Hier präsentieren wir ein Protokoll zur ortsspezifischen Einführung chemischer Sonden in ein Antikörperfragment, indem eine azidhaltige Aminosäure genetisch eingebaut und anschließend das Azid mit einer chemischen Sonde durch stammgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) gekoppelt wird.
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Methodenartikel
Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung von Dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Derzeit gibt es viele chemische Werkzeuge zur Verfügung, chemische Sonden in Proteine einzuführen ihrer Struktur und Funktion zu untersuchen. Ein geeignetes Verfahren ist Proteinkonjugation durch genetisch eine unnatürliche Aminosäure Einführen einer bioorthogonale funktionelle Gruppe enthalten. Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Protokoll für die ortsspezifische Antikörper-Konjugation. Das Protokoll umfasst die experimentelle Details für die genetische Einbau eines azidhaltigen Aminosäure und die Konjugationsreaktion durch dehnungs gefördert Azid-Alkin-Cyclo (SPAAC). Dieser Stamm-vermittelte Reaktion verläuft durch einfaches Mischen der reagierenden Moleküle bei physiologischem pH-Wert und Temperatur, und erfordert keine zusätzlichen Reagenzien wie Kupfer (I) -Ionen und Kupfer-Chelat-Liganden. Daher würde diese Methode für die allgemeine Proteinkonjugation und Entwicklung von Antikörper-Arzneimittel-Konjugate (ADCs) nützlich sein.
Einleitung
Da der genetische Einbau von p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli wurde berichtet, 1 mehr als 100 unnatürliche Aminosäuren (UAAs) wurden in verschiedene Proteine erfolgreich eingebaut. 1-3 Unter diesen UAAs die Aminosäuren bioorthogonale funktionellen Gruppen wurden intensiv untersucht und stellen den größten Anteil enthält. Die bioorthogonale funktionellen Gruppen in den UAAs verwendet werden , umfassen Ketone, 4 Azid, 5 Alkin, 6 Cyclooctin, 7 Tetrazin, 8 α, β-ungesättigten Amids, 9 Norbonen, 10 transcyclooctene, 11 und Bicyclo [6.1.....
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Protokoll
1. Plasmidkonstruktion
- Konstruieren eines Expressionsplasmids (pBAD-HerFab-L177TAG) , die das Ziel - Antikörper - Gen (pBAD-HerFab-WT) mit einem His 6 -tag zum Ausdruck bringen würde, und ersetzen Sie das Codon für Leucin-177 mit dem Amber - Codon (TAG) 27, unter Verwendung von herkömmliche ortsspezifische Mutagenese-Technik.
Siehe Tabelle der Materialien. - Konstruieren Sie ein anderes Expressionsplasmid (pEVOL-AFRS) , um die Gene für die entwickelte tRNA Tyr und Aminoacyl-tRNA - Synthetase (aaRS) Paar enthält. Verwenden Sie die speziell entwickelten Plasmidvektor, pEVOL, für einen effizient....
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Ergebnisse
In dieser Studie wurde ein Antikörperfragment ortsspezifisch mit einem Fluorophor konjugiert durch ein Azid enthaltenden Aminosäure in dem Fragment enthält , und das mutante Antikörperfragment mit einem gespannten Cyclooctin Umsetzung von (Abbildung 1). HerFab wurde als Zielantikörperfragment ausgewählt ist, in die AF als Azid-enthaltende Aminosäure eingebaut wurde. Zu dem Rückstand in HerFab für den Ersatz mit AF, die Röntgenkristallstruktur von HerFab wählen, wurde ana.......
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Diskussion
Die genetische Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Verfahren zur Proteinmodifikation verwendet. 1-3 Einer der wichtigen Vorteile ist die allgemeine Anwendbarkeit auf jede Art von Protein. Im Prinzip gibt es keine Begrenzung für ein Zielprotein und eine Zielstelle des Proteins in der Auswahl. Jedoch Ersetzen eines strukturell oder funktionell wichtigen Rückstand mit einem UAA resultieren, die die Struktur und Funktion des Zielproteins in verändern. Im Allgemein.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optional das gelbe Stoppcodon (TAG) an einer gewünschten Position enthalten. Ko, W. et al. Effiziente und ortsspezifische Antikörpermarkierung durch stammgeförderte Azid-Alkin-Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A. und Schultz, P. G. Ein verbessertes System für die Mutagenese unnatürlicher Aminosäuren in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression |
| Host Plasmid Mini-prep kit | Nukleogen | 5112 | 200/Packung |
| Agarose | Intron Biotechnologie | 32034 | 500 g |
| Ethidiumbromid | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Bouillon | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Kulturvorbereitung | |||
| 2.1 Elektroporation | |||
| Mikropulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Mikropulser Küvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm Elektrodenabstand, pkg. von 50 |
| Ampicillin Natrium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC Medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression und Reinigung von HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression von Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Salzsäure, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Zelllyse | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA Dinatriumsalzdihydrat, 99,5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Saccharose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozym | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinitätschromatographie | |||
| Ni-NTA-Harz | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylen-Säule | QIAGEN | 34924 | 50/Packung, 1 ml Kapazität |
| Imidazol, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Natriumphosphat monobasisch, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Natriumchlorid, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Konjugation von gereinigtem HerFab-L177AF mit Alkinsonden unter Verwendung von Strain-promoted Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Reinigung von markierten HerFab | |||
| Amicon Ultra 0,5 mL Zentrifugalfiltern | MILLIPORE | UFC500396 | 96/Packung, 500 μ L capacity |
| 6. SDS-PAGE Analyse von markiertem HerFab und Fluoreszenzgel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99,5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Probenpuffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES Laufpuffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE Gele | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variabler Imager | Amersham Biosciences |
Referenzen
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G.
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Nachdrucke und Genehmigungen
