ACT-PRESTO: Biologische Gewebe Clearing und Immunmarkierung Methoden für Volume Imaging

Zusammenfassung

ACT-PRESTO (aktiv Klarheit Technik druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in Organe) ermöglicht eine schnelle, effiziente, aber kostengünstige Gewebe Clearing- und schnelle Antikörper das Eindringen in Gewebe gelöscht durch passive Diffusion oder druckunterstützten Lieferung. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann eine Vielzahl von Geweben durch multiple Antikörper gelöscht, immunmarkiert werden und volumen abgebildet.

Zusammenfassung

Die Identifizierung und Erforschung der detaillierten Organisation von Organen oder des ganzen Körpers auf zellulärer Ebene sind grundlegende Herausforderungen in der Biologie. Übergangsverfahren erfordern eine erhebliche Menge an Zeit und Mühe, ein 3D-Bild zu erhalten, und das intakte Gewebe, einschließlich Schneiden, Immunmarkierung, und Abbildungs ​​seriell geschnittene Gewebe, die bei jedem Schritt des Prozesses einen Informationsverlust erzeugt. In jüngster Zeit entwickelten Ansätze für hochauflösende Bildgebung in intaktem Gewebe, molekulare Charakterisierung wurde auf die Markierung von Proteinen beschränkt. Doch derzeit verfügbaren Protokolle für Orgel Clearing erfordern eine beträchtlich lange Prozesszeit, wodurch es schwierig Gewebe Clearing-Techniken im Labor zu implementieren. Wir stellten kürzlich eine schnelle und hoch reproduzierbare Protokoll bezeichnet ACT-PRESTO (a ctive c nungsmäßigkeit t echnique- p ruck r beschwingt e ffizient und s Tabelle t ransfervon Makromolekülen in o rgans), die für die Gewebezwischenraum innerhalb mehrerer Stunden ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht ACT-PRESTO schnelle Immunmarkierung mit konventionellen Methoden und beschleunigt Antikörper das Eindringen in die tiefe Schicht aus dicht gebildeten, dicken Proben durch Druck oder Konvektionsströmung Anwendung. Wir beschreiben, wie Gewebe herzustellen, wie durch Lipidentfernung zu löschen Elektrophorese und wie-Fleck Immuno durch einen druckunterstützten Lieferung. Die Schnelligkeit und Konsistenz des Protokolls wird die Leistung von 3D-histologischen Forschung und volumenbasierte Diagnosen beschleunigen.

Einleitung

Eine der Herausforderungen in den Neurowissenschaften ist die Visualisierung der neuronalen Verdrahtung und einzelne Zellen innerhalb intakten Hirngewebe. Bis vor kurzem demonstriert die Verbindungen zwischen den Neuronen auf diese Weise erforderlich 1) Serienschnitt von Geweben; 2) molekulare Kennzeichnung spezifischer Ziele, wie Axone oder Proteine; und 3) die Visualisierung von 3D - Rekonstruktion des gesamten Gehirns über Rechen Registrierung oder Ausrichtung von 2D - Serienbilder ^1. Diese Schritte sind mühsam, erfordert viel Zeit und haften Informationen zu verlieren, während des Schneidens und Kennzeichnung, so dass neuronale Netzwerk-Mapping äußerst schwierig. viele Methoden jedoch, dass für die Visualisierung von intaktem Gewebe ohne Schnitte erlauben entwickelt worden. Biologische Gewebe können durch Gewebe-Clearing - Techniken ^2-10 optisch transparent gemacht werden. Eine der wichtigsten Methoden der Brechungsindexunterschiede zwischen dem intakten Gewebe und der Eintauchlösung zu reduzieren, umLichtstreuung im intakten Gewebe zu reduzieren, wodurch das Gewebe transparent zu machen und ermöglicht die Beobachtung von tiefen Strukturen. Einige Arten von Eintauchlösungen hydrophobe Eigenschaften aufweisen, die während des Entwässerungsverfahrens in schnellen Fluoreszenzlöschung führen. Daher sind diese Verfahren nicht mit Fluoreszenzabbildung über einen langen Zeitraum ^11,12 kompatibel. Anstelle von hydrophoben Reagenzien verwenden , um andere Methoden hydrophile Reagenzien zur Gewebe Clearing-, wie SeeDB ⁴ und Sca l e ^6, das die Strukturinformation und Fluoreszenz des biologischen Gewebes ^4,6,8 aufrechtzuerhalten. Allerdings Makromoleküle, einschließlich Antikörper, kann nicht den Kern des intakten Gewebes durch Diffusion allein erreichen. Daher ist die vorge Markierung von Zielmolekülen in tiefen Bereichen dicht gepackte Gewebe technisch anspruchsvoll.

In einem kürzlich entwickelten Gewebe-Clearing - Verfahren, CLARITY ^3, ein Hydrogel eingebettet biologisches Gewebe iS mit Acrylamid gebildet und Lipiden durch Elektrophorese unter Natriumdodecylsulfat (SDS) -haltigen Lösung entfernt werden. Die Probe wird dann in einer Lösung mit einem passenden Brechungsindex Licht ³ Streuung reduzieren getaucht. Die Lipidentfernungssystem wurde später in fortgeschrittenen CLARITY ¹³ und PACT (passive Klarheit Technik) ¹⁰ modifiziert. Nach der Polymerisation vernetzen acrylamid Ketten mit Proteinen, hydrogel-bildenden Gewebe. Lipidkomponenten mit Acrylamid nicht vernetzen können; Somit Lipide können durch Elektrophorese unter dem SDS-enthaltenden Puffer eliminiert werden. Durch die aktive Eliminierung von Lipiden, Hirngewebe deutlich erhöht Transparenz ^9. Allerdings sind diese Methoden nicht die Unmöglichkeit, tief Kennzeichnung durch freie Diffusion adressieren. Um diese Einschränkung zu, Techniken für den aktiven Transport von Reagenzien in die tiefsten Teile der dicken Gewebe zu überwinden sind erforderlich.

Obwohl ermöglicht CLARITY Gewebe Clearing- und TiefengewebsmassageVisualisierung, es ist keine einfache oder schnelle Prozedur. Es kann mehrere Wochen dauern , eine ganze Mäusegehirn ^7,14 zu löschen. Schnelle Abwicklung von Gewebe ist wesentlich für die Anwendung solcher Methoden auf der Grundlagen- oder klinischen Labor-Einstellungen für Life-Science-Forschung oder Volumen Diagnose. Das aktuelle Protokoll sieht ein vereinfachtes Verfahren zur biologischen Gewebe Freigabe und nachfolgende Proteinnachweis durch druckunterstützten Lieferung Immunfärbung. Es ist geeignet für hochauflösende Abbildungsvolumen großer abgelegt und 3D-Datenverarbeitungssysteme durch Kombination mit bildgebenden Verfahren.

Protokoll

Tierversuche müssen auf alle relevanten staatlichen und institutionellen Vorschriften entsprechen.

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Für das Hydrogel Monomerlösung (A4P0): In 20 g Acrylamid zu 450 ml 0,1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und das Volumen auf 500 ml mit 0,1X PBS einzustellen.
   ACHTUNG: Acrylamidmonomere giftig sind. Führen Sie alle in einem Abzug mit persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich eines Gesichtsschutz, Laborkittel, Handschuhe und geschlossene Schuhe.
   1. Unmittelbar vor der 40 ml Hydrogel Monomerlösung (A4P0) in einem 50 ml konischen Röhrchen unter einer Abzugshaube 100 mg 2,2'-Azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propan] dihydrochlorid zu verwenden, fügen .
2. Für die elektrophoretische Gewebe Clearing (ETC) Puffer: In 40 g Natriumdodecylsulfat (SDS) und 12,37 g Borsäure zu 800 ml entionisiertem H ₂ O (dH ₂ O). Der pH-Wert mit NaOH auf 8,5 und die Lautstärke zu1 L mit zusätzlichen dH ₂ O.
   ACHTUNG: SDS ist eine schädliche Chemikalie; daher sollte diese sorgfältig behandelt.
3. Für die CUBIC-Mount - Lösung: In 250 g Saccharose, 125 g Harnstoff und 125 g N, N, N ', N' Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin zu 150 ml dH ₂ O und bringen die Lautstärke auf 500 ml mit dH ₂ O.

2. Probenvorbereitung & Fixierungen

1. Euthanasie der Maus.
   1. Bereiten Sie die Alfaxalon (1 mg / kg) und Xylazin (0,5 mg / kg) in derselben Spritze.
   2. Intraperitoneal injizieren, um die Mischung aus Alfaxalon und Xylazin und erlauben 3 min für die Maus bewusstlos zu werden.
   3. Warten Sie, bis die narkotisierten Maus reagiert nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie ein Schwanz und Zuziehen, bevor Sie fortfahren.
      ACHTUNG: Befolgen Sie die entsprechenden institutionellen Richtlinien für den Umgang mit Tieren.
2. Transkardial perfundiert die Maus mit 100 ml 0,9% NaCl (pH 7,4-7,5) -Lösungenthaltend Heparin (100 U / ml) zu exsanguinate, um 100 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS (pH 7,4) ¹⁴ gefolgt.
   ACHTUNG: PFA - Lösung ist giftig. Die Herstellung von PFA-Lösung und die gesamte anschließende Handhabung muss in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
3. Schneiden Sie die Maus den Kopf ab, öffnen die Haut, und brechen den Schädel zwischen den Augen mit einer kleinen Schere.
4. Entfernen Stücke des Schädels mit kleinen, gebogenen Pinzette.
5. Nehmen Sie das Gehirn oder gewünschten Organe aus.
6. Inkubiere das Gehirn und Organe in der Post-fix 4% PFA-Lösung bei 4 ° C über Nacht.
   HINWEIS: Für spezifische Region Gewebe Clearing, die spezifische Region sezieren oder das Gewebe nach Gewebefixierung trimmen.
   ACHTUNG: PFA - Lösung ist giftig. Die transkardialer Perfusion und alle nachfolgenden Maus Handhabung muss in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.

3. Hydrogel Monomer Infusion und Polymerization

1. Inkubieren der festen Organe in A4P0 Hydrogel-Monomer-Lösung bei 4 ° C für 12-24 h unter leichtem Schütteln.
2. Hydrogelmonomer-infundiert Gewebe Polymerisation.
   1. Übertragung der Probe in einen 10 ml Rundbodenröhrchen mit 5 ml Hydrogel Monomerlösung. Wickeln Sie das obere Ende der Rundbodenrohr mit Parafilm.
   2. Entfernen des Sauerstoffs aus der Rundbodenrohr, das Hydrogel-infundiert gesamten Gehirn der Maus enthaltenden Probe von 1 min Stickstoff durch die Flüssigkeit sprudeln. Schnell und dicht schließen Sie die Probe enthaltenden Röhre.
3. Übertragen, um das Rohr zu dem Wasserbad (37 ° C) für 2 h.
4. Waschen Sie die polymerisierte Probe kurz mit 0.1x PBS Überschuss Hydrogel zu entfernen.
   ACHTUNG: Hydrogele Monomere sind giftig. Hautkontakt mit Hydrogelmonomer, führen Sie alle Verfahren in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich eines Gesichtsschutz, Laborkittel und Handschuhe zu vermeiden.
   HINWEIS: Polymerisierte Gewebekann für mehr als 2 Wochen bei 4 ° C in 0,1 × PBS, das Natriumazid gelagert werden.
   ACHTUNG: Natriumazid ist hoch und akut toxisch. Führen Sie alle in einem Abzug und mit persönlicher Schutzausrüstung, einschließlich eines Gesichtsschutz, Laborkittel und Handschuhe.

4. Die elektrophoretische Tissue Clearing (ETC)

1. Übertragen Sie die polymerisierte Probe auf einen Gewebebehälter und legen Sie den Gewebebehälter in der ETC-Kammer.
2. Füllen Sie das ETC-Kammer mit ETC-Puffer mit peristatische Pumpe.
3. Stellen Sie die ETC-Bedingungen und führen Sie den ETC. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen.
   1. Für ETC-Einstellungen für ganze Organe, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: (1,5 Ampere), Temperatur (37 ° C), Laufzeit (6,0 h), Pumpendrehzahl (30 Umdrehungen pro Minute).
   2. Für ETC-Einstellungen für 1- bis 2 mm dicke Maus Hirnschnitten, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Strom (1,5 Ampere), Temperatur (37 ° C), Laufzeit (2,0 h), Pumpendrehzahl (30 Umdrehungen pro Minute).
4. Transfer ter gelöscht Probe auf einem 50 ml konischen Röhrchen mit 45 ml 0,1X PBS. Waschen Sie die gelöscht Probe mehrmals mit 0.1x PBS, bis keine Blasen zu sehen sind, wenn das Rohr kurz geschüttelt wird (um die vollständige Entfernung von SDS bestätigen).

5. Immunmarkierung von ACT-verarbeitete Gewebe

1. Für Maus gesamte Gehirn: Inkubieren der Probe in einer 3-ml-Volumen der Antikörperlösung, enthaltend 1x PBS, 6% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Triton X-100 und 0,01% Natriumazid (Antikörperverdünnungslösung) mit einem Verdünnungs Faktor 1/500 für Tyrosin-Hydroxylase (TH) Antikörper für 4 Tage bei 37 ° C mit leichtem Schütteln. Ersetzen Sie die Antikörperlösung am Ende des Tages 2.
   1. Waschen Sie die Probe in einem 50 ml konischen Röhrchen mit 45 ml 0,1 x PBS 3 - 5 h und wechselt jede Stunde Puffer.
   2. Inkubieren der Probe in einer 3-ml-Volumen der Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Esel-anti-Kaninchen-488 sekundärem Antikörper für 4 Tage bei 37 ° C mit leichtem Schütteln. replAss der verdünnten Antikörperlösungen am Tag 2.
2. Für 1- bis 2 mm dicke Scheiben geschnitten Hirngewebe: Inkubieren der Probe über Nacht oder bis zu 1 Tag in einem 0,5- bis 1-ml-Volumen der Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Kollagen Typ IV-Antikörper bei 37 ° C mit leichtem Schütteln.
   1. Waschen Sie die Probe in einem 15-ml konischen Röhrchen mit einem 12-ml-Volumen von 0,1 × PBS für 1-2 h. Ändern Sie den Puffer jede Stunde.
   2. Inkubieren der Probe in einer 0,5- bis 1-ml-Volumen der Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Cy3-konjugiertem anti-Kaninchen Sekundär-Antikörper über Nacht oder bis zu 1 Tag bei 37 ° C mit leichtem Schütteln.
3. Waschen Sie die Probe in 0,1 × PBS 3 - 5 h; wechselt jede Stunde Puffer.
4. Vor der Bebilderung, die Probe in einer geeigneten Menge kubisch-Mount-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Ersetzen mit frischem CUBIC-Mount-Lösung und Inkubation für 1 weitere Stunde.
   HINWEIS: 76 Typ von Antikörpern funktionierte gut in Maus ACT-verarbeitete Gewebe, darunter 31 monoklonale Antikörper ^14. Pre-markiertes Gewebe kann mit der Immunmarkierung von zwei Fluorochromen in ACT-verarbeitete Gewebe kombiniert werden.

6. Immunmarkierung von dichten Gewebe (PRESTO)

1. c-PRESTO
   HINWEIS: c-PRESTO eignet sich für kleine Proben, wie Voll testis, gesamte Niere oder kleine Abschnitte größerer Organe.
   1. Übertragung der Probe in ein 1,5-ml-Röhrchen, 500 & mgr; l Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Kollagen Typ IV-Antikörper und zentrifugieren Sie das Rohr bei 600 × g für 2 h.
   2. Waschen der gefärbten Probe mit 0,1X PBS durch Zentrifugation bei 600 × g für 30 min.
   3. Fügen 500 ul Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Cy3-konjugiertes anti-Kaninchen-Sekundärantikörper und Zentrifuge bei 600 × g für 2 h.
   4. Waschen Sie die gefärbte Probe mit 0.1x PBS durch Zentrifugation bei 600 × g für 30 min.
2. s-PRESTO
   HINWEIS: s-PRESTO ist für größere Gewebe geeignet.
   1. Bereiten Sie eine Spritze (30 ml Volumen) und verbinden Sie es mit einem 3-Wege - Ventil (Abbildung 1A). Kleben Sie das Ventil mit einer Klebepistole für den Hochdruckbedingungen (1B).
   2. Transfer der Probe in die 3-Wege-Ventil angeschlossenen Spritze in der geschlossenen Ventilstellung.
   3. Hinzufügen von 5 bis 7 ml Antikörperverdünnungslösung mit einem Verdünnungsfaktor von 1/500 für Kollagen Typ IV-Antikörper. Lösen der Antikörperlösung in die Probe durch Öffnen des Ventils.
   4. Stellen Sie den Spritzenkolben in die 17-ml-Position ausreichend Platz zu schaffen für die Infusion / Rückzugsbewegung. Dies kann in der offenen Ventilstellung erfolgen. Schließen das 3-Wegeventil, nachdem die Spritze Einstellung beendet ist.
   5. Legen Sie die Spritze die Probe auf eine Spritzenpumpe enthält. Set die Spritzenpumpe Bedingungen in einem Infusions- / Entnahmevolumen von 10 ml / min und einem 4-min Zeit auf Dauerzyklus Pause - Modus (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Die Pumpe infundiert , bis er das Zielvolumen (10 ml) erreicht hat , und dann die Strömungsrichtung ändert sich nach einer kurzen Pause (4 min).
   6. Führen Sie die Spritzenpumpe 3 - 24 h bei Raumtemperatur (1F).
   7. Öffnen Sie das 3-Wege-Ventil und ersetzen Sie die Lösung mit 0,1 x PBS.
   8. Waschen Sie die gefärbte Probe zweimal mit 0,1X PBS für 1 h bei jedem der Spritzenpumpe.
   9. Ändern Sie mit Antikörperverdünnungslösung, die Cy3-konjugierten Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Verdünnungsfaktor von 1/500) und führen Sie die Spritzenpumpe 3 - 24 h.
   10. Öffnen Sie das 3-Wege-Ventil und ersetzen Sie die Lösung mit 0,1 x PBS.
3. Vor der Bildgebung, brüten die gefärbte Probe in einer geeigneten Menge CUBIC-Mount-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Ersetzen mit frischem CUBIC-Mount-Lösung und Inkubation für 1 weitere Stunde.

7. ichmaging

1. Legen Sie das markierte Gewebe in einem konfokalen Schüssel und fügen Sie CUBIC-Mount-Lösung, bis das Gewebe bedeckt ist. Legen Sie ein Deckglas auf das Gewebe. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop zur Abbildung des Gewebes ¹⁴ unter dem 10X - Objektiv.

Ergebnisse

ACT-Gewebe Clearing

Ein wichtiger Faktor Gewebe Clearing beeinflusst, ist Gewebefixierung. PFA Fixierung und Acrylamid Infusion sind separate Schritte in diesem Protokoll. Nach dem gewebe Hydrogel Polymerisationsschritt wird die freie A4P0 Lösung nicht polymerisiert, obwohl gewebe infundiert Hydrogele vernetzte mit endogenen Makromoleküle sind. Kein Gel sollte außerhalb des Gewebes (2A) bilden daher. Die ACT-Verfahren führt zu einer geringeren Vernetzung zwischen Proteinen und Acrylamid zu der CLARITY-Protokoll verglichen. Dementsprechend ist das gewebe Hydrogelprobe poröser. Diese Funktion ermöglicht die schnelle Extraktion von Lipiden und die Diffusion von Makromolekülen. Abschnitte des Mausgehirn 1- bis 2-mm Dicke wurden innerhalb von 1 ausreichend gelöscht - 2 h (2B), und 5 - 6 h der ETC war ausreichend für clearance ganzer Mäusehirnen (Abbildung 2C). Hydrogel-vermittelte induzierte Gewebe Clearing die Expansion des Gewebes nach dem ETC-Schritt, aber das Gewebe wieder auf seine ursprüngliche Größe in Brechungsindex angepassten Lösung. Das Gewebe-Hydrogelprobe in dem ACT Verfahren gebildet ist hochporös und somit kleinen Verbindungen und Makromoleküle konnten eindringen effizient und leicht diffundieren (Abbildung 3). Nach einer 2-stündigen Inkubation von 1-mm Hirnschnitten mit Tyrosin - Hydroxylase (TH) und Typ IV - Antikörper Collagen, ein anschließender 2-stündiger Inkubation mit einem sekundären Antikörper ausreichend war , dopaminergen Neuronen in einem 500 & mgr; m Tiefe (Figur 3) zu etikettieren .

PRESTO-Gewebe Immunmarkierung

Dense Organe haben im allgemeinen hohe Konzentrationen an ECM-Fasern, die das Eindringen von Antikörpern in das Gewebe wirkt. So Antikörper PENETbis zu einer Tiefe von nur 20-30 & mgr; m in dichtem Gewebe, wie Nierengewebe, nach 12 Stunden Inkubation bewertet. Um diese Einschränkung zu überwinden, entwarfen wir aktive Makromolekül Penetration Methoden, die die Lieferung von Reagenzien in tiefe Gewebe zu ermöglichen, nämlich PRESTO (druckabhängig effiziente und stabile Übertragung von Makromolekülen in die Organe) (Abbildung 4). Im Vergleich zur statischen Inkubation von ACT-processed Nierengewebe mit Antikörperlösungen, die Anwendung von Zentrifugalkräften (600 · g) mit einer Tischzentrifuge (Schleuder PRESTO, c-PRESTO) stark verbessert Antikörper Lieferung in tiefe Gewebe (Abbildung 5). Wenn wir die c-PRESTO Verfahren zu dichten Gewebe aufgetragen, 3 h Inkubation ausreichend war, 250- bis 300 & mgr; m tiefen Strukturen zu beschriften. Um die Gewebeverzerrung ohne signifikante Gewebeschäden zu verbessern, die wir entworfen auch eine Maschine, die Konvektionsströmung mit einer Spritzenpumpe (Spritze PRESTO, s-PRESTO) zur Verfügung stellt. Dieser Prozess ähnlich Antikörper pe verbessertnetration Vergleich zu passiven Diffusion (Abbildung 5).

Figure 1. Herstellung des s-PRESTO Vorrichtung. A. Eine Spritze (30 ml) und Dreiwegehahn. B. Der Dreiwegehahn verbunden und mit der Spritze aufgeklebt. C. Die Spritze , die die Probe und Antikörperlösung enthält, und die Spritze auf der Spritzenpumpe gegeben. D. Die Spritzenpumpe und Arbeitsbedingung - Setup. E. Die Pumpe flößt eine Lösung , die die Markierungsreagenzien in die Probe enthält. Wenn das bezeichnete Volumen erreicht ist, zieht sich die Pumprichtung ändert und die Lösung nach einer bestimmten Zeitspanne. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. ACT Gewebe Clearing von Gehirn der Maus. A. Nach der Polymerisation werden freie A4P0 Lösungen nicht polymerisiert werden ; Gewebe infundiert Hydrogele werden durch Vernetzung mit endogenen Makromoleküle geliert. B. 1- bis 2 mm dicke Gehirnschnitte wurden für 1 gelöscht - 2 h, und das Ausmaß der Expansion und Größe Erholung Reflexionsindex (RI) Zusammenpassender Lösung wurden aufgezeichnet. C. Die Dicke der gesamten Gehirn der Maus beträgt etwa 0,8 cm und 5 - 6 h der ETC ausreichend wurde zum Gehirn vollständig klar. Nach 3 h von ETC gab es eine erhebliche Menge an nicht geräumten Gewebe. Mit 6 h von ETC hatte jedoch das Löschen des gesamten Gehirns auftrat. Die Farbe des Gewebes nach ACT in dem ETC-Puffer ist weiß oder undurchsichtig. Durch RI Einstellung, werden Gewebe transparent. Bitte klicken siee eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Immunmarkierung mit ACT-gelöscht Maus Gehirngewebe. Bilder von ACT-processed 1-mm Maushirnschnitten der Maus Hirnrinde mit einem Antikörper gegen Kollagen Typ IV und ein Teil des Mittelhirns mit einem Antikörper gefärbt gefärbten zeigt, auf Tyrosinhydroxylase (TH). Maßstabsbalken, 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. PRESTO Immunmarkierungsmethoden. Antikörper können nicht in dichtem Gewebe durch Diffusion eindringen. PRESTO Immunomarkierung Methoden wurden entwickelt, um aktiv Makromoleküle ziehen lassen und Reagenzien zu liefern indichte Gewebe. Die Anwendung von Zentrifugalkräften eine Standard-Tischzentrifuge (Schleuder PRESTO, c-PRESTO) unter Verwendung erleichtert deutlich die Lieferung von Antikörpern. Appling Konvektionsströmung mit einer Spritzenpumpe (Spritze PRESTO, s-PRESTO) verbesserte Antikörper Penetration. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. PRESTO Immunmarkierung von ACT-gelöscht dichtem Gewebe. Für c-PRESTO wurden die Gewebe bei 600 × g für 3 Stunden zentrifugiert, um eine Standard-Tischzentrifuge, um das Eindringen von primären und sekundären Antikörpern zu beschleunigen. Für s-PRESTO wurde eine Spritzenpumpe verwendet, um die Antikörper zu liefern. Maus-Organen, wie Niere und Leber wurden mit Kollagen Typ IV bezeichnet. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden, 3 hc- oder s-PRESTO verbessert deutlich die Kennzeichnung Tiefe. In der Niere und Leber, erreicht die Tiefe der Z-Achse von 300 bis 350 um oder tiefer in PRESTO Proben (rechts), während die Kontrollproben in einer Tiefe von nur 40 - gekennzeichnet sind, 50 & mgr; m (links). Ein 3D-rekonstruierte Bild wurde mit einem konfokalen Mikroskop erhalten. Maßstabsbalken, 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Schlechte Fixierung oder Hydrogel Eintauchen in das Gewebe kann den Verlust von Proteinen führen und die Verzerrung des Gewebes während des Gewebes Clearing-Prozess. Die ganze erwachsenen Gehirn der Maus sollte über Nacht in 4% Paraformaldehyd inkubiert werden, gefolgt von Eintauchen in einem minimalen Volumen von 20 ml Hydrogel Monomerlösung für 12 bis 18 h unter leichtem Schütteln. Für große Gewebe einschließlich menschliches Gewebe wie Gehirn und Rückenmark slices verlängerte Zeit in dem Hydrogel Monomerlösung Einweichen erforderlich. Das ACT-Protokoll ist leicht anwendbar für das Clearing von fixierten Gewebe, weil die Gewebefixierung und Polymerinfusionsschritte getrennt sind. Nach Gewebe Lichtung wurden menschliche Gewebe mit mehreren Antikörpern gut gefärbt. Beachten Sie, dass die ACT Verrechnungsverfahren mit Alkohol Fixiermitteln, wie Ethanol und Methanol nicht kompatibel ist.

Das Gewebe-Hydrogel-Polymerisationsschritt ist auch wichtig, gute Qualität Gewebe nach dem Clearing-Verfahren herzustellen. weilSauerstoff inhibiert die Polymerisation von Acrylamid, sollte es durch Entgasen des Gewebe enthaltenden Lösung unter einem Stickstoffgasinfusionssystem entfernt werden. Alternativ kann De-Sauerstoffversorgung für 23 h mit einer Vakuumkammer unter Verwendung von mit einem Wärmeblock ausgeführt werden.

Die Clearing - Rate hängt von zahlreichen Faktoren ab , einschließlich der Organgröße, die Inhalte von Lipiden oder ECM Faserproteine, den Zustand der Fixierung, usw. Die meisten erwachsenen Mausgeweben kann über Nacht durch ETC gelöscht werden. Es besteht jedoch die Gefahr einer unnötigen Über Clearing- und Gewebe Schwellung; Somit sind die Unterschiede in der Klärungszeit von wichtiger Gesichtspunkt. Tissue-Clearing-Bedingungen sollten empirisch ermittelt werden. Wichtig ist, dass der Inhalt der ECM kann das Aussehen des Gewebes beeinträchtigen gelöscht. Die Farbe des Gewebes bleibt weiß oder opak, selbst nach dem ACT in ETC-Puffer, da ACT nicht dichten Proteinfasern löschen. Wenn jedoch wurden diese Organe in RI passende Lösung eingetaucht, diey wurde durchsichtig.

Die Rate der Gewebeschwellung erscheint auf den ECM Inhalte der Gewebe und weiche Organe, wie das Gehirn, weisen ein höheres Quellverhältnis als dichte Organe abhängig. Da erhöhte Gewebe nutzt ACT Schwellung wird das Gewebe-Clearing-Verfahren helfen, routinemäßig auf Wasserbasis Puffer in den meisten Fällen destilliert. In einigen Fällen, wenn Gewebeschwellung oder transient Deformierung nicht erwünscht ist, wie beispielsweise in Embryonen, Puffer, enthaltend 0,1X PBS für hochauflösende Bildgebung angewendet werden. Es sollte auch bemerkt werden, dass höhere Salzkonzentrationen in dem Puffer die Schrumpfung des Gewebes verursachen könnten.

Die ACT - Methode können ganze Organe zu klären und auch den ganzen Körper einer Maus ^14. Allerdings erfordert tiefen Gewebe-Bildgebung von transparenten Gewebe speziellen Mikroskopen und Ziele. Somit Hirngewebe 1- bis 2 mm dick ist am effektivsten für die Bildgebung mit einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop. In unseren Händen, das Entfernen des Etikettsed Antikörper aus ACT-verarbeitete Gewebe ist die Antikörper-abhängige und Runden von verschiedenen Antikörpermarkierung sind nicht zu empfehlen. Mehrere Antikörper, wie TH und GFAP arbeitete besonders gut für die Ganzhirnimmunmarkierung ^14. Auf der anderen Seite können einige Antikörper, wie TuJ1 oder Map2, oft nur die Oberfläche der Gewebe gekennzeichnet. Dies kann durch andere Verfahren verbessert werden, wie beispielsweise Schalter ^15. Eine weitere potenzielle Einschränkung ist, dass es schwierig sein könnte, feine Proteinstrukturen in ACT-verarbeitete Gewebe zu erhalten, weil das Gewebe Schwellung und Schrumpfung während des Gewebe-Löschschritt.

Presto-Technik ist auf eine breite Vielfalt von Gewebemarkierungstechniken. Beispielsweise in gewebe transparent Methoden vormarkiert Gewebe, wie SeeDB ⁴ und iDISCO ^7, Immunmarkierung von dichtem Gewebe erfordert Inkubationszeiten länger als mehrere Tage bis Wochen. Allerdings PRESTO kann die Inkubationszeit bis zu mehreren Stunden zu verkürzen, enabling die Fertigstellung des gesamten Prozesses innerhalb eines Tages mit 1 mm dicken dichten Gewebe. PRESTO kann die Wirksamkeit von tief Kennzeichnung dicken, dichten Gewebe oder sogar un-geklärt dicke Gewebe verbessern. Weil PRESTO eine Tischzentrifuge oder Spritzenpumpe verwendet und erfordert keine spezielle Ausrüstung, ist es relativ einfach, diese Technik mit Routinelaborverfahren zu implementieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4% Paraformaldehyd	Lugen SCI	LGB-1175-4B	Probenfixierung
Acrylamid	Affymetrix	75820	Hydrogel-Monomer-Lösung
2,2'-Azobis[2-(2-Imidazolin-2-yl)propan]dihydrochlorid	Wako Pure Chemical Industries	VA-044	Hydrogel-Monomer-Lösung
Borsäure	Affymetrix	76324	ETC-Puffer
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Affymetrix	18220	ETC-Puffer
Natriumhydroxid-Pellets	Junsei-Chemikalie	1310-73-2	ETC-Puffer
Rinderserumalbumin (BSA)	Santa Cruz Biotechnologie	sc-2323A	Immunmarkierung
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Immunmarkierung
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002	Immunmarkierung
Tyrosinhydroxylase (TH)	Millipore	AB152	Antikörper/Immunmarkierung
Alexa Fluor Cy3 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-165-152	Sekundäre Antikörper/Immunmarkierung
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Life Technologies - Molekular Sonden	A21206	Sekundäre Antikörper-/Immunmarkierung
Konfokalschale	SPL lifesciences	101350	Bildgebung
Konfokales Mikroskop	Leica	SP8	Bildgebung
Saccharose	Junsei chemikalie	31365-0301	CUBIC-Mount-Lösung
Urea	Affymetrix	23036	CUBIC-Mount-Lösung
N,N,N',N' -tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylendiamin	Sigma-Aldrich	122262	CUBIC-Mount-Lösung
ECT-Kammer	Logos Biosystems, Inc.	C10101	ETC-System
ECT-Kammersteuerung	Logos Biosystems, Inc.	C10201	ETC System
Temperaturfühler	Logos Biosystems, Inc.	C12101	ETC System
Peristatische Pumpe	Baoding längere Präzisionspumpe Co., Ltd	YZ1515X	ETC System
Pufferbehälter	Logos Biosystems, Inc.	C10401	ETC-System
Behälter für Gewebe	Logos Biosystems, Inc.	C12001	ETC System
Behälterhalter für 1 Gewebebehälter	Logos Biosystems, Inc.	C12002	ETC System
Maus Gehirn Slice Halter	Logos Biosystems, Inc.	C12004	ETC System
Halter für das ganze Rattenhirn	Logos Biosystems, Inc.	C12007	ETC System
Schlauch für Schlauchpumpe	Logos Biosystems, Inc.	C12104	ETC System
Tabletop-Zentrifuge	Hanil science industrial Co., Ltd	MICRO 12	c-PRESTO
Spritzenpumpe	Baoding längere Präzisionspumpe Co., Ltd	LSP02-1B	s-PRESTO
Spritze (30 mL)	Korea vaccine Co., Ltd.	KV-S30	s-PRESTO
3-Wege-Absperrhahn	Hyupsung medical Co.,Ltd.	HS-T-01N	s-PRESTO