Methodenartikel

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

DOI:

10.3791/54900

⸱

8. Januar 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cognitive Neurosciences, Radboudumc, 2Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University, 3Department of Human Genetics, Radboudumc, 4Department of Molecular Developmental Biology, Radboud University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir modifizieren und Umsetzung eines bereits veröffentlichten Protokoll beschreibt die schnelle, reproduzierbare und effiziente Differenzierung von humanen 12 pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in exzitatorischen kortikalen Neuronen induziert. Insbesondere ermöglicht unsere Modifikation zur Steuerung neuronaler Zelldichte und der Verwendung auf Mikroelektrodenarrays elektrophysiologischen Eigenschaften auf Netzwerkebene zu messen.

Zusammenfassung

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Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen abgeleitet induziert (hiPSCs) eine viel versprechende neue Werkzeug für neurologische Erkrankungen zu studieren. In den letzten zehn Jahren wurden viele Protokolle für hiPSCs in Neuronen differenzieren entwickelt. Jedoch sind diese Protokolle oft langsam mit hoher Variabilität, geringe Reproduzierbarkeit, und die geringe Effizienz. Darüber hinaus sind die mit diesen Protokollen erhalten Neuronen sind oft unreif und keine angemessene funktionelle Aktivität sowohl an den Einzelzellen-und Netzebenen, wenn die Neuronen für mehrere Monate kultiviert werden. Teilweise aufgrund dieser Einschränkungen sind die funktionellen Eigenschaften von hiPSC abgeleiteten neuronalen Netzwerke noch nicht gut charakterisiert. Hier passen wir einen kürzlich veröffentlichten Protokoll , das die Produktion von menschlichen Neuronen aus hiPSCs durch erzwungene Expression des Transkriptionsfaktors neurogenin-2 12 beschreibt. Dieses Protokoll schnelle wird (wodurch man reifen Neuronen innerhalb von 3 Wochen) und effizient, mit fast 100% Wirkungsgrad von TRANSDUCed Zellen (> 95% der DAPI-positive Zellen sind MAP2 positiv). Weiterhin ergibt das Protokoll eine homogene Population von exzitatorischen Neuronen, die die Untersuchung von Zelltyp-spezifischen Beiträge zu neurologischen Erkrankungen erlauben würden. Wir modifiziert das ursprüngliche Protokoll, das von stabil transduzierten hiPSC Zellen zu erzeugen, uns explizite Kontrolle über die Gesamtzahl der Neuronen geben. Diese Zellen werden dann verwendet, hiPSC abgeleiteten neuronalen Netzwerken auf Mikroelektrodenarrays zu erzeugen. Auf diese Weise kann die spontane elektrophysiologischen Aktivität von hiPSC abgeleiteten neuronalen Netzen gemessen und charakterisiert werden, während interexperimental Konsistenz in Bezug auf die Zelldichte zu halten. Das vorgestellte Protokoll ist breit anwendbar, insbesondere für mechanistische und pharmakologische Studien an humanen neuronalen Netzen.

Einleitung

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Die Entwicklung der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) Differenzierungsprotokolle induzierten menschlichen Neuronen in vitro zu erzeugen , ein leistungsfähiges neues Werkzeug für das Studium neurologischen Erkrankungen zur Verfügung gestellt hat. Bis vor kurzem wurde die Studie dieser Störungen durch den Mangel an Modellsystemen unter Verwendung von humanen Neuronen stark behindert. Obwohl Nagern verwendet werden können , neurologischen Störungen zu untersuchen, können die Ergebnisse solcher Studien nicht leicht auf den Menschen 1 übersetzt werden. Angesichts dieser Einschränkungen sind hiPSC abgeleiteten Neuronen eine vielversprechende Alternative Modell , das verwendet werden kann , zugrundeliegenden molekularen Mechanismen , neurologischen Erkrankungen aufzuklären und für in - vitro - Wirkstoff - Screening.

In den letzten zehn Jahren mehrere Protokolle zu konvertieren hiPSCs in Neuronen 2-8 entwickelt. Allerdings sind diese Protokolle immer noch in vielerlei Hinsicht beschränkt. Zunächst werden die Protokolle oft zeitraubend: Erzeugen von Neuronen mit ausreichender Reifung (dh SYNAPse - Bildung) und funktionelle Aktivität erfordert Monate Kultivierungsverfahren, die groß angelegte Studien schwierig 9 macht. Zusätzlich ist hiPSC-to-Neuron-Umwandlungswirkungsgrad niedrig ist. Protokolle ergeben häufig eine heterogene Population von Neuronen und damit erlauben keine Studien von spezifischen Untergruppen von neuronalen Zellen. Darüber hinaus sind die Protokolle nicht reproduzierbar, unterschiedliche Ergebnisse für unterschiedliche iPSC Linien 10,11 ergibt. Schließlich sind die Reifungsstufe und funktionellen Eigenschaften der resultierenden Neuronen auch variable 10.

Zur Bewältigung dieser Probleme, Zhang et al. (2013) 12 entwickelt ein Protokoll , das schnell und reproduzierbar menschlichen Neuronen aus hiPSCs erzeugt durch den Transkriptionsfaktor Neurogenin-2 überexprimieren. Wie von den Autoren berichtet, tritt Differenzierung relativ schnell (nur 2 - 3 Wochen nach der Expression von Neurogenin-2 induziert), ist das Protokoll reproduzierbaren (neuronale Eigenschaften sind unabhängig von den starting hiPSC Linie) und die hiPSC-to-neuron Umwandlung ist sehr leistungsfähig (fast 100%). Die Population von Neuronen erzeugt mit ihren Protokoll homogen (ähnlich der oberen Schicht kortikalen Neuronen), so dass die Untersuchung von Zelltyp-spezifischen Beiträge zur neuronalen Störungen. Darüber hinaus ihre hiPSC abgeleiteten Neuronen zeigten reifen Eigenschaften (zB auf die Fähigkeit , Synapsen und robuste funktionelle Aktivität bilden) nach nur 20 d.

Charakterisieren der elektrophysiologischen Eigenschaften von hiPSC abgeleiteten Neuronen auf der Netzebene ist eine wichtige Voraussetzung, bevor hiPSC Technologie kann für die Untersuchung von menschlichen Krankheiten genutzt werden. Aus diesem Grund haben sich viele Forschungsgruppen vor kurzem begonnen Stamm-Zellen abgeleiteten Neuronen auf der Netzebene unter Verwendung von Mikroelektroden - Array (MEA) Geräte (Multichannel Systems, Reutlingen, Deutschland) 13-16 zu untersuchen. Die Elektroden einer MEA in einem Substrat eingebettet ist, auf dem neuronalen Zellen kultiviert werden können.MEAs können die elektrophysiologischen Eigenschaften von neuronalen Netzwerken und der in vitro Entwicklung ihrer Aktivität zu erforschen verwendet werden. Derzeit sind MEAs nur in Verbindung mit Differenzierungsprotokollen verwendet, die mehrere Monate dauern, reifen Netzwerke zu erhalten. Daher sollte MEAs mit einer schnelleren Differenzierung Protokoll Kombination der Verwendung dieser Technologie in großen Studien von neurologischen Erkrankungen erleichtern.

Hier stellen wir eine Modifikation der Zhang et al. (2013) 12 Protokoll und passen sie für den Einsatz auf MEAs. Insbesondere anstatt auf akuter lentiviralen Transduktion angewiesen, wir geschaffen anstelle hiPSC Linien, stabil rtTA / Ngn2 vor Differenzierung zu induzieren. Wir haben dies vor allem reproduzierbare Kontrolle über die neuronale Zelldichte zu haben, da die neuronale Zelldichte kritisch für die neuronale Netzwerkbildung ist, und für einen guten Kontakt zwischen den Neuronen und den Elektroden der MEA 17,18. Although die Zhang et al. Protokoll ist sehr effizient im Hinblick auf Umwandlung von transduzierten hiPSCs ist es von Natur aus variabel in Bezug auf die endgültige Ausbeute von Neuronen aus der Anzahl der hiPSCs zunächst vernickelt (Abbildung 2E in Zhang et al sehen.) 12. Mit einer stabilen Linie, beseitigen wir viele Fragen Variabilität verursachen, wie lentivirale Toxizität und Infektionseffizienz. Wir optimiert dann die Parameter , die zuverlässig hiPSC abgeleitete neuronale Netze auf MEAs produzieren, Netzwerk - Reifung zu erhalten (zB synchrone Ereignisse eine Mehrheit der Kanäle beteiligt) von der dritten Woche. Diese schnelle und zuverlässige Protokoll sollte direkte Vergleiche zwischen den Neuronen aus verschiedenen (dh patientenspezifische) hiPSC Linien sowie bieten robuste Konsistenz für pharmakologische Studien abgeleitet ermöglichen.

Protokoll

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Alle Versuche an Tieren wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung des Animal Care Committee, Radboud University Medical Center, Niederlande, (: 77073 RU-DEC-2011-021, Protokollnummer) durchgeführt.

1. Glia Zellisolierung und Kultur

HINWEIS: Die hier vorgestellten Protokoll über die Arbeit von McCarthy basiert und de Vellis 19 und ein sehr ähnliches detailliertes Protokoll für Astrozyten Maus zur Verfügung steht 20. Um Primärkulturen von kortikalen Astrozyten aus embryonalen (E18) Rattenhirnen erzeugen, eine schwangere Ratte muss geopfert werden, müssen die Embryonen aus der Gebärmutter, geerntet werden, und die Gehirne müssen aus den Embryonen isoliert werden. Um eine T75-Flasche füllen, müssen die Rinden von 2 embryonalen Gehirn kombiniert werden. Als Alternative können im Handel erhältlich gereinigt und gefrorenen Astrozyten erworben werden.

  1. Bereiten Sie die T75 Kulturflasche
    1. Verdünnte Poly-D-Lysine (PDL) insterile, Reinstwasser bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / mL. 5 ml der verdünnten PDL an die T75-Kulturkolben. Swish um sanft die gesamte Wachstumsoberfläche zu benetzen. Der Kolben wird in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator für 3 h.
    2. Saugen Sie das PDL aus dem Kolben. Spülen Sie die Flasche 3x mit 5 ml sterilem Wasser ungebundenen PDL zu entfernen. Absaugen das Wasser vollständig. Lassen Sie den Kolben eine laminare Strömung Abzug trocknen oder sofort verwendet.
  2. Dissection der Rinden
    1. Vorbereitung 50 mL dissection medium: Lebovitz des L-15-Medium mit 2% (v / v) B-27 Supplement. Halten Sie sich auf dem Eis.
    2. Anesthetize die Ratte tief mit Isofluran in einer Induktionskammer (kleine Plexiglas-Box), bis die Atmung aufhört (~ 5 bis 8 min). Entfernen Ratte aus der Induktionskammer und unmittelbar durch Genickbruch getötet.
    3. Sprühen Sie den Bauch der Ratte mit 70% EtOH und wischen Sie den Überschuss entfernt. Expose und die Gebärmutter aus dem Damm per Kaiser Abschnit entfernenauf eine Schere 21 verwendet wird .
    4. Schneiden Sie einzelne Embryonen aus ihren Fruchtblasen mit einer Schere, übertragen in eine sterile Petrischale mit kaltem Dissektion Medium gefüllt und auf Eis halten.
    5. Transfer-Embryonen wieder an eine neue, sterile 6 cm Petrischale mit kaltem Dissektion Medium gefüllt. Extrahieren Sie Gehirne von den Embryonen unter einem Stereomikroskop. Um das Gehirn aussetzen, schälen die Haut sanft und Schädel mit einer Pinzette entfernt. Schaufel vorsichtig das gesamte Gehirn aus und übertragen auf eine 35 mm Petrischale mit frischem, kaltem Dissektion Medium.
      ANMERKUNG: Vollständige Gehirne von Embryonen seziert ohne Verlust zelluläre Lebensfähigkeit für viele Stunden in Dissektion Medium auf Eis gelagert werden.
    6. Trennen Sie die beiden Hemisphären jedes Gehirn, indem sie mit feinen bestückte Feder Schere oder einem Skalpell durch die Mittellinie zu schneiden. abstreifen vorsichtig die Meningen mit geraden feinen bestückte Zange.
      HINWEIS: Es ist sehr wichtig , die Meningen vollständig zu entfernen. thverhindert ist Fibroblast Kontamination der Astrozyten Kultur. Fibroblasten werden Dividieren schnell teilenden Zellen und wird schließlich die anderen Zellen verdrängen.
    7. Entfernen Sie die Mittelhirns / Striatum und den Riechkolben mit Feder Schere oder einem Skalpell. Stellen Sie außerdem sicher, dass der Hippocampus (C-förmige Struktur, die in Bezug auf die Rinde perimedian und Schwanz ist) zu entfernen mit Feder Schere oder einem Skalpell. Sammeln Sie die kortikale Hemisphären in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt mit 5 ml Dissektion Medium. Halten Sie sich auf dem Eis.
  3. Die Dissoziation der Rinden
    1. Bereiten 2 mL Ca 2+ / Mg 2+ -freier Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 0,25% Trypsin (Dissoziation Medium). Vorbereitung 50 ml Hoch-glucose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 15% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin (Kulturmedium) und Filter sterilisieren.
    2. Lassen Sie das Gewebe auf den Boden des Zentrifugenröhrchens absetzen. vorsichtig wiePirat so viel von der Dissektion Medium wie möglich von über dem Gewebe. Waschen des Gewebes mit 5 mL Ca 2+ / Mg 2+ -freiem HBSS (ohne Trypsin) und ermöglichen es dem Gewebe am Boden des Röhrchens absetzen.
    3. aspirieren vorsichtig die HBSS. 2 mL Dissoziation Medium und Flick das Rohr sanft um das Enzym zu mischen um das Gewebe. Inkubieren in einem 37 ° C Wasserbad für 5-10 min. Flick das Rohr ein paar Mal während der Inkubation des Gewebes zu bewegen.
    4. Unmittelbar verreiben das Gewebe eine 1000 ul Pipettenspitze. Stellen Sie das Pipettiergerät Volumen auf etwa 800 & mgr; l. zwangsweise auf die Seite des Rohres, direkt über die Fluidleitung anzusaugen, die Stücke und auszuwerfen. Allerdings versuchen Blasen oder Schäumen zu minimieren. Wiederholen, bis das Gewebe ausreichend distanzierte, etwa 15 - 20-fach. 8 ml Kulturmedium, um das Trypsin zu inaktivieren. Vorsichtig mischen durch das Rohr mehrmals umgekehrt wird.
    5. Übergeben Sie die Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m Zellsieb auf einem 50 m platziertL-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie das 15 ml-Röhrchen mit Kulturmedium und filtern das Medium durch die Zellsieb das Medium in der 50-ml-Röhrchen mit der Zellsuspension zu sammeln. Spülen Sie die Zelle Sieb ein paar Mal mit Kulturmedium. 25 ml - nach dem Spülen sollte das Endvolumen etwa 20 sein.
    6. Pelletieren Sie die Zellen bei 200 · g für 10 min. Sorgfältig absaugen so viel Medium wie möglich, ohne das Zellpellet zu berühren. Resuspendieren der Zellen in 1 ml Kulturmedium mit einer 1000 & mgr; l-Pipette. In 11 ml vorgewärmtem Kulturmedium und vorsichtig mischen (zu verhindern, dass Blasen) eine 10 ml Pipette.
    7. Spülen Sie die PDL-beschichteten T75-Kolben einmal mit 5 ml Kulturmedium. Saugen Sie das Medium und Transfer in den Kolben der Zellsuspension. Alle Zellen in der Suspension werden überzogen, und wir finden es im allgemeinen nicht notwendig, sie zu zählen, da Astrozyten nicht von anderen Zellen in der Suspension zu unterscheiden. Der Kolben wird in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 foder zwei Tage.
  4. Erweiterung und Wartung der Astrozyten
    1. Ersetzen Sie das gesamte Medium zum ersten Mal 2 d nach der ersten Beschichtung. Ersetzen Sie das gesamte Medium danach alle 3 d. Immer vorwärmen das frische Medium auf 37 ° C vor der Zugabe zu den Zellen.
      HINWEIS: Die Astrozyten erfordern 7 bis 10 d etwa 90% Konfluenz zu erreichen (die Astrozyten erscheinen als eine dicht gepackte tessellated einschichtigen, mit Mikroglia und Oligodendrozyten oben liegende und miteinander vermischt).
    2. Wenn die Astrozyten etwa 90% Konfluenz erreichen, schütteln Sie die Flasche um die kontaminierenden Gliazellen zu entfernen:
      1. Entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator und ziehen Sie die Kappe (Phenol) oder der Anschlussabdeckung (gefiltert). Um Mikroglia, schütteln Sie die Flasche auf einem Orbitalplattform bei 180 Umdrehungen pro Minute für 1 h zu entfernen. Saugen Sie das Medium. Spülen Sie einmal mit 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium, absaugen und ersetzen mit 12 ml Kulturmedium.
      2. Zu entfernendie Oligodendrozyten, kehren die Kolben auf der Orbitalplattform und Schütteln bei 250 rpm, 37 ° C für mindestens 7 h, aber vorzugsweise O / N.
      3. Saugen Sie das Medium. Spülen Sie einmal mit 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium, absaugen und ersetzen mit 12 ml Kulturmedium. Bringen Sie den Kolben in den Inkubator.
      4. Wenn 100% konfluent, spalten die Astrozyten mit Standardverfahren in einem Verhältnis von 1: 3 bis 1: 2 mit 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Ein T75 - Kolben bei 100% Konfluenz typischerweise etwa 4,0 x 10 6 Zellen in insgesamt ergeben. Unter diesem Zeitplan können die Kulturen der Regel pro Woche aufgeteilt einmal werden.
        HINWEIS: Wenn die Astrozyten Konfluenz erreicht haben , können sie geerntet und für hiPSC Differenzierung verwendet werden , wie unten in Protokoll Schritt 3.4 beschrieben. Die Astrozyten kann ohne nennenswerten Verlust der Lebensfähigkeit mindestens einmal aufgeteilt werden. Sie können für bis zu 2 Monate in Kultur gehalten werden. Aus Erfahrung primären Progr embryonalen Tag 18 Ratte Astrozytenwerden essively terminal differenziert und / oder verlieren Lebensfähigkeit nach wiederholter Spaltung. Obwohl es möglich ist, die Astrozyten für die zukünftige Verwendung einzufrieren, bevorzugen wir die Astrozyten aus frischen embryonalen Gehirn zu isolieren, wenn erforderlich.

2. Erzeugung von rtTA / Ngn2 -positiver hiPSCs

HINWEIS: Die hiPSCs für unsere Experimente wurden verwendet , um in-house durch lentivirale Transduktion von humanen Fibroblasten erzeugt mit der Neuprogrammierung cMYC Faktoren SOX2, OCT4 und KLF4.

HINWEIS: Für die Erzeugung von rtTA / Ngn2 -positiven hiPSCs werden lentiviralen Vektoren verwendet , um in stabiler Weise die Transgene in das Genom der hiPSCs integrieren. Das Protokoll für die Herstellung der lentivirus wurde zuvor 22 veröffentlicht. Die Einzelheiten der lentiviralen Verpackungsvektoren, die die rtTA und Ngn2 Lentivirus - Partikel verwendet werden , herzustellen , sind in der vorgesehenen Tabelle der Materialien / Ausrüstung. Der Transfervektor für die rtTA Lentiviren verwendet wird , ist pLVX-EF1α- (Tet-On-Advanced) -IRES-G418 (R); dh dieser Vektor codiert ein Tet-On Erweiterte Transaktivator unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors EF1 & agr; und verleiht Resistenz gegenüber dem Antibiotikum G418. Der Transfervektor für die Ngn2 Lentivirus verwendete pLVX- (TRE-thight) - (Maus) Ngn2-PGK-Puromycin (R); dh dieser Vektor codiert das Gen für murine Neurogenin-2 unter der Kontrolle eines Tet-gesteuerten Promotors und des Puromycin - Resistenz - Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors PGK. Somit kann durch diese beiden Transfervektoren verwendet wird, kann eine hiPSC Linie für die geschaffen werden, die die Expression von Maus-neurogenin-2 kann durch Ergänzung des Mediums mit Doxycyclin induziert werden. Für die Transduktion der hiPSCs, der Überstand mit den Lentivirus - Partikel verwendet wird (bezeichnet als "Lentivirus Suspension 'in den Rest des Textes), dh without Konzentration der Partikel Ultrazentrifugation verwendet wird.

  1. Platte , die die hiPSCs (Tag 1)
    HINWEIS: Die Volumina , die in diesem Protokoll genannt werden annehmen , daß die hiPSCs in einer 6 - Well - Platte kultiviert werden , und daß die Zellen von einer gut geerntet. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Zellen anschließend in 12 Vertiefungen einer 12-Well-Platte ausplattiert.
    1. Herstellung von 10 ml kaltem DMEM / F12 mit 1% (v / v) Basalmembranmatrix (BMM) verdünnt BMM zu erhalten. In 800 & mgr; l verdünnt BMM pro Vertiefung einer 12-Well-Platte. Mindestens 1 h in einem befeuchteten Inkubator 37 ° C inkubieren mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Vor der Verwendung Die Platte für 1 h bei RT.
    2. Warm 15 ml ätherisches 8 (E8) -Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin, 9 ml DMEM / F12 und 1 ml Zellentfernungslösung (CDS) auf Raumtemperatur. Ergänzen Sie die E8-Medium mit Rho-assoziierten Protein-Kinase (ROCK) -Inhibitor.
    3. Saugen Sie das verbrauchte Medium der hiPSCs eind 1 mL CDS auf die hiPSCs. Inkubieren von 3 bis 5 min in einer befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Prüfen unter dem Mikroskop, ob die Zellen voneinander Lösen werden.
    4. In 2 ml DMEM / F12 in den Brunnen, zu suspendieren die Zellen vorsichtig mit einem 1000 ul Pipette und übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml-Röhrchen. 7 ml DMEM / F12 zu der Zellsuspension. Dreh die Zellen bei 200 · g für 5 min.
    5. Den Überstand aspirieren und 2 mL des E8-Medium hergestellt. Besorgen Sie sich eine Zellsuspension, in der die hiPSCs gelöst sind (bilden keine Zellklumpen) durch die Spitze eines 1000 ul Pipette gegen die Seite des 15-ml-Röhrchen setzen und Resuspendieren der sanft Zellen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen gelöst sind.
    6. Bestimmen der Anzahl von Zellen (Zellen / ml) unter Verwendung eines Hämozytometers Kammer.
      HINWEIS: Eine 6 - Well - Platte gut bei 80-90% Konfluenz wird ergeben typischerweise 3,0 - 4,0 x 10 6 Zellen insgesamt.
    7. Aspirierendie BMM aus den Wells der 12-Well-Platte verdünnt. Verdünne die Zellen einer Zellsuspension von 3,0 x 10 4 Zellen / ml zu erhalten. Platte 1 ml der Zellsuspension pro Well der 12-Well-Platte. Legen Sie die 12 - Well - Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2.
  2. Transduzieren die iPS - Zellen mit rtTA und Ngn2 Lentiviren (Tag 2)
    1. Warm 12 mL E8-Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin auf Raumtemperatur. Ergänzung des E8-Medium mit ROCK-Inhibitor und Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / mL auf die E8 Medium.
    2. Auftauen Aliquots mit Lentiviren Suspension. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / mL auf die Lentivirus Suspension. Saugen Sie das verbrauchte Medium und fügen Sie 1 ml der vorbereiteten E8 Medium zu jeder Vertiefung.
    3. Führen Sie die Transduktion mit unterschiedlichen Mengen des rtTA - und Ngn2 -lentivirus Suspensionen. Zum Beispiel transduce die hiPSCs durch Zugabe von 100 & mgr; l sowohl der rtTA -lentivirus und Ngn2 -lentivirus Suspension in eine Vertiefung der 12 - Well - Platte. Für die anderen Brunnen, arbeiten mit 200 & mgr; l, 300 & mgr; l, 400 & mgr; l und 500 & mgr; l Lentiviren Suspension anstelle von 100 ul. Die hiPSCs von zwei Vertiefungen der 12-Well-Platte sollte nicht transduziert werden; sie werden als Kontrollen bei der Auswahl dienen.
      HINWEIS: Die Transduktionen werden vorzugsweise doppelt durchgeführt, so dass die Transduktionseffizienz genauer nach dem Beginn der Auswahl geschätzt werden kann (Protokollschritt 2.2.4 sehen). Die Menge der lentivirus Suspension, die effizient erforderlich ist, die Mehrheit der hiPSCs zu transduzieren ist abhängig von der Titer der lentivirus Suspension und der hiPSC Linie, die verwendet wird. In dieser Studie verwenden wir in der Regel 100 bis 500 & mgr; l von Lentiviren Suspension auf die hiPSCs transduzieren.
    4. Legen Sie die 12-Well-Platte in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO2 für 6 h. Vor dem Ende der 6 h Inkubationszeit, warm 12 mL E8-Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin und 12 ml Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) auf RT. Ergänzen Sie die E8-Medium mit ROCK-Inhibitor.
    5. Saugen Sie das E8 Medium ausgegeben. Waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DPBS. 1 ml der vorbereiteten E8 Medium zu jeder Vertiefung. Legen Sie die 12 - Well - Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2.
  3. Aktualisieren Sie die E8 - Medium (Tag 3)
    1. Warm 12 mL E8-Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin auf RT. Saugen Sie das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen der 12-Well-Platte und 1 mL der vorbereiteten E8 Medium zu jeder Vertiefung. Legen Sie die 12 - Well - Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2.
  4. Führen Sie die Auswahl mit Puromycin und G418 (Tag 4 - 8)
    HINWEIS: In Abhängigkeit von der Zellteilungsrate des Hüftgelenks80% Konfluenz während der Auswahlperiode, an welchem ​​Punkt die Kulturen müssen aufgeteilt werden - SC Linie und die Effizienz der Transduktion lentiviralen können die Zellen 70 erreichen. Weil der Zeitpunkt der Spaltung nicht im Voraus vorhergesagt werden kann, wird es nicht in das Protokoll genannt werden. Anstatt jedoch die E8 Medium mit den angegebenen Konzentrationen von Puromycin und G418 ergänzt Auffrischung kann man die hiPSC Kultur als normale hiPSC Kultur aufgeteilt (einschließlich Plattieren der Zellen auf Vitronectin beschichteten Platten). Die einzige Ausnahme ist, dass die E8 Medium sollte mit den genannten Konzentrationen der Antibiotika ergänzt werden, um die Auswahl fortzusetzen.
    1. Warm 12 mL E8-Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin auf Raumtemperatur. In Puromycin und G418 zur Auswahl; unterschiedlichen Mengen der Antibiotika während der Selektionsperiode (Tabelle 1) zugegeben.
    2. Schätzen die Effizienz der Transduktion durch den Prozentsatz der G418- Abschätzen und Puromycin-resistenten Zellen. Um den Prozentsatz der resistenten Zellen abschätzen zu können, schätzen den Anteil der toten Zellen (nicht-resistenten Zellen) für die verschiedenen Bedingungen (die Kulturen transduziert mit den verschiedenen Mengen an Lentivirus-Suspension) und für die nicht-transduzierten Zellen (die Zellen, die als Auswahlsteuerung dienen). Berechnen Sie den Prozentsatz der resistenten Zellen als [100% - (Anteil der toten Zellen)].
      HINWEIS: Wenn die Transduktionen mit den verschiedenen Mengen von Lentiviren Suspension doppelt durchgeführt wurden, kann die Transduktionseffizienz genauer geschätzt werden. Der Zustand mit den nicht-transduzierten Zellen dient als eine Auswahlsteuerung; Der prozentuale Anteil der toten Zellen für die Kulturen mit den verschiedenen Mengen von Lentiviren Suspension niedriger sein sollte, transduziert. Der geschätzte Anteil der resistenten Zellen wird verwendet, um die hiPSCs zu wählen, die für beide Transgene wahrscheinlich positiv sind. Im Allgemeinen wählen wir die hiPSCs aus der Transduktion Zustand waren> 90% der Zelles überleben die 5 d Selektionsperiode.
    3. Anzusaugen, das verbrauchte Medium der hiPSCs und 1 mL des hergestellten E8 Medium in die Vertiefungen. Legen Sie die 12 - Well - Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2.
Endkonzentration von G418 Endkonzentration von Puromycin
Tag 4 250 & mgr; g / mL 2 & mgr; g / mL
Tag 5 250 & mgr; g / mL 2 & mgr; g / mL
Tag 6 250 & mgr; g / mL 1 & mgr; g / mL
Tag 7 250 & mgr; g / mL 1 & mgr; g / mL
Tag 8 250 & mgr; g / mL 1 & mgr; g / mL

Tabelle 1: Die Konzentrationen von Antibiotika während der Auswahlperiode. Konzentrationen des Puromycin und G418 während der 5 d der Selektionsperiode.

  1. Stoppen Sie die Auswahl und starten regelmäßige Kultivierung (Tag 9 und höher)
    1. Nach 5 d Selektionsperiode, die Kultur rtTA / Ngn2 -positiven hiPSCs normal hiPSCs, mit der Ausnahme , daß das E8 Medium der Zellen mit G418 in einer Endkonzentration von 50 ug / ml und mit Puromycin zu einer Endkonzentration von ergänzt 0,5 & mgr; g / mL.
      HINWEIS: Die Zellen können nun eingefroren werden (nach Standardprotokollen für die Kryokonservierung von Zellen) als Sicherung dienen. Dies ist ein wichtiger Schritt für die Reproduzierbarkeit des Differenzierungsprotokoll, weil sie die Verwendung der gleichen Charge von rtTA / Ngn2 -positiven hiPSCs für viele zukünftige Differenzierungsexperimente ermöglicht.

3. Differenzierung von rtTA / Ngn2 -positiver hiPSCs zu Neurons auf 6-wellMEAs und Glasplättchen

HINWEIS: In diesem Protokoll werden die Details zur Differenzierung rtTA / Ngn2 -positiver hiPSCs auf zwei verschiedenen Substraten, dh 6-Well - MEAs (Geräte , bestehend aus sechs unabhängigen Vertiefungen mit 9 - Aufnahme und ein Referenz eingebettet Mikroelektroden pro Vertiefung) und Glasplättchen in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Die Protokolle können jedoch leicht für größere Substrate angepaßt werden (beispielsweise für die Vertiefungen von 12- oder 6-Well - Platten), indem man die genannten Werte Scaling - up nach der Oberfläche.

  1. Bereiten Sie die MEAs oder Glasplättchen (Tag 0 und Tag 1)
    1. Am Tag vor dem Beginn der Differenzierung, sterilisieren die MEAs gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
    2. Verdünne das Adhäsionsprotein Poly-L-Ornithin (PLO) in sterilem Reinstwasser auf eine Endkonzentration 50 ug / mL. Bestreichen Sie die aktive Elektrodenfläche von 6-Well-MEAs durch eine 100 & mgr; l platzierenin jeder Vertiefung fallen der verdünnten PLO. Legen Sie die Deckgläser in den Vertiefungen der 24-Well-Platte mit einer sterilen Pinzette. Hinzufügen 800 & mgr; l der verdünnten PLO in jeder Vertiefung. Verhindern Sie die Deckgläser Aufschwimmen von ihnen nach unten mit dem 1000 ul Pipettenspitze schieben.
    3. Inkubieren Sie die 6-Well - MEAs und 24-Well - Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Am nächsten Tag absaugen verdünnt PLO. Waschen Sie die Glasflächen der 6-Well-MEAs und die Deckgläser zweimal mit sterilem Reinstwasser.
    4. Verdünnte Laminin in kaltem DMEM / F12 bis zu einer Endkonzentration von 20 ug / ml (für die 6-well MEAs) und 10 & mgr; g / ml (für die Deckgläser). Unmittelbar coat die aktive Elektrodenfläche der 6-well MEAs durch eine 100 & mgr; l Tropfen in jede Vertiefung setzt. In ähnlicher Weise werden 400 & mgr; l des verdünnten Laminin in jeder Vertiefung der 24-Well-Platte zu beschichten die Deckgläser. Verhindern Sie die Deckgläser Aufschwimmen von ihnen nach unten mit dem 1000 ul Pipettenspitze schieben.
    5. Inkubieren der 6-well MEAs und 24 - Well - Platte in einer befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 für mindestens 2 h.
  2. Platte , die die hiPSCs (Tag 1)
    HINWEIS: Die Volumina , die in den Schritten 3.2.1 erwähnt - 3.2.4 annehmen , daß die rtTA / Ngn2 -positiven hiPSCs in einer 6-Well Platte kultiviert werden und daß die Zellen von einer gut geerntet werden. Die Volumina, die für die Plattierung der Zellen auf den 6-well MEAs und / oder die Deckgläser, hängt von der Anzahl der 6-well MEAs und / oder die Anzahl der Deckplättchen erforderlich sind, die in dem Experiment verwendet werden; die Zahlen in Schritten angegeben 3.2.6 - 3.2.8 erlauben unterschiedliche Experiment Größen skalieren.
    1. Warmen DMEM / F12, CDS und E8-Medium mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin zu R / T. In Doxycyclin zu einer Endkonzentration von 4 ug / ml und ROCK-Inhibitor zur E8 Medium.
    2. Saugen Sie das verbrauchte Medium der rtTA / Ngn2 -positiver hiPSCs und fügen 1 mL CDS auf die hiPSCs. Inkubieren von 3 bis 5 min in einer befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2. Prüfen unter dem Mikroskop, ob die Zellen voneinander Lösen werden.
    3. In 2 ml DMEM / F12 in den Brunnen, zu suspendieren die Zellen vorsichtig mit einem 1000 ul Pipette und übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml-Röhrchen. 7 ml DMEM / F12 zu der Zellsuspension. Dreh die Zellen bei 200 · g für 5 min.
    4. Den Überstand aspirieren und 2 mL des E8-Medium hergestellt. Distanzieren die hiPSCs durch die Spitze eines 1000 ul Pipette gegen die Seite des 15-ml-Röhrchen setzen und Resuspendieren der sanft Zellen. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen gelöst sind.
    5. Bestimmen der Anzahl von Zellen (Zellen / ml) unter Verwendung eines Hämozytometers Kammer.
      HINWEIS: Eine 6-Well - Platte gut bei 80-90% Konfluenz wird ergeben typischerweise 3,0 - 4,0 x 10 6 Zellen insgesamt.
    6. Saugen Sie das verdünnte Laminin. Für die 6-Well-MEAs, verdünnte die Zellen eine ce zu erhaltenll Suspension von 7,5 x 10 5 Zellen / mL. Platte, die Zellen durch einen Tropfen von 100 & mgr; l der Zellsuspension auf der aktiven Elektrodenfläche in jeder Vertiefung der 6-Well-MEAs Zugabe. Für die Deckgläser, verdünne die Zellen einer Zellsuspension von 4,0 x 10 4 Zellen / ml erhalten. Platte die Zellen durch Zugabe von 500 ul der Zellsuspension in die Vertiefungen der Platte mit 24 Vertiefungen.
      HINWEIS: Der letzte auf den MEAs Zelldichte höher als auf den Deckgläsern (1A und B). Wir fanden heraus, dass diese hohe Zelldichte für die ordnungsgemäße Erfassung der Netzwerkaktivität erforderlich war. In dem Protokoll werden die Zahlen vorgesehen, die für die Assays optimal erwiesen.
    7. Platzieren Sie die 6-well MEAs und 24 - Well - Platte in einer befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 für 2 h (MEAs) oder O / N (24 - Well - Platte).
    8. Nach 2 h, fügen Sie vorsichtig 500 ul der hergestellten E8 Medium zu jeder Vertiefung der 6-Well-MEAs. Legen Sie die 6-wirll MEAs O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2.
  3. Ändern Sie das Medium (Tag 2)
    1. DMEM / F12 mit 1% (v / v) N-2 Supplement, 1% (v / v) nicht-essentielle Aminosäuren und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin Am nächsten Tag vorzubereiten. Hinzufügen humanes rekombinantes Neurotrophin-3 (NT-3) bis zu einer Endkonzentration von 10 ng / ml, humanes rekombinantes brain-derived neurotrophic factor (BDNF) bis zu einer Endkonzentration von 10 ng / ml, und Doxycyclin in einer Endkonzentration von 4 & mgr; g / mL. Wärmen Sie das Medium auf 37 ° C.
    2. Hinzufügen Laminin auf eine Endkonzentration von 0,2 & mgr; g / mL zu dem Medium. Filtern des resultierenden Mediums. Saugen Sie das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen der 6-Well-MEAs und die 24-Well-Platte und ersetzen Sie es mit dem vorbereiteten Medium. Inkubieren Sie die 6-Well - MEAs und 24-Well - Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2.
  4. In Ratte Astrozyten (Tag 3)
    Hinweis: Die Volumina , die in diesem Protokoll erwähnt werden , davon ausgehen , dass die Ratte Astrozyten in T75 Kulturflaschen kultiviert werden. Es ist entscheidend, dass die Ratten-Astrozyten, die zu den Kulturen gegeben werden, sind von guter Qualität. Wir verwenden zwei Kriterien zu prüfen, ob die Ratte Astrozyten von guter Qualität sind. Erstens sollte die Ratte Astrozyten Kultur der Lage sein, konfluent wachsen innerhalb von zehn Tagen nach der Isolierung von den Ratten embryonalen Gehirn. Zweitens, nachdem die Ratte astrocyte Kultur Aufspalten sollten die Ratten - Astrocyten Lage sein, eine konfluente, tessellated Monoschicht (1C) zu bilden. Wenn die Ratte Astrozyten Kultur diese beiden Kriterien nicht erfüllt, empfehlen wir diese Kultur nicht zur Differenzierung Experimente zu verwenden.
    1. Warm 0,05% Trypsin-EDTA auf RT. Warm die DPBS und DMEM / F12 mit 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin auf 37 ° C.
    2. Saugen Sie das verbrauchte Medium der Ratte Astrozyten Kultur. Waschen Sie die Kultur durch Zugabe von 5 ml DPBS und swish es um sanft.
    3. Aspirdie DPBS aß und mit 5 ml 0,05% Trypsin-EDTA. Swish die Trypsin-EDTA um sanft. Inkubieren in einer befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 für 5 - 10 min.
    4. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen abgelöst werden. Lösen Sie die letzten Zellen, die durch den Kolben ein paar Mal zu treffen.
    5. 5 ml DMEM / F12 in den Kolben. Verreiben die Zellen sanft im Inneren des Kolbens mit einer Pipette 10 ml. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 ml-Röhrchen. Drehen Sie das Rohr bei 200 g für 8 min.
    6. Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Zellen in 1 ml DMEM / F12. Bestimmen der Anzahl von Zellen (Zellen / ml) unter Verwendung eines Hämozytometers Kammer.
    7. 7.5 x 10 4 Astrozyten pro Vertiefung der 6-Well - MEAs. In 2,0 x 10 4 Astrozyten pro Vertiefung der 24-Well - Platte. Inkubieren Sie die MEAs und die 24-Well - Platte O / N in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2.
  5. Ändern Sie das Medium (Tag 4)
    1. Bereiten Neurobasal-Medium mit 2% (v / v) B-27 Supplement, 1% (v / v) L-Alanyl-L-Glutamin und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin. Hinzufügen, NT-3 zu einer Endkonzentration von 10 ng / mL, BDNF auf eine Endkonzentration von 10 ng / ml, und Doxycyclin in einer Endkonzentration von 4 & mgr; g / mL. Zusätzlich Cytosin β-D-arabinofuranosid zu einer Konzentration von 2 uM hinzuzufügen.
      HINWEIS: Cytosin β-D-arabinofuranoside wird zu dem Medium gegeben Astrozytenproliferation zu hemmen und die verbleibenden hiPSCs zu töten, die nicht in die Neuronen zu differenzieren.
    2. Filtern des Mediums und erwärme auf 37 ° C. Saugen Sie das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen der 6-Well-MEAs und die 24-Well-Platte und ersetzen Sie es mit dem vorbereiteten Medium. Pflegen Sie die 6-Well - MEAs und die 24-Well - Platte in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2.
  6. Aktualisieren Sie das Medium (Tag 6 - 28)
    HINWEIS: Beim Start von Tag 6, aktualisieren Sie die Hälftealle zwei Tage des Mediums. Von Tag 10 an wird das Medium mit FBS die Astrozyten Lebensfähigkeit zu unterstützen.
    1. Bereiten Neurobasal-Medium mit 2% (v / v) B-27 Supplement, 1% (v / v) L-Alanyl-L-Glutamin und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin. Hinzufügen, NT-3 zu einer Endkonzentration von 10 ng / mL, BDNF auf eine Endkonzentration von 10 ng / ml, und Doxycyclin in einer Endkonzentration von 4 & mgr; g / mL. Vom ersten Tag ab 10, ergänzen auch das Medium mit 2,5% (v / v) FBS. Filtern des resultierenden Mediums und erwärme auf 37 ° C.
    2. Entfernen Sie die Hälfte des verbrauchten Mediums aus den Vertiefungen der 6-Well-MEAs und der 24-Well-Platte mit einer 1000 ul Pipette und ersetzen Sie es mit dem vorbereiteten Medium. Pflegen Sie die 6-Well - MEAs und die 24-Well - Platte in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2.

4. Stellen Sie die neurophysiologische Profil von hiPSC abgeleiteten Neurone

HINWEIS: Zwei bis drei Wochen nach der inProduktion der Differenzierung können die hiPSC abgeleiteten Neuronen für verschiedene Downstream-Analysen verwendet werden. In diesem Abschnitt werden Beispiele für einige Downstream-Analysen gegeben, die durchgeführt werden können, die neurophysiologischen Profil der hiPSC abgeleiteten Neuronen zu etablieren.

  1. Charakterisieren Sie die neuronale Netzwerkaktivität unter Verwendung von MEAs
    1. Nehmen Sie 20 Minuten von elektrophysiologische Aktivität von hiPSC abgeleiteten Neuronen kultiviert auf MEAs. Während der Aufzeichnung, daß die Temperatur bei 37 ° C, und die Verdampfung und die pH - Änderungen des Mediums zu verhindern , indem eine konstante, langsame Strömung der befeuchteten Gas Aufpumpen (5% CO 2, 20% O 2, 75% N 2) auf die MEA .
    2. Nach 1200X Verstärkung (MEA 1060, MCS), probieren Sie das Signal bei 10 kHz die MCS Datenerfassungskarte. Analysieren Sie die Daten (Spike und Burst - Erkennung) unter Verwendung eines kundenspezifischen Software - Paket 23.
  2. Charakterisieren Sie die Einzelzellen - elektrophysiologische Aktivität
    1. Übertragen Sie die Deckgläser, die hiPSC abgeleiteten neuronalen Kulturen zu einem getauchten Feststufigen Aufnahmekammer in einem aufrechten Mikroskop enthält. Nehmen Sie 20 Minuten der spontanen Aktionspotential evozierten postsynaptischen Ströme (sEPSC) 24. Ermitteln Sie die synaptische Ereignis mit neurowissenschaftlichen Programm.
  3. Charakterisieren Sie die neuronale Morphologie und Synapsin Ausdruck
    1. Fix und färben die hiPSC abgeleiteten Neuronen für MAP2, Synapsin-1/2 und PSD-95 22, 24, 25. Quantifizierung die Anzahl der Synapsin-1/2 und PSD-95 puncta unter Verwendung von Bildanalysesoftware.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier haben wir erfolgreich ein modifiziertes Protokoll , bei dem hiPSCs differenziert werden direkt in kortikalen Neuronen durch Überexpression der Transkriptionsfaktor Neurogenin-2 12 und wir haben es für die Verwendung von MEAs angepasst. Dieser Ansatz ist schnell und effizient ermöglicht es uns, funktionelle Neuronen und Netzwerk-Aktivität bereits in der dritten Woche nach der Induktion der Differenzierung zu erhalten.

Während des Verlaufs des Differenzierungsprotokoll begannen die Zellen morphologisch Neurone zu ähneln: small Prozesse gebildet wurden und Neuronen gestartet miteinander (1A) zu verbinden. Wir haben eine neurophysiologische Profil der abgeleiteten Neuronen von einer gesunden Kontrolle hiPSC Linie, durch ihre neuronale Morphologie und synaptische Eigenschaften während der Entwicklung zu messen. hiPSC abgeleiteten Neuronen wurden gefärbt für MAP2 und Synapsin-1/2 an verschiedenen Tagen nach dem StartDifferenzierungs (2A). Die abgeleiteten Neuronen zeigen reife neuronale Morphologie bereits 3 Wochen nach der Induktion der Differenzierung. Die Anzahl der Synapsin-1/2 puncta (ein Maß für die Anzahl der Synapsen) basierte auf Synapsin-1 quantifiziert / 2 Immunzytochemie Anfärbungen. Die Anzahl der Synapsin-1/2 puncta Laufe der Zeit erhöht, was darauf hindeutet , dass das Niveau der neuronalen Konnektivitäts auch (2B) zunimmt. Die Anzahl der Synapsin-1/2 puncta 23 Tage nach der Induktion der Differenzierung war ähnlich in zwei unabhängigen IPS Leitungen (2C). Bei 23 DIV meisten synapsin1 / 2 puncta wurden nebeneinander auf PSD-95 puncta, die für funktionelle Synapsen (2D) anzeigt.

In Übereinstimmung mit den von Zhang et al beschriebenen Ergebnisse. Erwirtschafteten wir eine Bevölkerung von erregenden oberen Schicht kortikalen Neuronen, bestätigt durch pan-neuronalen und Subtyp-spezifischen kortikalen m arkers wie BRN2 und SATB2 (Schicht II / III). Wir nicht beobachten Neuronen , die für tiefe Schicht Neuronen CTIP2 (Schicht V) oder FOXP2 (Schicht VI) (Abbildung 2E und F) positiv waren

Um die elektrophysiologische Aktivität der hiPSC abgeleiteten Neuronen zu charakterisieren, verwendeten wir Ganzzellstrom und voltage clamp Aufnahmen, dh intrinsische Eigenschaften und erregenden Eingang auf diese Neuronen wurden während der Entwicklung gemessen. Die Neuronen konnten Aktionspotentiale bereits eine Woche nach der Differenzierung und der Prozentsatz der Spick - Zellen zu erzeugen , wurde im Laufe der Zeit zu erhöhen (Abbildung 2G und H). Darüber hinaus erhielt die Neuronen exzitatorischen synaptischen Eingangs bereits eine Woche nach der Induktion der Differenzierung: both Frequenz und Amplitude des exzitatorischen synaptischen Eingangs erhöht während der Entwicklung (2I - K).

nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Um besser zu verstehen , wie Single-Zell - Aktivität Netzwerk-Level - Funktionen zu bilden , kombiniert, ist es wichtig zu untersuchen , wie Neuronen im Konzert arbeiten In vitro neuronale Netze kultiviert auf MEAs. bilden einen wertvollen experimentellen Modell die neuronalen Dynamik für das Studium. aufgezeichnet Wir haben 20 min von elektro Netzwerk - Aktivität von Neuronen aus einer gesunden Kontrolle hiPSC Linie kultiviert abgeleitet auf 6-Well - MEAs (Abbildung 2 M). Nur wenige Wochen nach der Induktion der Differenzierung, die Neuronen die von gesunden Kontrolle hiPSCs funktionell aktive neuronale Netzwerke gebildet, die zeigen , spontane Ereignisse (0,62 ± 0,05 Spike / s; Abbildung 2 n). In diesem Stadium der Entwicklung (dh 16 d nach Beginn der Differenzierung) keine synchrone Ereignisse alle Kanäle beteiligt . der MEAs (Abbildung 2 O) erfasst werden erhöht die Höhe der Netzwerkaktivität während der Entwicklung: in der vierten Woche nach t er Induktion der Differenzierung, die neuronalen Netzwerke zeigten hohe spontane Aktivität (2,5 ± 0,1 Spike / s, Figur 2N) in alle Vertiefungen der Vorrichtung. Die Netzwerke auch synchron zeigten Netzwerk Bursts (4,1 ± 0,1 Burst / min, Abbildung 2 O) mit langer Dauer (2100 ± 500 ms).

figure-results-1
Abbildung 1: hiPSC Differenzierung in Neurone. A. Drei Zeitpunkte hiPSCs Differenzierung in Neuronen auf Deckgläsern. B. Beschichtung von hiPSCs auf MEAs. C. Astrozyten bei 100% Konfluenz in T75 - Kolben (beachten Sie, dass die Zellen eine tessellated einschichtigen bilden). Maßstabsbalken: 150 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figure-results-2
Abbildung 2. hiPSC abgeleiteten Neurone Charakterisierung. A. hiPSC abgeleiteten Neuronen wurden für MAP2 (grün) und Synapsin-1 gefärbt / 2 (rot) an verschiedenen Tagen nach Beginn der Differenzierung. Maßstabsbalken: 10 & mgr; m. B. Quantifizierung von Synapsin puncta in zwei unabhängigen Experimenten. In jedem Experiment mindestens 10-Zellen wurden analysiert. C. Quantifizierung von Synapsin puncta bei DIV23 in Neuronen aus zwei unabhängigen IPS Linien abgeleitet. D. hiPSC abgeleiteten Neuronen wurden für PSD-95 (grün) gefärbt und Synapsin-1/2 (rot) 23 Tage nach dem Beginn der Differenzierung. Synapsin puncta nebeneinander angeordnet sind, um PSD-95 puncta. E. hiPSC abgeleiteten Neuronen wurden für MAP2 (grün) und BRN2 (rot) oder SATB2 (rot) 23 d nach Beginn der Differenzierung gefärbt. F. Prozentsatz der MAP2 positiven Zellen,für angezeigt Marker positiv waren. G. Repräsentative Stromzangenaufnahmen , die Aktionspotentiale zeigen können so früh wie 7 d nach Beginn der Differenzierung erzeugt werden. H. Prozentsatz an Zellen an verschiedenen Tagen nach der Induktion der Differenzierung , die ein oder mehrere Aktionspotentiale zeigen. I. Repräsentative Spuren von exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) erhielt von hiPSC abgeleiteten Neuronen an verschiedenen Tagen nach der Differenzierung. J. Häufigkeit der exzitatorischen postsynaptischen Ströme während der Entwicklung. K. Amplitude von exzitatorischen postsynaptischen Ströme während der Entwicklung. L. Repräsentative Spuren von EPSC Aufnahmen ohne (Kontrolle) und mit CNQX (CNQX). M. Neurons , abgeleitet von einem hiPSC Linie wurden auf einer 6-Well - MEA und Netzwerkaktivität wird für hiPSC abgeleiteten neuronalen Netze 16 und 23 d nach der Induktion der Differenzierung dargestellt. Die Aktivität aufgezeichnet vonjede Vertiefung (Abtastrate von 10 kHz) mit einer anderen Farbe angezeigt wird (5 min 20 min des Aufnahme sind gezeigt). N. Feuerrate 16 und 23 d nach der Induktion der Differenzierung. O. Bursting Rate 16 und 23 d nach der Induktion der Differenzierung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Angesichts der Ergebnisse, die Qualität der resultierenden hiPSC abgeleiteten Neuronen kann durch eine neurophysiologischen Profil der Zellen beurteilt werden. Das heißt, drei bis vier Wochen nach dem Beginn der Differenzierung, der Morphologie, Synapsin-1/2-Expression und der Elektrophysiologie der Neuronen beurteilt werden. Zu diesem Zeitpunkt werden die hiPSC abgeleiteten Neuronen erwartet, dass eine neuronale artige Morphologie zu zeigen, MAP2, Synapsin / PSD-95 positiv, wenn die Durchführung Immuncytochemie zu sein, und zu exhibit spontane elektrophysiologische Aktivität (sowohl auf der Single-Cell-und Netzwerk-Ebene).

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier haben wir ein effizientes hiPSC-Differenzierung Protokoll veröffentlicht von Zhang et al umgesetzt. (2013) 12 , um die Netzwerkaktivität von hiPSC abgeleiteten neuronalen Netzen auf MEAs für die Messung. Wir passten das ursprüngliche Protokoll durch eine rtTA / Ngn2 -positiver hiPSC Linie zu schaffen , bevor die neuronale Differenzierung zu induzieren. Dieser zusätzliche Schritt ermöglicht es, die neuronale Zelldichte auf der MEA zu steuern. Die Kontrolle über die neuronale Dichte war eine wichtige Voraussetzung für das Protokoll zu MEAs Anpassung und für die Gewährleistung der Kohärenz. Auf der Oberseite der MEA - Elektroden 17,18 Um die Aktivität von neuronalen Netzwerken messen MEAs verwenden, müssen die Neuronen dichte Netzwerke direkt zu bilden. Dies erfordert notwendigerweise eine strenge Kontrolle über die Beschichtungs-Dichte der Neuronen. Die rtTA / Ngn2 -positiver hiPSC Linie ermöglicht die Steuerung von Neuronendichte , weil diese Taktik auf akute lentiviralen Transduktionen von hiPSCs verlässt sich nicht vor der Differenzierung;die rtTA / Ngn2 -positiver hiPSC Linie eliminiert somit fast jede Veränderung in der endgültigen Ertrag durch zum Beispiel lentiviralen Toxizität und variable Infektionseffizienz.

Ein weiterer kritischer Schritt des experimentellen Verfahrens ist die Anzahl der Ratten-Astrozyten, die mit den Unterscheidungs ​​hiPSCs cokultiviert werden. Astrozyten tragen aktiv zur Verfeinerung neuronale Schaltkreise zu entwickeln durch die Synapsenbildung zu steuern, Wartung und Beseitigung, von denen alle wichtigen Prozesse für die neuronale Funktion sind. Das Protokoll in diesem Papier ist sehr Astrozyten abhängig: zu voll ausgereift und funktionelle Synapsen bilden, die Neuronen benötigen Unterstützung von den Astrozyten. Wir erfahren, dass die Anzahl von Astrozyten der Anzahl der hiPSC abgeleiteten Neuronen in etwa gleich sein sollte, die Reifung der Neuronen und die Bildung von neuronalen Netzwerken aufweist spontane Aktivität zu unterstützen. Da unser Astrozyten Protokoll Ausbeuten Primärzelle culraturen mit einer begrenzten Lebensdauer, hat die Isolierung von Ratten-Astrocyten regelmäßig durchgeführt werden.

Unsere Anpassung des Protokolls von Zhang et al. (2013) 12 zur Verwendung mit MEA - Technologie wird wahrscheinlich deutlich verbessern unsere Fähigkeit , die Netzwerkaktivität von hiPSC abgeleitete Netzwerke zu studieren. Zuvor verwendete Protokolle für hiPSC abgeleitete neuronale Netze mit MEAs Studium verließ sich auf zeitraubende Differenzierung Verfahren 13-16. Das Protokoll von Zhang et al. (2013) bietet eine schnelle Alternative, und unsere Modifikation entfernt eine Quelle der Variabilität, die es nun möglich macht mit MEA-Technologie hiPSC abgeleiteten Neuronen in Kombination zu verwenden, vor allem im Hochdurchsatz oder pharmakologische Untersuchungen. Darüber hinaus, weil das Verfahren von Zhang et al. (2013) 12 ergibt eine homogene Population von der oberen Schicht kortikalen Neuronen, unser angepasst Protokoll möglich fokussierte Studien in das Netzwerk ein machtctivity dieser speziellen neuronalen Teilmenge.

Nichtsdestoweniger hat dieser Ansatz auch einige Einschränkungen. Erstens kann die Homogenität der Kulturen auch ein Nachteil betrachtet werden, da die Kulturen weniger wahrscheinlich in vivo Netzwerken ähneln, wo verschiedene Klassen von Neuronen (dh inhibitorischen und exzitatorischen Neuronen) ein heterogenes Netzwerk bilden. Um die Nutzung der Technologie hiPSC abgeleiteten Neuronen mit MEA zu verbessern, wird es wichtig sein, eine schnelle (Transgen-basiert) Differenzierungsprotokolle für andere neuronale Zellpopulationen zu entwickeln. Wenn Protokolle verfügbar sind, würden die in - vitro - Netzwerke imitieren in vivo Netzwerke enger. Zweitens gegenwärtig Ratte Astrozyten müssen den hiPSC abgeleiteten Neuronen Wachstums Unterstützung hinzugefügt werden, und daher die sich ergebende neuronale Netzwerk ist kein menschliches neuronales Netz sensu stricto. Zuverlässige Protokolle für hiPSCs in Astrozyten können in Zukunft sol Differenzierungve dieses Problem 26. Drittens zweidimensionale neuronale Netzwerke, wie hier beschrieben, eine begrenzte Modell für komplexe dreidimensionale in vivo neuronalen Netzwerken zu studieren. Glücklicherweise Protokolle dreidimensionale Kulturen von primären Ratten - Neuronen in Kombination mit MEA - Technologie beschreiben , sind bereits verfügbar 27,28. Prospektiv, die Kombination von schnellen Differenzierungsprotokollen zur Gewinnung hiPSC abgeleiteten Neuronen und Astrocyten mit dreidimensionalen Kulturtechniken und MEA-Technologie sollten neue Einblicke in die biologischen Mechanismen der neurologischen Erkrankungen bereitzustellen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Jessica Classen für die Durchführung der Ganzzell-Patch-Clamp-Experimente. Die hiPSCs, die in unseren Experimenten verwendet wurden, wurden freundlicherweise von Huiqing Zhou und Willem van den Akker von der Radboud Universität Nijmegen zur Verfügung gestellt. Die in diesem Protokoll verwendeten Transfervektoren wurden freundlicherweise von Oliver Brüstle, Philipp Koch und Julia Ladewig vom Universitätsklinikum Bonn zur Verfügung gestellt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Lebovitz's L-15 mediumGibco11415-064
B-27 SupplementGibco0080085SA
Poly-D-Lysin (PDL)Sigma-AldrichP6407
Ca2+/Mg2+frei HBSS Gibco14175-095
0,05 % Trypsin-EDTAGibco25300-054
2,5% TrypsinGibco15090-046
DMEM mit hohem GlukosegehaltGibco11965-092
FBS (fötales Rinderserum)Sigma-AldrichF2442-500ML
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP4333
70 & Mikro; m Zell-SiebBD Falcon352350
DPBSGibco14190-094
psPAX2 lentiviraler VerpackungsvektorAddgenePlasmid #12260
pMD2.G lentiviraler VerpackungsvektorAddgenePlasmid #12259
BasalmembranmatrixGibcoA1413201
DMEM/F12Gibco11320-074
Lösung zur ZellablösungSigma-AldrichA6964
E8 MediumGibcoA1517001 ROCK-Inhibitor
GibcoA2644501 Alternativ können ROCK-Inhibitoren wie Thiazovivin verwendet werden.
PolybreneSigma-AldrichH9268-5G
G418Sigma-AldrichG8168-10ML
PuromycinSigma-AldrichP9620-10ML
VitronectinGibcoA14700
6-well MEAsMulti Channel Systems60-6wellMEA200/30iR-Ti-tcr
GlasdeckgläserVWR631-0899
Poly-L-Ornithin (PLO)Sigma-AldrichP3655-10MG
LamininSigma-AldrichL2020-1MG
DoxycyclinSigma-AldrichD9891-5G
N-2 ErgänzungGibco17502-048
Nicht-essentielle AminosäurenSigma-AldrichM7145
NT-3, human rekombinantPromokineC66425
BDNF, humanes rekombinantesPromokineC66212
Trypsin-EDTAGibco25300-054
L-Alanyl-L-GlutaminGibco35050-038
Neurobasales MediumGibco21103-049
Cytosin β-D-Arabinofuranosid Sigma-AldrichC1768-100MG
Gerade Pinzette mit feiner SpitzeFine Science Tools11251
Federschere mit feiner Spitze Feinwissenschaftliche Werkzeuge91500-09

Referenzen

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Neurogenin 2 Expressionelektrophysiologische Aktivit tMessung der Netzwerkaktivit thiPSC abgeleitete NeuronenSchnelldifferenzierungsprotokollKontrolle der Zelldichtefunktionelle Synapsenbildung

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