neutralisierungsprotokolls werden quantifiziert Abschnitt mit 4 Experimente, die die oben genannten Protokolle befolgt werden in den Repräsentative Ergebnisse vorgestellt. Der Test wurde mit den meisten der aktuellen zirkulierenden Influenza-Viren, wie beispielsweise A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B Viren gründlich in den letzten zwei Jahren getestet. Die Ergebnisse der Influenza-Virus-Charakterisierung wurden in den Berichten für das WHO-Konsultationstreffen einbezogen, die in 2016-2017 im Jahr 2016 und der nördlichen Hemisphäre Empfehlungen für Influenza-Impfstoffe für den Einsatz in der südlichen Hemisphäre gab.
HINWEIS: Die Biosicherheitsstufe (BSL) für das folgende Protokoll ist BSL 2 für die saisonale Influenza-Viren und BSL 3+ für mögliche Influenza-Pandemie-Viren. Viral Titration wird vor einer Neutralisationsexperiment erforderlich, um die Viruskonzentration der Viruskontrolle (VC) zu entscheiden.
1. Virus-Titration
HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Viren und die Anzahl der Duplikate kann eine Well - Platte mit den folgenden Flexibilitäten eingerichtet werden: (1) Die virale Verdünnung kann entweder entlang den Zeilen oder Spalten (Abbildung 1) angeordnet werden. Jedes Virus sollte eine separate Zeile / Spalte besetzen. (2) Die virale Verdünnungsschritt ist flexibel, aber es sollte mit der höchsten Viruskonzentration an der oberen linken Ecke beginnen. (3) Es gibt keine Beschränkung für die Anzahl von Duplikaten.
HINWEIS: Madin Darby Hundenieren (MDCK) und MDCK-SIAT1 (SIAT) Zellen wurden freundlicherweise von Dr. M. Matrosovich, Marburg, Ger bereitgestelltviele 10. SIAT Zellen MDCK Zellen, die stabil mit dem menschlichen CMP-N-Acetylneuraminat transfiziert: ß-Galactosid α-2,6-sialyltransferase-Gen für eine verstärkte Expression von Sialinsäure (SA) α2-6Gal-termini Oligosaccharide.
2. Titration Quantifizierung
3. Virusneutralisations-
HINWEIS: Berechnen der Anzahl von Platten für die Neutralisationstest erforderlich. Jede Platte kann ein Virus und eine Reihe von Antiseren zubringen.
HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Antiseren und die Anzahl der Duplikate kann eine Well-Platte mit th eingerichtet werdene folgende Flexibilitäten: (1) Die Serumverdünnung kann entlang jeder Zeile oder einer Spalte (Abbildung 4) angeordnet werden. Jedes Serum sollte eine separate Zeile oder Spalte zu besetzen. (2) Das Inkrement der Serumverdünnung ist flexibel, aber es sollte mit der höchsten Serumkonzentration an der oberen linken Ecke einer Platte beginnen. (3) Die Anzahl der Duplikate gleicht die Anzahl von Antiseren. Weitere Duplikate können helfen experimentellen Variationen zu glätten. (4) Die Anzahl der VC und die Anzahl der Zellsteuerung (CC) dupliziert sind flexibel, aber sie sollten auch in getrennten Zeilen oder Spalten sein. Es wird erwartet, dass die Anzahl von VC Duplikaten ist deutlich größer als die der Antiseren.
4. Neutralization Quantifizierung
Im Anschluss an die oben genannten Verfahren stellen wir einige Ergebnisse aus den jüngsten antigen-Experimente zur Charakterisierung. Die Titration Setup wurde entwickelt, acht Eingangs Viren zu untersuchen, mit Doppel Duplikate für jede Verdünnung. Die viralen Verdünnungen wurden zwischen 1,0 x 10 -1 und 1,0 x 1,0 -6 decken die Variationen zwischen den Viren getestet. Die Testviren wurden von der H3N2-Subtyp, einschließlich A / Kamerun / 15V-3538/2015, A / Wladiwostok / 36/2015 A / Moskau / 103/2015 A / Tomsk / 5/2015 /, A / Moskau / 101 / 2015 A / Moskau / 100/2015, A / Moskau / 133/2015 und A / Bratislava / 437/2015. Die Titrationsergebnisse sind in 5 dargestellt. Figur 5d zeigt die Abnahme der ICPs mit der Zunahme der Virusverdünnung. Die Kurven gegen die HKP der gleichen Viren normalisiert wurden , die Infektionen in allen Zellen innerhalb eines gut 12 (definiert als ICP Sättigung) ergab. Wenn der ICP nicht erreichte Sättigung mit dem halloGhest Viruskonzentration wurde die ICP Durchschnitt von entsprechenden Duplikaten verwendet statt (A / Moskau / 103/2015 in Abbildung 5d). Die Virusverdünnungen , die 30% der Sättigungs ICP produziert wurden als Eingangsvirusverdünnung zur Neutralisation (Tabelle 3) ausgewählt.
Neutralization richtet einen Eingang Virus gegen fünf Antiseren zu haben, mit Doppel-Duplikate auf jeder Platte. Der Referenzvirus gezeigt ist H3N2 A / Stockholm / 63/2015. Die fünf Antiseren sind A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Südafrika r2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, und A / Dutch 525/14 SIAT f23 / 15. Die Neutralisationsergebnisse sind in Figur 6 veranschaulicht. Figur 6d zeigt den Fortschritt der Infektion mit dem Anstieg der Serumverdünnung. Die normierte positive Population auf der vertikalen Achse stellt das Verhältnis der ICPs aus dem entsprechenden Antiseren Antwort gegen das mittlere ICPdes Referenzvirus 12. Der Hintergrund ICP von nicht infizierten Zellkontrollen wurde während der Normalisierung abgezogen. Die Neutralisationstiter wurden als die reziproken Werte der Antiserum - Verdünnungen bestimmt entsprechend 50% ICP Reduktion (Tabelle 4). Die lineare Interpolation wurde verwendet Titer zwischen zwei benachbarten Serumverdünnungen fallen abzuschätzen.
Abbildung 1: Beispiel einer gut Platte Setup in einem Virus Titrationsexperiment. Test-Viren werden auf getrennte Zeilen (A bis H) zugeordnet. Spalten werden für verschiedene Virusverdünnungen (1 bis 12) ausgebildet ist. Zwei Säulen wurden als Duplikate für jeden viralen Verdünnung verwendet. Maßstabsbalken = 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Desktop Diagramm des "Wellplate Reader" Quantifizierungssoftware. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Ergebnisse einer Titrationsexperiment. (A) Die gut Platte Setup, (b) gescannt gut Platte Bild, (c) Abbildungder farbcodierten, quantifiziert, virusinfizierten Zellpopulation, und (d) normalisierte virusinfizierten Zellpopulationen gegen Virus - Verdünnungen. 30% ICP wurde als Schwellenwert verwendet. Die Fehlerbalken in (d) sind Standardabweichungen (SD) aus den Proben Vervielfältigungen (± 1 SD). Maßstabsbalken in (b) und (c) = 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Ergebnisse einer Neutralisationsexperiment. (A) Die gut Platte Setup, (b) gescannt gut Platte Bild, (c) Darstellung des quantifiziert, virusinfizierten Zellpopulation, und (d) normalisierte virusinfizierten Zellpopulation gegen die Serumverdünnung. Der Eingang virus (VC) ist A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP wurde verwendet, um die Titer zu berechnen. Die Fehlerbalken in (d) sind Standardabweichungen (SD) aus den Proben Vervielfältigungen (± 1 SD). Maßstabsbalken in (b) und (c) = 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Ergänzende S1: Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
| Typische Verdünnungs | ||
| MDCK - Zellen | MDCK-Zellen SIAT1 | |
| 2 Tage | 1: 5 (1 + 4) | 01.10 (1 + 9) |
| 3 Tage | 01.10 (1 + 9)01.20 (1 + 19) | |
| Typische Anzahl von Zellen pro ml | ||
| MDCK - Zellen | MDCK-Zellen SIAT1 | |
| 2 Tage | 2 x 10 & sup5 ; | 1 x 10 & sup5 ; |
| 3 Tage | 1 x 10 & sup5 ; | 5 x 10 & sup4 ; |
Tabelle 1: Typische Verdünnungen auf einer Subkultur konfluierender Flaschen von MDCK oder MDCK-SIAT1 Zellen.
| Modus | Professioneller Modus |
| Art des Dokuments | Film (mit Film Area Guide) |
| Automatische Belichtung | Foto |
| Ich binAlter Art | 24-Bit-Farbe |
| Lösung | 1.200 dpi |
| Gespeichert Foto Format | TIFF |
Tabelle 2: Typischer Aufbau eines Flachbettscanners.
| Reihe | Virus | Empfohlene Verdünnung |
| EIN | A / Cameron / 15V-3538/2016 | 1,0 x 10 -2 |
| B | A / Wladiwostok / 36/2015 | 1,0 x 10 -3 |
| C | A / Moskau / 103/2015 | 1,1 x 10 -1 |
| D | A / Tomsk / 5/2015 | 5,9 x 10 -1 |
| E | A / Moskau / 101/2015 | 8,3 x 10 -1 |
| F | A / Moskau / 100/2015 | 1,4 x 10 -2 |
| G | A / Moskau / 133/2015 | 1,3 x 10 -2 |
| H | A / Bratislava / 437/2015 | 1,3 x 10 -4 |
Tabelle 3: Viral Verdünnungen aus einer Population von 30% ICP berechnet.
| Spalte | Antiseren | Empfohlene Titer |
| 1 bis 2 | A / HK4801 / 2014 | 110 |
| 3 bis 4 | A / HK7295 / 2014 | 213,3 |
| A / Südafrika / r2665 / 2015 | 2.155,8 | |
| 7 - 8 | A / Schweiz / 9715293/2013 | 89,4 |
| 9 - 10 | A / Niederlande / 525/2014 | 78,6 |
Tabelle 4: Die Titer bei 50% ICP von A / Stockholm / 63/2015 gegen Antiseren.
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Diese Studie beschreibt ein Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.
Die Autoren danken Dr. M. Matrosovich für die Bereitstellung der übergeordneten MDCK- und MDCK-SIAT1-Zelllinien und Roche Pharmaceuticals für die Bereitstellung des Oseltamivir-Carboxylats. Wir danken auch Dr. Anne Weston für ihre wertvollen Vorschläge zum Manuskript. Diese Studie war auf die wertvolle Zusammenarbeit der Nationalen Influenzazentren der WHO und der WHO-CCs innerhalb des WHO-GISRS angewiesen, die die verwendeten Influenzaviren zur Verfügung stellten. Diese Arbeit wurde vom Medical Research Council im Rahmen des Programms U117512723 finanziert.
| VGM | Sigma | D6429, P0781 | 500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb |
| PBS A | Nature pH Phosphatgepufferte Kochsalzlösung: NaCl 10 g, KCl 0,25 g, Na2HPO4 1.437 g, KH2PO4 0.25 g und Dist. Wasser 1 L. | ||
| Avicell | FMC | RC-581F | 2,4 g in 100 ml destilliertem Wasser, gelöst durch Rühren auf einem Magnetrührer für 1 Std. Sterilisieren durch Autoklavieren. |
| 2x DMEM | Gibco | 21935-028 | |
| Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Overlay (10 ml/Platte): | 5 ml 2x DMEM, Trypsin 2 μ g/ml Endkonzentration, Avicell 5 ml | ||
| Triton X- 100e | Sigma | T8787 | Permeabilisierungspuffer: 0,2 % in PBS A (v/v) |
| Tween 80 | Sigma | P5188 | Waschpuffer: 0,05 % Tween 80 in PBS A (v/v) |
| Pferdeserum | PAA Labs Ltd | B15-021 | ELISA Puffer: 10 % in PBS A (v/v) + 0,1 % Tween 80 |
| Maus MAb gegen Influenza Typ A | Biorad | MCA 400 | 1st Antikörper: 1:1.000 in ELISA Puffer |
| Ziege Anti-Maus IgG (H+L) HRP Konjugat | Biorad | 172-1011 | 2nd Antikörper: 1:1.000 in ELISA Puffer |
| True Blu Peroxidase | Substrat KPL | 50-78-02 | Substrat: True Blue +0,03 % H2O2g (1:1.000 von 30 % Lösung) |
| 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden | Costar | 3596 | |
| 8-Kanal-Steg-Unterlegscheibe und Verteiler | Sigma | M2656 | |
| Perfection Plate Scanner | Epson | V750 Pro | Die Imaging-Software kann kostenlos heruntergeladen werden von http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134& infoType=Downloads. |
| Betriebsumgebung der Software: LabVIEW | National Instruments Corporation | Window basierend auf NI Vision Builder | Version: LabVIEW2012 oder höher |
