Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

Summary

Diese Studie beschreibt ein Imaging-basierte Mikroneutralisationstest auf die antigenen Beziehungen zwischen Viren zu analysieren. Das Protokoll verwendet einen Flachbettscanner und hat vier Schritte, einschließlich der Titration Titration Quantifizierung, Neutralisierung und Neutralisierung Quantifizierung. Der Test funktioniert gut mit aktuellen zirkulierenden Influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B-Viren.

Abstract

Der Mikroneutralisations-Assay (MN) ist eine Standardtechnik zur Messung der Infektiosität des Influenzavirus und der Hemmung der Virusreplikation. In dieser Studie stellen wir das Protokoll eines bildgebenden MN-Assays vor, um die wahren antigenen Beziehungen zwischen Viren zu quantifizieren. Im Gegensatz zu typischen Plaque-Reduktions-Assays, die auf sichtbaren Plaques beruhen, quantifiziert dieser Assay die gesamte infizierte Zellpopulation jeder Vertiefung. Das Protokoll gleicht den Virustyp oder -subtyp mit der Auswahl der Zelllinien ab, um eine maximale Infektiosität zu erreichen, was den Probenkontrast während der Bildgebung und Bildverarbeitung erhöht. Die Einführung der quantitativen Titration definiert die Menge der zu neutralisierenden Eingangsviren und ermöglicht es, die Ergebnisse verschiedener Experimente vergleichbar zu machen. Das Imaging-Setup mit einem Flachbettscanner und kostenlos herunterladbarer Software macht den Ansatz mit hohem Durchsatz, kostengünstig, benutzerfreundlich und in den meisten Laboren einfach zu implementieren. Unsere Studie zeigt, dass der verbesserte MN-Assay gut mit den aktuellen zirkulierenden Influenzaviren A(H1N1)pdm09, A(H3N2) und B-Viren funktioniert, ohne signifikant durch Aminosäuresubstitutionen in der Neuraminidase (NA) von A(H3N2)-Viren beeinflusst zu werden. Es ist besonders nützlich für die Charakterisierung von Viren, die entweder zu einem niedrigen HA-Titer heranwachsen und/oder eine abortive Infektion durchlaufen, die dazu führt, dass in kultivierten Zellen keine Plaques gebildet werden können.

Introduction

Mikroneutralisation (MN) Assays werden in der Virologie für die Quantifizierung von neutralisierenden Antikörpern und antivirale Aktivitäten. Als Alternative der Hämagglutinations - Inhibitions (HALLO) -Assays können MN - Assays überwinden nicht-antigen durch die Affinitätsänderungen Rezeptorbindungs in Influenza - Viren beeinflusst Effekte, die die Interpretation der Ergebnisse HALLO ^1,2,3 erschweren können. Bis vor kurzem wurden die meisten MN Assays basierend auf cytopathische Effekte (CPE) oder Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) ^4,5. MN - Assays auf Basis von Fokus und Plaque - Reduktion wurden 1990 ^6.7.8 entwickelt. Plaque-Reduktionstests beruhen auf Zählen sichtbare Plaques Infektiosität zu quantifizieren. Jedoch visuelle zählt decken nur große Plaques, die durch das menschliche Auge auflösbare sind, obwohl die Mehrheit der Plaques sind klein und unsichtbar für viele aktuelle zirkulierenden Viren. Diese unvollständige Abdeckung kann erhebliche Unterschiede zwischen den Prüfern und zwischen den Experimenten führen, was zu incomparable Ergebnisse. Es ist auch nicht möglich, die Methode zu verwenden, wenn einige Viren abortive Infektion einzelner Zellen zeigen oder sehr kleine Plaques.

Die schlechte Zählauflösung kann durch die Einführung eines bildbasierten Protokolls verbessert werden. Mit den Fortschritten in der Technologie, optische Mikroskopie und Hochdurchsatz - Well-Platte Leser können genaues Mittel zur Verfügung stellen , die infizierten Zellen ⁹ zu zählen. Unter einem trans beleuchtet Mikroskop, mit bestimmten Markern markiert infizierten Zellen können durch ihre Absorption oder Fluoreszenzkontrast in subzellulärer Auflösung visualisiert werden. Eine Probe kann dann auf einem Computer ausgewertet werden.

Leider aufgrund der Beschränkung auf das Sichtfeld, mehr als hundert gekachelte Bilder eine einzelne gut zu decken sind erforderlich. eine Platte mit 96 Vertiefungen Analyse würde die Bildgebung und Verarbeitung von etwa zehntausend Bilder erfordern. Solch ein mühsamer Prozess ist zeitaufwendig und teuer, und die Auflösung in den Gattungen gewonnen istl unnötig für Routine Charakterisierung von viralen Infektionen. kann Laboratories mit einem begrenzten Budget zu finden, dass die rund um einen Flachbettscanner gebaut Ansatz eine kosteneffektive bietet, Hochdurchsatz-Alternative.

In diesem Papier beschreiben wir eine verbesserte Plaquereduktions MN-Assay, der für die antigenen Charakterisierung einer großen Anzahl von Viren und zur quantitativen Messung der antiviralen Aktivitäten und Neutralisationsantikörper geeignet ist. Der Assay hat mehrere Vorteile: Zum einen ist es eine Abbildungsbasierten Assay, der, unabhängig von Plaquegröße in der Lage, Virus-Infektionen auf zellulärer Ebene zu messen. Zählen der Gesamt infizierte Zellpopulation (ICP) in einem gut erhöht die Erfassungsempfindlichkeit, die es ermöglichen, die Viren mit geringen Infektiosität zu charakterisieren. Zweitens wird eine genauere quantitative Titration vor der Neutralisation eingeführt, um die Menge von Eingangs Virus zu bestimmen. Die quantitative Eingangs Virus reduziert signifikant die variation zwischen verschiedenen Experimenten und stellt die Ergebnisse besser vergleichbar zwischen den Laboratorien. Drittens kann Neutralisationstiter direkt Bilder durch die Analyse bestimmt werden, so dass die Quantifizierung schnell und benutzerfreundlich. Schließlich bietet das Protokoll eine kostengünstige und Hochdurchsatz-Alternative mit der erforderlichen Auflösung und Genauigkeit. Die Quantifizierung basiert auf einem Flachbettscanner und kostenlose Software zur Datenverarbeitung. Die gesamte Einrichtung hat eine kleine Stellfläche und ist einsetzbares in den meisten Labors.

Das Protokoll in diesem Papier besteht aus vier Hauptschritten, einschließlich Virus-Titration Titration Quantifizierung, Virusneutralisations- und Neutralisierung Quantifizierung. Virustitration eine Zubereitung Experiment, das die Menge von Eingangs Viren bestimmt in der Neutralisation verwendet werden. Während einer Titration wird eine Anzahl von viralen Konzentrationen zu den Zellmonoschichten in einer Platte mit 96 Vertiefungen aufgetragen. Die infizierten Zellen werden dann in Abschnitt 2. Die virale Dilu quantifizierttion, die 20% bis 85% erzeugt wird ICP wiederum als Input-Viren auf die entsprechende Neutralisierung angewendet in Abschnitt 3. Die Titer des Neutralisierungsprotokolls werden quantifiziert Abschnitt mit 4 Experimente, die die oben genannten Protokolle befolgt werden in den Repräsentative Ergebnisse vorgestellt. Der Test wurde mit den meisten der aktuellen zirkulierenden Influenza-Viren, wie beispielsweise A (H1N1) pdm09, A (H3N2) und B Viren gründlich in den letzten zwei Jahren getestet. Die Ergebnisse der Influenza-Virus-Charakterisierung wurden in den Berichten für das WHO-Konsultationstreffen einbezogen, die in 2016-2017 im Jahr 2016 und der nördlichen Hemisphäre Empfehlungen für Influenza-Impfstoffe für den Einsatz in der südlichen Hemisphäre gab.

Protocol

HINWEIS: Die Biosicherheitsstufe (BSL) für das folgende Protokoll ist BSL 2 für die saisonale Influenza-Viren und BSL 3+ für mögliche Influenza-Pandemie-Viren. Viral Titration wird vor einer Neutralisationsexperiment erforderlich, um die Viruskonzentration der Viruskontrolle (VC) zu entscheiden.

1. Virus-Titration

HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Viren und die Anzahl der Duplikate kann eine Well - Platte mit den folgenden Flexibilitäten eingerichtet werden: (1) Die virale Verdünnung kann entweder entlang den Zeilen oder Spalten (Abbildung 1) angeordnet werden. Jedes Virus sollte eine separate Zeile / Spalte besetzen. (2) Die virale Verdünnungsschritt ist flexibel, aber es sollte mit der höchsten Viruskonzentration an der oberen linken Ecke beginnen. (3) Es gibt keine Beschränkung für die Anzahl von Duplikaten.

HINWEIS: Madin Darby Hundenieren (MDCK) und MDCK-SIAT1 (SIAT) Zellen wurden freundlicherweise von Dr. M. Matrosovich, Marburg, Ger bereitgestelltviele ^10. SIAT Zellen MDCK Zellen, die stabil mit dem menschlichen CMP-N-Acetylneuraminat transfiziert: ß-Galactosid α-2,6-sialyltransferase-Gen für eine verstärkte Expression von Sialinsäure (SA) α2-6Gal-termini Oligosaccharide.

1. Aliquot ausreichend MDCK - Zellen oder MDCK-Zellen SIAT ⁸ in 96-Well - Platten (200 & mgr; l / Well). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 2 oder 3 Tage Konfluenz zu erreichen. Propagation der Zellen in DMEM, supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) und Antibiotika (100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin). Inkubieren der SIAT Zellen bei 37 ° C mit 5% CO ₂ und 1 mg / ml G418 Sulfat.
   HINWEIS: Der Verdünnungsfaktor auf der Erfahrung und der verwendeten Zelllinie abhängig ist. Die Zellmonoschicht konfluent ist (dh, keine Zellwand oder sichtbaren Umriss für MDCK - Zellen und einem dicht gepackten Layout für MDCK-Zellen SIAT1) zum Zeitpunkt der Virusinokulation. Beispiele für Verdünnungen basierend aufdie Subkultur konfluierender Flaschen von MDCK oder MDCK-SIAT1 Zellen sind in Tabelle 1 angegeben.
2. Waschen Sie die Zellen 3-mal mit 200 ul Viruswachstumsmedium (VGM) pro Vertiefung. Sterilisieren Sie die mehrwandige Platte Scheibe mit 70% EtOH für 30 Minuten und dann spülen Sie es in steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder VGM vor der Wäsche.
3. Saugen Sie das VGM und sofort 50 ul VGM hinzufügen zu jedem Loch.
4. Hinzufügen 900 ul VGM jedem von 6 sterilen Röhrchen (oder weniger, abhängig von der Anzahl der Testviren und Duplikate). Je 100 & mgr; l Virus in das erste Rohr, gut mischen und seriell verdünnt, die Spitzen zwischen jeder Verdünnung zu verändern. Wiederholen Sie dies für jeden Virus titriert werden.
   ANMERKUNG: Dies wird Virusverdünnungen von 10 ^-1 bis 10 ^-6 erhalten.
5. Werden 50 & mgr; l jeder Virusverdünnung, bei der höchsten Verdünnung ausgehend (1 x 10 ^-5 in Abbildung 1), um duplizierten Vertiefungen (Spalten 9 und 10 in Figur 1) eines 96-Well-Platte.
6. Die Platte wird bei 37 ° C für 2-3 Stunden das Virus zu ermöglichen, um die Zellen zu infizieren.
   ANMERKUNG: Eine 2 bis 3-stündiger Inkubation notwendig, um sicherzustellen, dass die Viren in dem Inokulum genug Zeit, um die Monoschicht zu erreichen.
7. Bereiten Sie die Auflage (10 ml / Platte)
   HINWEIS: Die Auflage besteht aus 5 ml 2x DMEM, Trypsin (2 ug / ml Endkonzentration), 20 & mgr; l von 1 mg / ml Brühe, und 5 ml Cellulose-Linters (siehe Materialliste).
8. Entfernen Sie den Impfstoff.
9. Fügen Sie die Overlay (200 & mgr; l in jede Vertiefung). Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, ungestört.
   HINWEIS: Das Virus Austrieb erfolgt nach ca. 4 Stunden, so ist es wichtig, dass die Platte nach dieser Zeit nicht gestört wird.
10. Saugen Sie das Overlay aus den Vertiefungen.
11. In eiskaltem 4% Paraformaldehyd in PBS A (200 ul / Vertiefung). Legen sie bei 4 ° C für 30 min oder bei Raumtemperatur für 20 min.
    HINWEIS: PBS A ist natürlich pH phosphatgepufferter Salzlösung mit 10 unterwegsf NaCl, 0,25 g KCl, 1,437 g Na ₂ HPO _4, 0,25 g KH ₂ PO ₄ und 1 l destilliertem Wasser (siehe Materialliste).
    HINWEIS: Paraformaldehyd ist schädlich beim Einatmen und kann zu Verbrennungen führen beim Verschlucken. Es gibt auch beschränkte Beweise für eine krebserregende Wirkung, und es kann eine Sensibilisierung nach Hautkontakt möglich.
12. Saugen Sie das Paraformaldehyd und waschen Sie die Platten zweimal mit PBS A (200 ul / Vertiefung).
13. Lagern Sie die Platten in PBS A bei 4 ° C für eine spätere Verwendung oder weiter mit den folgenden Schritten.
14. Hinzufügen Permeabilisierung Puffer (100 ul / Vertiefung). Lassen Sie es für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
15. Waschen Platte zweimal mit PBS A (200 ul / Vertiefung).
16. Werden 50 & mgr; l des ersten Antikörpers, Maus MAb gegen Influenza Typ A (1: 1000 in ELISA-Puffer), pro Vertiefung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde (oder 4 ° C über Nacht) unter Schütteln.
17. Waschen Sie es 3-mal in 100 & mgr; l Waschpuffer (0,05% Tween 80 in PBS A, v / v) per gut. Inkubieren Sie für 5 min zwischen Wäschen bei Raumtemperatur. Alternativ waschen Sie es 3 Mal ohne Inkubation mit 300 & mgr; l pro Vertiefung.
18. Je 50 ul des zweiten Antikörpers, Ziegen-anti-Maus-IgG (H + L) HRP-Konjugat (1: 1000 in ELISA-Puffer), pro Vertiefung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde unter Schütteln.
19. Waschen Sie es 3 mal wie in Schritt 1.17 beschrieben.
20. Fügen Sie das Substrat (50 & mgr; l / Well). Inkubieren für 30 min oder bis die Entwicklung einer blauen Farbe bei Raumtemperatur ist deutlich sichtbar.
21. Um die Reaktion zu stoppen, zweimal waschen Sie die Platte mit 200 ul destilliertem Wasser pro Vertiefung Inkubation bei Raumtemperatur für 2 -3 min zwischen den Wäschen.
22. Der Luft trocknen Sie die Platte und bewahren Sie sie an einem dunklen Ort (zB wickeln Sie es in Alufolie).

2. Titration Quantifizierung

1. Legen Sie eine Well - Platte im Scanbereich eines Flachbettscanners, wie in Abbildung 2a dargestellt. Verwenden Sie die L-Form Positionsgrenze zueine optimale und wiederholbare Bildgebung Standort gewährleisten.
   HINWEIS: Es ist möglich, Bild zwei Well-Platten in einem Scan.
2. ein Bild scannen.
   HINWEIS: Die Einstellungen werden in Tabelle 2 gezeigt.
3. Führen Sie den "Wellplate Reader" Software die erforderliche Viruskonzentration (Abbildung 3) zu berechnen.
   1. Klicken Sie auf "Bild laden", um ein Bild zu laden. Schieben Sie den roten Balken im Histogramm der "Global Threshold", um die Samplingschwelle einzustellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aktualisieren" um die Wirkung auf das Bild zu untersuchen.
   2. Markieren Sie das "Berechnen Neutralization / Titration" -Box. Klicken Sie auf die "Sampling", um den ICP zu quantifizieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern" die Ergebnisse der Probenahme zu speichern, wenn Sie dazu aufgefordert.
      HINWEIS: Nach der Probenahme wird ein neues Fenster "Neutralization & Titration Berechnung" genannt wird automatisch angezeigt, wenn die "Berechnen Neutralization / Titration" Box aktiviert ist.
   3. Laden oder Eingabe der Well-Platte Definition Karte. Geben Sie die Schwelle (zB 30%) in "Titration: Optimal Viruspopulation (%)". Wählen Sie den "Titrationsprozesses", um die Titration Ergebnisse zu berechnen. Überprüfen Sie die Titrationsergebnissen. Klicken Sie auf "Speichern und schließen", um die Titration Ergebnisse zu speichern.
      HINWEIS: Siehe Ergänzungs S1 für weitere detaillierte Anleitung zur Software. Eine Kopie der maßgeschneiderten Software ist auf Anfrage erhältlich.
      HINWEIS: In der Regel ist die beste Virusverdünnung für die Plaque-Reduktionsassay Ausbeuten um 50% (20-85%) ICP der gesamten Zellen in jeder Vertiefung ^11.

3. Virusneutralisations-

HINWEIS: Berechnen der Anzahl von Platten für die Neutralisationstest erforderlich. Jede Platte kann ein Virus und eine Reihe von Antiseren zubringen.

HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Antiseren und die Anzahl der Duplikate kann eine Well-Platte mit th eingerichtet werdene folgende Flexibilitäten: (1) Die Serumverdünnung kann entlang jeder Zeile oder einer Spalte (Abbildung 4) angeordnet werden. Jedes Serum sollte eine separate Zeile oder Spalte zu besetzen. (2) Das Inkrement der Serumverdünnung ist flexibel, aber es sollte mit der höchsten Serumkonzentration an der oberen linken Ecke einer Platte beginnen. (3) Die Anzahl der Duplikate gleicht die Anzahl von Antiseren. Weitere Duplikate können helfen experimentellen Variationen zu glätten. (4) Die Anzahl der VC und die Anzahl der Zellsteuerung (CC) dupliziert sind flexibel, aber sie sollten auch in getrennten Zeilen oder Spalten sein. Es wird erwartet, dass die Anzahl von VC Duplikaten ist deutlich größer als die der Antiseren.

1. Bereiten Sie die Zellmonoschicht, wie in den Schritten 1.1-1.3, 2 oder 3 Tage im Voraus.
2. In 50 ul VGM in jede Vertiefung der Platte.
3. Verwenden Sie Spalten 11 und 12 für VC bzw. CC. Zugabe von 50 & mgr; l Aliquots von 1:20 Rezeptor zerstörende Enzym (RDE) -behandelten Serum zu der ersten Reihe (A) von Columns 1-10.
   HINWEIS: Für jeden Virus und Serum-Kombination wird der Test in doppelter Ausfertigung durchgeführt, so dass eine Platte kann beispielsweise enthalten ein Virus gegen fünf Antiseren getestet.
4. Führen 2-fache serielle Verdünnungen von 50 & mgr; l von Reihe zu Reihe A Übertragung H (Spalten 1-10 in Figur 4) und Verwerfen von 50 & mgr; l von Reihe H.
5. Zugabe von 50 & mgr; l Verdünnungsmittel zu jeder Vertiefung der CC Spalte (Spalte 12 in Figur 4).
6. Je 50 ul des Virus zu jeder Vertiefung der Platte, mit Ausnahme des CC - Säule (Spalten 1-11, Reihen AH in Abbildung 4).
7. Inkubieren bei 37 ° C für 2-3 Stunden. Entfernen Sie den Impfstoff. Fügen Sie das Overlay (200 ul) in jede Vertiefung. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, ungestört. Fix und färben die Platten wie für die Virus-Titration (Schritte 1,11-1,22).

4. Neutralization Quantifizierung

1. Legen Sie eine Well - Platte im Scanbereich eines Flachbettscanners, wie in Figu gezeigtre 2a. Verwenden Sie die L-Form Positionsgrenze eine optimale und wiederholbare Bildgebung Standort zu gewährleisten.
   HINWEIS: Es ist möglich, Bild zwei Well-Platten in einem Scan.
2. Scannen Sie die Platte, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
3. Führen Sie den "Wellplate Reader" Software die erforderlichen viralen Titer (Abbildung 3, Schritt 2.3) zu berechnen.
   1. Klicken Sie auf "Bild laden", um ein Bild zu laden. Schieben Sie den roten Balken in "Globale Threshold", um die Samplingschwelle einzustellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Aktualisieren" um die Wirkung zu untersuchen.
   2. Markieren Sie das "Berechnen Neutralization / Titration" -Box. Klicken Sie auf die "Sampling", um den ICP zu quantifizieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Speichern" die Ergebnisse der Probenahme zu speichern, wenn Sie dazu aufgefordert.
      HINWEIS: Nach der Probenahme wird ein neues Fenster "Neutralization & Titration Berechnung" genannt wird automatisch angezeigt, wenn die "Berechnen Neutralization / Titration" Box aktiviert ist.
   3. Laden oder Eingabe der gut pEnde der Karte. Zeigen den Schwellenwert (zB 50%) in "Neutralization. Infection Abzug (%)"
   4. Wählen Sie "Neutralisierungsprozess", um die Titer berechnen. Überprüfen Sie die Titer und klicken Sie auf "Speichern und schließen", um die Neutralisationsergebnisse zu speichern.
      HINWEIS: Die Neutralisation wird als Kehrwert der höchsten Verdünnung des Serums mit dem vordefinierten ICP Reduktion (beispielsweise 50% oder 80%) gegenüber dem VC (der Mittelwert der Spalte 11 in 4) angegeben. Eine 50% ige Reduktion ICP wurde in den Repräsentative Ergebnisse verwendet.

Results

Im Anschluss an die oben genannten Verfahren stellen wir einige Ergebnisse aus den jüngsten antigen-Experimente zur Charakterisierung. Die Titration Setup wurde entwickelt, acht Eingangs Viren zu untersuchen, mit Doppel Duplikate für jede Verdünnung. Die viralen Verdünnungen wurden zwischen 1,0 x 10 ^-1 und 1,0 x 1,0 ^-6 decken die Variationen zwischen den Viren getestet. Die Testviren wurden von der H3N2-Subtyp, einschließlich A / Kamerun / 15V-3538/2015, A / Wladiwostok / 36/2015 A / Moskau / 103/2015 A / Tomsk / 5/2015 /, A / Moskau / 101 / 2015 A / Moskau / 100/2015, A / Moskau / 133/2015 und A / Bratislava / 437/2015. Die Titrationsergebnisse sind in 5 dargestellt. Figur 5d zeigt die Abnahme der ICPs mit der Zunahme der Virusverdünnung. Die Kurven gegen die HKP der gleichen Viren normalisiert wurden , die Infektionen in allen Zellen innerhalb eines gut ¹² (definiert als ICP Sättigung) ergab. Wenn der ICP nicht erreichte Sättigung mit dem halloGhest Viruskonzentration wurde die ICP Durchschnitt von entsprechenden Duplikaten verwendet statt (A / Moskau / 103/2015 in Abbildung 5d). Die Virusverdünnungen , die 30% der Sättigungs ICP produziert wurden als Eingangsvirusverdünnung zur Neutralisation (Tabelle 3) ausgewählt.

Neutralization richtet einen Eingang Virus gegen fünf Antiseren zu haben, mit Doppel-Duplikate auf jeder Platte. Der Referenzvirus gezeigt ist H3N2 A / Stockholm / 63/2015. Die fünf Antiseren sind A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Südafrika r2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, und A / Dutch 525/14 SIAT f23 / 15. Die Neutralisationsergebnisse sind in Figur 6 veranschaulicht. Figur 6d zeigt den Fortschritt der Infektion mit dem Anstieg der Serumverdünnung. Die normierte positive Population auf der vertikalen Achse stellt das Verhältnis der ICPs aus dem entsprechenden Antiseren Antwort gegen das mittlere ICPdes Referenzvirus ^12. Der Hintergrund ICP von nicht infizierten Zellkontrollen wurde während der Normalisierung abgezogen. Die Neutralisationstiter wurden als die reziproken Werte der Antiserum - Verdünnungen bestimmt entsprechend 50% ICP Reduktion (Tabelle 4). Die lineare Interpolation wurde verwendet Titer zwischen zwei benachbarten Serumverdünnungen fallen abzuschätzen.

Abbildung 1: Beispiel einer gut Platte Setup in einem Virus Titrationsexperiment. Test-Viren werden auf getrennte Zeilen (A bis H) zugeordnet. Spalten werden für verschiedene Virusverdünnungen (1 bis 12) ausgebildet ist. Zwei Säulen wurden als Duplikate für jeden viralen Verdünnung verwendet. Maßstabsbalken = 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Schema eines Probenscansystem. (A) Eine 96-Well - Platte auf der Abbildungsposition eines Flachbettscanners (erneut veröffentlicht von Referenz ¹¹ mit Genehmigung von Elsevier BV), und (b) Abmessungen der L-förmigen Positionsgrenze , die in (a). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Desktop Diagramm des "Wellplate Reader" Quantifizierungssoftware. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Beispiel eines gut Platte Setup in einer Neutralisationsexperiment. Jedes Antiserum wird in zwei Spalten mit Dubletten (1 bis 10) zugeordnet ist. Zeilen werden für die verschiedenen Serumverdünnungen (A bis H) ausgebildet ist. Die Viruskontrolle nimmt Spalte 11, mit acht Duplikate (A11 bis H11). Die Zellkontrolle ist in Spalte 12, mit acht Duplikate (A12 bis H12). Maßstabsbalken = 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Ergebnisse einer Titrationsexperiment. (A) Die gut Platte Setup, (b) gescannt gut Platte Bild, (c) Abbildungder farbcodierten, quantifiziert, virusinfizierten Zellpopulation, und (d) normalisierte virusinfizierten Zellpopulationen gegen Virus - Verdünnungen. 30% ICP wurde als Schwellenwert verwendet. Die Fehlerbalken in (d) sind Standardabweichungen (SD) aus den Proben Vervielfältigungen (± 1 SD). Maßstabsbalken in (b) und (c) = 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6: Ergebnisse einer Neutralisationsexperiment. (A) Die gut Platte Setup, (b) gescannt gut Platte Bild, (c) Darstellung des quantifiziert, virusinfizierten Zellpopulation, und (d) normalisierte virusinfizierten Zellpopulation gegen die Serumverdünnung. Der Eingang virus (VC) ist A / Stockholm / 63/2015. 50% ICP wurde verwendet, um die Titer zu berechnen. Die Fehlerbalken in (d) sind Standardabweichungen (SD) aus den Proben Vervielfältigungen (± 1 SD). Maßstabsbalken in (b) und (c) = 10 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergänzende S1: Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

Typische Verdünnungs
	MDCK - Zellen	MDCK-Zellen SIAT1
2 Tage	1: 5 (1 + 4)	01.10 (1 + 9)
3 Tage	01.20 (1 + 19)
Typische Anzahl von Zellen pro ml
	MDCK - Zellen	MDCK-Zellen SIAT1
2 Tage	2 x 10 & sup5 ;	1 x 10 & sup5 ;
3 Tage	1 x 10 & sup5 ;	5 x 10 & sup4 ;

01.10 (1 + 9)

Tabelle 1: Typische Verdünnungen auf einer Subkultur konfluierender Flaschen von MDCK oder MDCK-SIAT1 Zellen.

Modus	Professioneller Modus
Art des Dokuments	Film (mit Film Area Guide)
Automatische Belichtung	Foto
Ich binAlter Art	24-Bit-Farbe
Lösung	1.200 dpi
Gespeichert Foto Format	TIFF

Tabelle 2: Typischer Aufbau eines Flachbettscanners.

Reihe	Virus	Empfohlene Verdünnung
EIN	A / Cameron / 15V-3538/2016	1,0 x 10 -2
B	A / Wladiwostok / 36/2015	1,0 x 10 -3
C	A / Moskau / 103/2015	1,1 x 10 -1
D	A / Tomsk / 5/2015	5,9 x 10 -1
E	A / Moskau / 101/2015	8,3 x 10 -1
F	A / Moskau / 100/2015	1,4 x 10 -2
G	A / Moskau / 133/2015	1,3 x 10 -2
H	A / Bratislava / 437/2015	1,3 x 10 -4

Tabelle 3: Viral Verdünnungen aus einer Population von 30% ICP berechnet.

Spalte	Antiseren	Empfohlene Titer
1 bis 2	A / HK4801 / 2014	110
3 bis 4	A / HK7295 / 2014	213,3
	A / Südafrika / r2665 / 2015	2.155,8
7 - 8	A / Schweiz / 9715293/2013	89,4
9 - 10	A / Niederlande / 525/2014	78,6

Tabelle 4: Die Titer bei 50% ICP von A / Stockholm / 63/2015 gegen Antiseren.

Discussion

In dieser Studie haben wir beschrieben, eine Bildgebungsbasis MN Assay die wahren antigen Beziehungen zwischen Viren zu quantifizieren. Im Vergleich zu anderen Plaque-Reduktions-Assays, betont Messung der Methode der ICP eines ganzen gut, die vollständige Abdeckung der Infektions Bevölkerung zu gewährleisten. Die Unabhängigkeit der Plaquebildung erweitert auch die Anwendung des Tests auf Viren, die in erster Linie unsichtbar kleine Plaques bilden kann, oder dass nur Single-Cell-Infektion zu verwalten. Daher ist der Assay der Lage mehr Viren und die Auswirkungen einer breiteren Palette von Antikörpern als HALLO untersuchen, und es hilft zu umfassender die antigenen Ähnlichkeiten oder Unterschiede zwischen Viren ¹² reflektieren. Wenn beispielsweise Oseltamivircarboxylat enthalten ist, wird der MN-Assay weniger von NA-abhängige Bindung, was die antigenen Unterschiede genauer. Während der Entwicklung des Assays, wurden große Anstrengungen unternommen, den Versuch Konsistenz, die Geschwindigkeit und die Erkennung zu verbessernEmpfindlichkeit, auch durch Eingabe Viren durch Titration quantifiziert, Bildgebung in hohem Durchsatz mit einem Flachbettscanner zu steuern, und eine benutzerfreundliche Datenverarbeitungsplattform implementiert. Die Ergebnisse haben mit konsistenten allgemein gewesen und denen der HALLO bestätigt. Bemerkenswerterweise zeigten die Ergebnisse auch antigenische Unterschiede zwischen Antigendrift Varianten der letzten Typ A und B-Impfstoff-Viren sowie antigen Veränderungen durch kultur ausgewählt oder sporadische Änderungen, wie beispielsweise die G155E Substitution in HA1 bestimmter A (H1N1) pdm09 Viren ^12.

Das Protokoll entsprach dem Virus Typ oder Subtyp bei der Auswahl von Zelllinien, die die stärkste Infektion gab, die stark das Abbildungssignal verstärkt. Experimentelle Variation wurde mit der Konstruktion von Duplikaten geglätteten, die mit der Anzahl der getesteten Antiseren ausgewogen. Ungewißheiten kann auch von der Bildqualität kommen, die im Wesentlichen durch die Abbildungsvorrichtung beeinflusst wird. Ein anständiger Farbflachbettscanner kann signinifikant den Bildkontrast zu verbessern und den Lärm zu reduzieren. Die Menge des eingesetzten Virus in der Neutralisation muß quantitativ aus dem entsprechenden Titration im Voraus bestimmt werden, während die Viren noch einen ähnlichen Zustand zu erhalten. Während der Neutralisation wird das Antiserum Antwort auf eine Infektion normalisiert gegen die Differenz zwischen dem Referenzvirus (VC) und der Hintergrundebene (CC). Genaue Messungen von VC und CC sind unerlässlich, um eine Neutralisierungs Experiment. Mehr Duplikate werden empfohlen (acht Duplikate wurden in den Repräsentative Ergebnisse verwendet). Schließlich wird die Software das Verständnis entscheidend für den Erfolg eines Experiments. Die Software wurde für die Routineviruscharakterisierung in der WHO-Zentrum für Influenza, Großbritannien für mehr als zwei Jahren getestet. Detaillierte Anleitungen für den Umgang mit verschiedenen Situationen in der Zusatz S1 vorgesehen.

Dieser MN-Assay eignet sich für Anwendungen, bei denen die Proben eine ext deckenremely großes Sichtfeld, sondern nur erfordern moderate Bildauflösung. Die niedrigen Kosten und einfache Installation machen das System leicht an die meisten Virologie Laboratorien zur Verfügung. Die Variation in Messungen derselben Probe betrug weniger als 3%, was die Unsicherheit während des Abtastens definiert ungefähr ¹¹ eingeführt. Eine solche Reproduzierbarkeit ist in vielen virologischen Untersuchungen ausreichend und kann weiter durch Mittelung der Bilder mehrerer Scans reduziert werden.

Abschließend zeigt diese Studie eine robuste MN-Assay, die routinemäßig in der Antigen-Studie verwendet werden kann und HALLO Daten in detaillierte Analysen der aktuell zirkulierenden Influenzaviren, insbesondere für die alle zwei Jahre Auswahl von Viren für die Aufnahme in den menschlichen Influenza-Impfstoffen zu unterstützen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
VGM	Sigma	D6429, P0781	500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb
PBS A			Nature pH Phosphatgepufferte Kochsalzlösung: NaCl 10  g, KCl 0,25  g, Na2HPO4 1.437 g, KH2PO4 0.25 g und Dist. Wasser 1 L.
Avicell	FMC	RC-581F	2,4 g in 100 ml destilliertem Wasser, gelöst durch Rühren auf einem Magnetrührer für 1 Std. Sterilisieren durch Autoklavieren.
2x DMEM	Gibco	21935-028
Trypsin	Sigma	T1426
Overlay (10 ml/Platte):			5 ml 2x DMEM, Trypsin 2  μ g/ml Endkonzentration, Avicell 5  ml
Triton X- 100e	Sigma	T8787	Permeabilisierungspuffer: 0,2 % in PBS A (v/v)
Tween 80	Sigma	P5188	Waschpuffer: 0,05 % Tween 80 in PBS A (v/v)
Pferdeserum	PAA Labs Ltd	B15-021	ELISA Puffer: 10 % in PBS A (v/v) + 0,1 % Tween 80
Maus MAb gegen Influenza Typ A	Biorad	MCA 400	1st Antikörper: 1:1.000 in ELISA Puffer
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) HRP Konjugat	Biorad	172-1011	2nd Antikörper: 1:1.000 in ELISA Puffer
True Blu Peroxidase	Substrat KPL	50-78-02	Substrat: True Blue +0,03 % H2O2g (1:1.000 von 30 % Lösung)
96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden	Costar	3596
8-Kanal-Steg-Unterlegscheibe und Verteiler	Sigma	M2656
Perfection Plate Scanner	Epson	V750 Pro	Die Imaging-Software kann kostenlos heruntergeladen werden von http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134& infoType=Downloads.
Betriebsumgebung der Software: LabVIEW	National Instruments Corporation	Window basierend auf NI Vision Builder	Version: LabVIEW2012 oder höher