Proximale Cadaveric Femur Vorbereitung für die Bruchfestigkeit Prüfung und quantitative CT-basierte Finite-Elemente-Analyse

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein robustes Protokoll, wie man sorgfältig bewahren und cadaveric femora für Bruchtests und quantitative Computertomographie vorzubereiten. Das Verfahren ermöglicht eine präzise Kontrolle über die Eingangsbedingungen für die Zwecke der Beziehungen zwischen der Knochenmineraldichte, die Bruchfestigkeit zu bestimmen, und Definieren Finite-Elemente-Modellgeometrie und -eigenschaften.

Zusammenfassung

Cadaveric Bruchtest wird routinemäßig zu verstehen Faktoren verwendet, die proximalen Femur Stärke beeinflussen. Da ex vivo Gewebe biologischen neigen ihre mechanischen Eigenschaften im Laufe der Zeit zu verlieren, Probenvorbereitung für experimentelle Prüfung sorgfältig zuverlässige Ergebnisse durchgeführt werden müssen , um zu erhalten, die in - vivo - Bedingungen darstellen. Aus diesem Grund haben wir ein Protokoll und eine Reihe von Vorrichtungen, die Oberschenkel Proben, so dass ihre mechanischen Eigenschaften erfahren minimale Veränderungen vorzubereiten. Die Femora wurden in gefrorenem Zustand gehalten, außer während Vorbereitungsschritte und mechanische Prüfung. Die relevanten klinischen Maßnahmen der gesamten Hüfte und Oberschenkelhalsknochenmineraldichte (BMD) wurden mit einem klinischen Dual X-ray (DXA) Knochendensitometer erhalten, und die 3D-Geometrie und Verteilung von Knochenmineral wurden unter Verwendung von CT mit einem Kalibrierphantom erhalten für quantitative Schätzungen auf der Basis der Grauwerte. Jede mögliche Knochenerkrankung, BruchOder das Vorhandensein von Artefakten oder Implantaten die Knochenstruktur zu beeinflussen, wurde mit Röntgenscans ausgeschlossen. Zur Vorbereitung wurden alle Knochen von überschüssigem Weichgewebe sorgfältig gereinigt und wurden geschnitten und an der inneren Drehwinkel von Interesse vergossen. Eine Schneidvorrichtung erlaubt das distale Ende des Knochens in einer gewünschten Länge des proximalen Femur verlassen abgeschnitten werden. speziell für die gewünschten Orientierungen zu Positionierung des Oberschenkelhalses in vorgeschriebenen Winkeln während der späteren CT-Scanning und mechanischen Prüfung der proximale femorale Schäfte wurden in Polymethylmethacrylat (PMMA) vergossen unter Verwendung einer Spannvorrichtung ermöglichen. Die Daten aus den Experimenten gesammelt wurden dann zur Validierung der quantitative Computertomographie (QCT) -basierte Finite-Elemente-Analyse (FEA) verwendet, wie in einem anderen Protokoll beschrieben. In diesem Manuskript präsentieren wir das Protokoll für die präzise Knochenpräparation für die mechanische Prüfung und anschließende QCT / FEA-Modellierung. Das aktuelle Protokoll wurde erfolgreich über 200 cad vorzubereiten angewendetaveric femora über einen 6-Jahres-Zeitraum.

Einleitung

Die Bestimmung der wahren Festigkeit des proximalen Femurbruchs von Leichen durch mechanische Prüfung ist eine destruktive Methode, die einen rigorosen Testansatz für genaue Messungen erfordert. Insbesondere sind geeignete Knochenpräparationsmethoden erforderlich, um eine nahezu in-vivo-Integrität der Knochen vor der mechanischen Frakturprüfung zu erhalten¹. Dies wird durch die richtige Lagerung der Knochen und die Minimierung der Handhabung bei Raumtemperatur erreicht. Diese Testdaten werden ausgiebig verwendet, um QCT/FEA-Modelle von Femurfrakturen zu validieren, die das Potenzial haben, klinisch zum Verständnis des Frakturrisikos eingesetzt zu werden, insbesondere bei osteoporotischen Patienten. Leider gibt es derzeit kein Standardverfahren, um proximale Femurproben für die mechanische Untersuchung vorzubereiten. Ein gutes Prüfverfahren sollte die Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit des Präparationsprozesses gewährleisten. Daher müssen die für die Probenvorbereitung erforderlichen Vorrichtungen sorgfältig entworfen und hergestellt werden, um die Wahrscheinlichkeit verschiedener Testfehler zu minimieren. Wir müssen auch die Vorbereitungszeit minimieren, in der das Knochengewebe Raumtemperatur hat und somit Gefahr läuft, sich mit irreversiblen Veränderungen der mechanischen Eigenschaften zu zersetzen.

Zu diesem Zweck haben wir ein Verfahren entwickelt, das Knochengewebe über mehrere Präparationsschritte hinweg konserviert. Dies ist wichtig, um eine minimale Expositionszeit bei Raumtemperatur zu gewährleisten und gleichzeitig die Anzahl der Gefrier-/Auftauzyklen zu minimieren, die die physikalischen Eigenschaften des Gewebes beeinträchtigen können². Das gesamte Verfahren ist langwierig und nicht trivial, da sich die Schritte über mehrere Wochen ereigneten und eine Planung für die Scanvorgänge und die Verfügbarkeit von Personal erforderten. Zu den Schritten gehörten das Auftauen von Knochenproben, das Screening der Proben mittels DXA-Scanning, um Werte für die Knochenmineraldichte (BMD) zu erhalten, Röntgenaufnahmen, um kranke Proben auszuschließen, und schließlich CT-Scans, um die Verteilung der Knochenmineral- und Femurgeometrie abzuschätzen. Alle Proben wurden für die Prüfung vorbereitet, indem überflüssiges Weichgewebe von der Knochenoberfläche entfernt, der Femur auf eine für die Prüfung erforderliche Länge geschnitten und der Femur in einer gewünschten Ausrichtung vergossen wurde, um einen seitlichen Sturz auf die Hüfte während der nachfolgenden Tests zu simulieren. Es ist wichtig, den Zeitraum für all diese Vorgänge so kurz wie möglich zu halten. Ein robustes Protokoll ist daher für eine konsistente Probenvorbereitung, die Gewebekonservierung zwischen den Schritten und die Reduzierung der Gesamtvorbereitungszeit erforderlich.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Verfahren zur Vorbereitung von Femurproben für nachfolgende mechanische Tests unter verschiedenen Bedingungen detailliert darzustellen. Die Erhaltung des Knochengewebes ist in diesem Prozess von entscheidender Bedeutung, und wir haben dies erreicht, indem wir die Proben zwischen den Schritten eingefroren und sie immer sorgfältig in mit Kochsalzlösung getränkte Handtücher eingewickelt haben, außer beim Scannen und mechanischen Testen der Knochen. Femora wurden während der Schritte der PMMA-Härtung auch in salzhaltige Feuchttücher gewickelt, um ein Austrocknen des Knochengewebes zu verhindern.

Protokoll

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll vorgestellt Studien des Institutional Review Board (IRB) an der Mayo Klinik genehmigt. Die Knochen wurden über einen Zeitraum von 6 Jahren von verschiedenen Organisationen erhalten. Alle Proben wurden innerhalb von 72 Stunden nach dem Tod gesammelt, in Kochsalzlösung gesättigt Tücher eingewickelt und bei -20 ° C bis zur Herstellung gespeichert.

1. Messung der Knochenmineraldichte DXA Verwendung

1. Entfernen Proben bei -20 ° C Gefrierschrank aufbewahrt für etwa 24 h bei Raumtemperatur auftauen; Proben müssen nicht aus Originalverpackung entfernt werden, wenn die meisten Weichgewebe entfernt wurde.
2. Verwenden Sie zwei 5 lb Säcke Reis für Weichgewebe zu berücksichtigen. Decken Sie die zwei Säcke Reis auf der DXA-Tabelle mit Plastiktüten Kontamination zu verhindern. Die Reis Taschen werden umgebenden Weichgewebe (in vivo) während der Abtastung zu simulieren , wie in Abbildung 1 dargestellt.
3. Schützen Sie die Oberfläche des DXA-Scanner mit Kunststoff ausgekleidet Papier und Platz 2 Plastik verpackt rice - Taschen auf dem Scannertisch (Abbildung 1A).
4. Lay 2 femora (rechts und links) oben auf Reis Taschen , so dass das proximale Ende (einschließlich des Hüftkopfes) zentriert auf Taschen und die hintere Seite nach unten (Abbildung 1B). Dies ahmt einen Patienten auf dem Rücken liegend.
5. Abdeckung Anterior / exponierten proximalen Femur Ende mit zwei zusätzlichen 5 lb Beutel Reis (Abbildung 1C).
6. Die Maschine über Kopf proximalen Femur und scannen Sie das Femur nach dem Standard institutionellen Verfahren für die Patienten BMD - Messung (Abbildung 1C). Folgen Sie den spezifischen DXA Anweisungen des Herstellers.
   1. Von der DXA-Maschine Software-Schnittstelle einen normalen Femur-Scan durchführen. Wählen Sie die Oberschenkel Prüfung, positionieren Sie den DXA Arm auf der Oberseite des cadaveric Femur durch Drücken auf den linken oder rechten Pfeil entsprechend auf der DXA Arm, und starten Sie die Prüfung durch einen Klick auf die Schaltfläche "Start". Führen Sie die BMD-Analyse durch einen Klick auf "Analysieren".
      NICHTE: Das resultierende automatische T-Score von der Untersuchung klassifiziert den Knochen als normal, Osteopenie oder osteoporotischen (Abbildung 1D). Folgen Sie den spezifischen DXA Anweisungen des Herstellers.

2. Reinigen, Schneiden und Bohren das distale Ende des Knochens

1. Reinigen Sie die proximalsten 300 mm des Oberschenkels durch sorgfältig alle verbleibenden Weichgewebe aus dem Knochen entfernt werden. den Knochen während des Einbettungsprozesses zu kontaktieren in der Vorbereitung für die mechanische Prüfung Dieser Schritt ist erforderlich, PMMA zu ermöglichen. Die Knochen müssen nicht auf Raumtemperatur für dieses Verfahren aufgetaut werden.
2. Desinfizieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Isopropylalkohol und decken den Tisch mit einem saugfähigen Papierauflagen mit Kunststoff - Folie auf einer Seite (2A). Stellen Sie den ganzen Oberschenkel auf dem Tisch (2B) für den gesamten Prozess , beginnend mit der Reinigung zu schneiden (2A bis 2H). Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) einschließlich Handschuhenund Augenschutz.
3. Abkratzen überschüssige Periost und wegschneiden überschüssige Gewebe mit einem Schaber und Skalpell (2C, 2H).
4. Platzieren Sie den Knochen in der maßgeschneiderten Schneideinrichtung wie in 2D mit dem Kopf des Oberschenkelknochens gegen die Acrylplatte der Halterung gezeigt.
5. Richten und die Diaphyse gegen die beiden Stifte an der Schneidvorrichtung (2D) zu halten.
6. Sichern Sie den Knochen an der Befestigung durch Anziehen der Schlitzplatte auf der Diaphyse nach unten; wenn Knochen auf dem Halter nicht flach liegen, hängen distale Tabelle oben ab und optional auch zip den Oberschenkelhals binden als notwendig , um die Probe an Ort und Stelle (2D) zu halten.
7. Schneiden Sie den distalen Schaft des Oberschenkels mit dem Gussschneider (Abbildung 2E) durch Schlitzplatte als Führung; halten Knochen mit einem trockenen Tuch / Tuch für besseren Halt.
8. Entfernen Sie die Knochen aus der Halterung; normale Knochenlänge nach dem Schnitt ist 255 mm (Abbildung2F).
9. Reinigen Sie die Markhöhle des Mark mit einem scharfen Löffel ca. 25 mm tief. Dann fügen Sie eine Gazeschwamm die innere Oberfläche zu helfen, trocknen. Entfernen Sie die Gaze kurz vor dem distalen Ende des Femur in der Form angeordnet wird. Fassen Sie den Knochen mit einem trockenen Tuch / Lappen und bohren Sie ein 10 mm Loch durch das distale Ende bei etwa 25 mm von der proximalen abgeschnittene Ende der Probe. Hinweis: Dies ist das PMMA zu erlauben, den Kanal zu durchdringen und den Knochen fest zu sichern.

3. Vergießen des Knochen

1. Entwerfen und fabrizieren Vergießen Behälter. Die Einbettungs Behälter sind aus 5 mm dicken Acrylplatten und haben die folgenden äußeren Abmessungen: 50 mm x 50 mm mit quadratischem Querschnitt und 100 mm hoch (3A).
2. Label - Verguss Behälter mit geeigneten Knochenidentifikation (3A und 3B - siehe Etikett auf Acryl - Box).
3. Stellen Sie die Einbettung Halterung auf die richtige Ausrichtung (linkes Beinoder rechtes Bein; zB 15 ° oder 30 ° Innenrotation).
4. Legen Sie Vergießen Behälter in der Basis der Einbettung Befestigung, Platz Knochen in dem Vergießen Behälter (3B) und richten Hals mit Zeiger in der Halterung (3C) , um den inneren Drehwinkel des Knochens auf den gewünschten Wert einzustellen.
5. Messen Sie 60 g PMMA-Pulver und mischen sich mit 30 g flüssigem Harz unter Abzug vornehmen, bis das Pulver aufgelöst hat. Die Mischung sollte gießbar sein. Verwenden Sie eine Einweg-Pappbecher für diesen Prozess.
6. Die Mischung in Vergießen Behälter mit Knochen unter einer Abzugshaube (3D), lassen für etwa 10 bis heilen - 15 min bis PMMA klar und hart ist. Dies sollte nur füllen ~ 1/2 des Einbettungsbehälter mit PMMA. Wickeln Sie vorsichtig den Knochen in gesättigter Salzlösung Handtücher Gewebe Trockenheit aufgrund der Wärmeerzeugung während PMMA - Polymerisation (3E) zu verhindern.
7. Überprüfen Sie regelmäßig den Oberschenkelknochen zu gewährleisten, ist es in der ausgerichtet bleibtBehälter während des Aushärtens.
8. Entfernen Sie Femur von Potting Vorrichtungs- und wickeln mit einer Kochsalzlösung getränkten Papiertuch (Abbildung 3E).
9. Bereiten Sie 90 g PMMA unter einer Abzugshaube, wie in Schritt 3.5 und füllen Sie den Verguss Behälter vollständig erklärt. Heilt PMMA für etwa 10 bis 15 Minuten, bis es hart wird.
10. Nach dem Harz ausgehärtet ist, fest einwickeln / rewrap Knochen in Kochsalzlösung getränkten Papiertüchern, Abdeckung mit Plastiktasche und Lagern Sie die Proben bei -20 ° C in Tiefkühltruhe.

4. Abbilden der Knochen mit Röntgen

(VORSICHT! Betreiben Sie mit der richtigen Pflege für Röntgenstrahlung bei der Verwendung der Maschine)

1. Wenn Filme für Röntgenstrahlen verwenden, schalten Röntgen Entwickler auf mindestens 20 min (pro Anweisungen des Herstellers) vor dem Abtasten durch Drehen nach rechts (in der Entwicklerraum).
2. Stellen Sie sicher, es ist nicht belichteten Film in der Kassette vor Röntgens; Kassette sollte nur in einem dunklen Raum geöffnet werden.
3. Schalten Sie Maschine aufentriegeln und den Maschinenkopf verlängern.
4. Platzieren der einen Wagen unter dem Pfad des Strahls und legen eine Kassette auf dem Wagen unter dem Balken (4A).
5. Platz und die Position des Oberschenkels auf der Kassette (4B); zwei Orientierungen werden erfasst: medial-Seitenansicht und anterior-posteriore Ansicht. Beschriften Sie die Probenbilder entsprechend.
6. Nach der ersten Exposition, tauschen Sie die Führung und Knochen Standorten.
7. Decken Sie die bereits ausgesetzt Hälfte mit Blei und setzen den Knochen in der zweiten Orientierung auf der nicht betroffenen Seite. Dies ermöglicht dem Benutzer einen Röntgenfilm für einen einzelnen Knochen in zwei Orientierungen (4C-D) zu verwenden.
8. Ändern Sie die Kassette und drehen jeden Oberschenkel in die zweite Ausrichtung.
9. Im Fall eines einzelnen Femur Abdeckungshälfte der Kassette mit einem Bleiabdeckung ersten Exposition des gesamten Films mit Röntgenstrahlen zu vermeiden.
10. Bewegen Sie hinter dem verbleiten tragbare Wand für den persönlichen Schutz und verwenden Sie den Auslöser zu belichtendie Knochen.
11. Nach Abschluss der Rückkehr Röntgenkopf und Speicherposition zu verriegeln, drehen Sie Schlüssel auf OFF auf X-ray-Maschine und ausgesetzt Röntgenfilm zu entfernen.
12. Entwickeln Sie den Film Röntgenbilder (4E) mit einem normalen Filmentwickler zu erhalten. Schalten Sie das weiße Licht in den Raum und suchen Sie den Filmentwickler. Schalten Sie das rote Licht und drehen Sie das weiße Licht vor dem Öffnen der Kassette und fahren Sie mit dem Filmentwicklungsprozess ab. Öffnen Sie die Kassette und legen den Film durch den Entwickler. Schalten Sie das weiße Licht und drehen Sie das rote Licht, sobald der Film aus entwickelt.

5. CT Scanning of Bones

1. Entfernen Sie die Knochen aus dem Gefrierschrank etwa 24 h vor dem Scannen. Knochen müssen vor werden, um das Scannen vollständig aufgetaut.
2. Stellen Sie sicher, die Knochen sind in Plastiktüten für das Scannen zu verpackenden clean-up am Ende zu minimieren.
3. Und sichern den Femur und den Kalibrierkörper in der CT - Abtastung Befestigung (5A-B). die fixture hält den Kalibrierkörper (5C) und hält auch den Femur in einer Orientierung (5D-E) identisch ist mit der Ausrichtung für die nachfolgende mechanische Prüfung gewünscht. Diese Quer Registrierung ist erforderlich , um die Daten von CT - Scans (5F) in der QCT / FEA Modellierung zu verwenden (in einem anderen Protokoll beschrieben).
   HINWEIS: Die Vorrichtung ist so ausgelegt, dass es den Femur für CT-Scanning aussetzt, ohne den proximalen Femur zu behindern (femoral Kopf, Hals, Trochanter major und der proximalen Welle).
4. Achten Sie darauf , das Gerät zusammen mit dem Oberschenkelknochen in dem CT - Scanner richtig die System Laser als Führer (Abbildung 5D-E) ausgerichtet ist. Überprüfen Sie erneut die Ausrichtung der Halterung mit der CT langen Achse Laser (durch Laserdruck / Aus-Taste). Das Phantom braucht nicht mit dem Laser ausgerichtet werden, wie es in der Halterung befestigt ist. Null, um die Tabellenposition über das Bedienfeld der Maschine durch Drücken der Null button (→ 0 ←) auf dem Bedienfeld.
5. Im Anschluss an CT Standardverfahren arbeiten die CT-Gerät bei 120 kVp, 216 mAs, 1 s Rotationszeit und Abstand von 1 unter Verwendung von ultrahochauflösenden Modus (Zuhr). Daraus ergibt sich eine Schichtdicke von 0,4 mm und eine Pixelgröße von 0,30 bis 0,45 mm auf die Größe des Sichtfeldes abhängig (FOV).
6. Überprüfen Sie die CT-Scan-Daten vor der mechanischen Tests, um sicherzustellen, dass die Bilder von Interesse erfasst und gespeichert. Wieder einfrieren den Knochen bei -20 ° C bis zum Tag des Experiments.

Ergebnisse

Die cadaveric femora versandt wurden eingefroren und bei -20 ° C gehalten, bis die Vorbereitung begann. BMD Scannen wurde mit einem DXA - Scanner durchgeführt gesamten Hüfte und Hals BMD sowie T-Score für jede Probe (Abbildung 1) zu messen. Ein T-Score ist die Anzahl der Standardabweichungen der gemessenen BMD im Vergleich zu den durchschnittlichen Werten für jungen, gesunden Probanden. Es kann von -2,5 oder weniger für osteoporotischen Knochen, zwischen -1 und -2,5 für ...

Diskussion

Wir stellten eine robuste Knochenpräparation Protokoll für die mechanische Prüfung und QCT / FEA Modellierung von Oberschenkel Stärke in einer Seitwärts Sturz auf die Hüfte Konfiguration gewährleistet. Diese Methode wurde unser Standard-Haus Protokoll. Im Laufe von 6 Jahren mit variierenden Personal, etwa 200 Femora wurden nach diesem Protokoll erfolgreich hergestellt. Die Ergebnisse des Protokolls beinhaltet die Klassifizierung Bedingungen Knochen DXA mit metastatischen Erkrankungen auszuschließen, frühere Knochenbrüch...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CT-Vergussbehälter und Scanvorrichtung	Intern gefertigt	N/A	Kundenspezifisch entwickelter und gefertigter
CT-Scanner	Siemens	Somatom Definition Scanner (Siemens, Malvern, PA)	CT-Scan-Ausrüstung
Quantitative CT Phantom	Midways Inc, San Francisco, CA	Model 3 CT-Kalibrierung Phantom Wird	zum Abrufen von BMD-Werten von Hounsfield-Einheiten im CT-Bild verwendet
Dual Energy Röntgen-Absorptiometrie-Scanner	General Electric	N/A	GE Lunar iDXA-Scanner für die Knochengesundheit oder ähnliche BMD-Scanner
Hygienisches Orhodontisches Harz (PMMA)	Patterson Dental Supply	H02252	Kontrollierte Substanz und kann mit entsprechender Zulassung erworben werden
Gefrierschrank	Kenmore	N/A	Dies ist ein -20 ° C Lagerung für
Knochen Röntgenscanner	General Electric	46-270615P1	Röntgen-Bildgebungsgeräte.
Röntgenfilme	Kodak	N/A	Zur Anzeige von Röntgenbildern
Röntgenentwickler	Kodak X-Omatic	M35A X-OMAT	Wird für die Entwicklung von Röntgenbildern verwendet
Röntgenkassette	Kodak X-Omatic	N/A	Wird zum Halten von Röntgenfilmen
verwendet 5-Pfund-Reissäcke	Tolles Preis-Leistungs-Verhältnis	N/A	Wird zur Nachahmung von Weichgewebe während des DXA-Scanvorgangs verwendet
Physiologische Kochsalzlösung (0,9 % Natriumchlorid)	Baxter	NDC 0338-0048-04	Wird verwendet, um Proben mit Feuchtigkeit zu versorgen
Skalpelle und Schaber	Bard-Parker	N/A	Wird verwendet, um den Knochen von weichem Gewebe zu reinigen
Gussschneider	Stryker	810-BD001	Wird verwendet, um den Oberschenkelschaft
zu schneiden Bohrmaschine	Bosch	N/A	Wird verwendet, um den Oberschenkelschaft
zu bohren Abzug	Hamilton	70532	Wird zur Belüftung verwendet, wenn PMMA hergestellt wird