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Methodenartikel

Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus der Maus subcallosa Zone

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DOI:

10.3791/54929

⸱

15. Dezember 2016

 ,  , 
1Department of Anatomy, Korea University College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Etablierung von Kultursystemen für die Expansion adulter neuraler Stammzellen (aNSCs) ermöglicht die Untersuchung und Anwendung von aNSCs für die Therapie. Die subkallosale Zone (SCZ) wurde kürzlich als neuartige Neuroblasten-bildende Region bei erwachsenen Mäusen erkannt. Hier werden Methoden zur Isolierung, Expansion und Differenzierung von SCZ-aNSCs beschrieben.

Zusammenfassung

Adulte neurale Stammzellen (aNSCs) können zur Regeneration von geschädigtem Hirngewebe verwendet werden. NSCs haben das Potenzial zur Differenzierung und Proliferation in drei Arten von Zellen: Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Die Identifizierung von aNSC-abgeleiteten Regionen und die Charakterisierung der aNSC-Eigenschaften sind entscheidend für den potenziellen Einsatz von aNSCs und für die Aufklärung ihrer Rolle bei der neuronalen Regeneration. In der subkallosalen Zone (SCZ), die sich zwischen der weißen Substanz und dem Hippocampus befindet, wurde kürzlich berichtet, dass sie aNSCs enthält und kontinuierlich Neuroblasten hervorbringt. Ein geringer Prozentsatz der aNSCs aus der SCZ ist in Neuronen differenziert; Die meisten Zellen werden in Gliazellen wie Oligodendrozyten und Astrozyten differenziert. Es wird vermutet, dass diese Zellen ein therapeutisches Potenzial für traumatische kortikale Verletzungen haben. Dieses Protokoll beschreibt detailliert den Prozess zur Erzeugung von SCZ-aNSCs aus einem adulten Mausgehirn. Eine Hirnmatrix mit Abständen von 1 mm wird verwendet, um die SCZ-haltigen Koronalschnitte zu erhalten und die SCZ aus dem gesamten Gehirn präzise zu präparieren. Die SCZ-Sektionen sind zunächst einer Neurosphärenkultur unterworfen. Ein gut entwickeltes Kultursystem ermöglicht die Überprüfung ihrer Eigenschaften und kann die Forschung an NSCs fördern. Ein Neurosphärenkultursystem bietet ein nützliches Werkzeug zur Bestimmung der Proliferation und zur Sammlung der echten NSCs. Eine Monolayer-Kultur ist auch ein In-vitro-System zur Untersuchung von Proliferation und Differenzierung. Bezeichnenderweise bietet dieses Kultursystem eine homogenere Umgebung für NSCs als das Neurosphären-Kultursystem. Unter Verwendung einer diskreten Hirnregion werden diese Kultursysteme daher hilfreich sein, um unser Wissen über aNSCs und ihre Anwendungen für therapeutische Zwecke zu erweitern.

Einleitung

NSCs haben Merkmale der Selbsterneuerung und der Differenzierung mehrerer Abstammungslinien. Um diese Eigenschaften zu bestätigen, wurde häufig ein Neurosphären-Kultursystem verwendet. Das Neurosphären-Kultursystem wurde Anfang der 1990er Jahre entwickelt und diente als Standard-Stammzellkultursystem1. Abhängig von der Selbsterneuerungspotenz vermehren sich NSCs kontinuierlich und erzeugen in einer Suspensionskultur eine Zellmasse. Es wird davon ausgegangen, dass die Anzahl der Zellen und die Größe der Neurosphäre eng mit den Proliferationseigenschaften der NSCs verbunden sind. Monolayer-Kulturen werden auch häufig für die Erhaltung und Differenzierung von NSCs verwendet. Im Vergleich zur Neurosphärenkultur bietet das Monolayer-Kultursystem eine bessere homogene Erhaltung und Expansion von NSCs2. Diese beiden gut entwickelten Kultursysteme haben zur Charakterisierung von aNSCs in vitro beigetragen.

NSCs befinden sich in verschiedenen Hirnregionen, wie der subventrikulären Zone (SVZ) des lateralen Ventrikels und der subgranularen Zone (SGZ) des Hippocampus3-5. Die subkallosale Zone (SCZ) der kaudalen subkortikalen weißen Substanz wird als neue neurogene Region6-8 erkannt. Kürzlich wurde berichtet, dass die SCZ-aNSCs therapeutisches Potenzial bei traumatischen Hirnverletzungen haben9. Im Vergleich zu anderen neurogenen Regionen befindet sich die SCZ entlang der subkortikalen weißen Substanz. Im menschlichen Gehirn nimmt die subkortikale weiße Substanz eine größere Region ein als im Gehirn der Maus10. Daher ist ein Verständnis der Eigenschaften von SCZ-aNSCs unter Verwendung eines in vitro Kultursystems wichtig, um den potenziellen Einsatz dieser Zellen für die neuronale Regeneration zu fördern. Eine genaue Dissektion der gewünschten Hirnregion ist erforderlich, um eine mögliche Kontamination durch unerwünschte Regionen, die aktive oder ruhende NSCs enthalten, auszuschließen. So können beispielsweise aNSCs in nicht-neurogenen Regionen aktiviert werden und neue Nervenzellen in verletzten Gehirnen oder während der In-vitro-Kultivierung produzieren11. Um NSCs aus der SCZ zu gewinnen, wurden Zellen aus Hirnschnitten entnommen, die die SCZ enthielten. Anschließend wurde eine vorsichtige Mikrodissektion der SCZ-Region mit einer feinen Nadel durchgeführt. Um die Neurosphäre aus der SCZ zu erzeugen, wurden mikropräparierte SCZ-Gewebestücke in einzelne Zellen dissoziiert und dann als Suspension in Gegenwart des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) und des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) kultiviert. Nachdem SCZ-aNSCs Neurosphären gebildet haben, können sie auch als Neurosphären oder Monoschichten zur Expansion beibehalten werden. Dieses Verfahren demonstriert auch Immunfärbeprozesse mit verschiedenen Markern für den Nachweis von NSCs und deren Nachkommen nach deren Expansion und Differenzierung in einer Monolayer-Kultur. Hier wird ein visuelles Protokoll des SCZ-aNSC-Kultursystems vorgestellt. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen für die Mikrodissektion der SCZ-Region sowie für die Wartung und Passage der Zellen.

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Protokoll

1. Herstellung von Materialien und Kulturmedium

  1. Für die Präparation und Dissoziation des SCZ, wickeln Sie das Gehirn Matrix, zweischneidigen Rasierklinge und Zange mit Aluminiumfolie, und sie dann im Autoklaven sterilisiert werden.
  2. Vorbereitung 50 ml kaltem PBS-Puffer das gesamte Gehirn der Maus zu waschen.
  3. Legen Sie ein Präpariermikroskop und bereiten die chirurgischen Instrumente für die Präparation des Gehirns erforderlich (autoklaviert Schere und Pinzette) und die Isolierung des SCZ (1 ml Spritze, 30 G-Nadel, Gehirn-Matrix und einer feinen Pinzette).
  4. Herstellung von N2 Medium:
    1. Bereiten F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + Natriumbicarbonat) -Medium mit 2% B27, 1% N2 Ergänzungsmittel, und 1% Penicillin-Streptomycin.
      Hinweis: Das Wachstumsmedium besteht aus N2-Medium und Wachstumsfaktoren (20 ng / ml gereinigten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 20 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF2)).
  5. Bereiten Sie einen Verdauungspuffer (40 Einheiten / ml Papain, 2,4 Einheiten / ml DISPASII e und 2% Penicillin-Streptomycin in PBS) für eine Gewebe Verdauung.
  6. Herstellung von Beschichtungs Plate und Deckglas:
    1. Bereiten poly-L-Ornithin (PLO; 0,01%) und Laminin (10 ug / ml , gelöst in dH & sub2 ; O). Zur Beschichtung von Platten mit 6 Vertiefungen für die Aufrechterhaltung der SCZ-aNSCs als Einschicht- oder 18 mm-Deckgläschen für die Immunfärbung, inkubieren mit PLO über Nacht bei 4 ° C. Dann waschen Sie sie 3 - mal mit DH 2 O Lassen Sie die Platten und Deckgläser nach der letzten Wäsche zu trocknen.
    2. Als nächstes brüten die Platten mit Laminin über Nacht bei 4 ° C. Dann waschen Sie sie 3 - mal mit DH 2 O.
      Achtung: Die Laminin nicht trocken, was die Zellbindung beeinflussen.
      Anmerkung: Die Beschichtungslösungen können 3-mal wiederverwendet werden.

2. Isolierung und des Zerfalls des Adult SCZ

  1. Vor der Kultur Vorbereitung, legen Sie die Gehirn-Matrix und zweischneidiges Rasiermesser auf dem Eis.
    Hinweis: Das Gehirn Matrix nicht einfrieren, weil der brain könnte daran zu binden.
  2. Opfere eine Maus (8 Wochen alt) von CO 2 Ersticken oder Genickbruch.
    1. Schneiden Sie den Kopf mit einer scharfen Schere nach dem Spritzen 70% Ethanol aus. Um den Kopf zu immobilisieren, halten fest an beiden Seiten des Kopfes. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere an der Mittellinie in einer Schwanz-rostralen Richtung. Dies fördert die vollständige Entfernung der Haut von dem Schädel.
    2. Entfernen Sie den kaudalen Teil des Schädels (posterior lambda) zuerst, und dann legen Sie die Zange zwischen dem Schädel und das Gehirn an der dorsalen Mittellinie Position. Besorgen Sie sich die links (oder rechts) Scheitelbein und vorsichtig abziehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Entfernung des anderen Scheitelbein.
      Hinweis: Wegnahme der Sehnerv und die Entfernung der Hirnhäute aus dem Gehirn machen es leichter, das Gehirn aus dem Schädel zu lösen.
    3. Übertragen Sie das Gehirn zu kaltem PBS-Puffer (25 ml) und spülen Sie ihn zweimal überschüssiges Blut zu entfernen.
  3. Legen Sie das Gehirn in das Gehirn Matrix auf Eis und make koronale Schnitte 1 mm dicke Scheiben zu erhalten. Übertragen Sie die Gehirnscheiben (1 mm), um die SCZ Regionen enthalten, die im hinteren Teil des Gehirns zu einer kalten PBS in einer 35 mm Petrischale aus Kunststoff befinden.
    Achtung: Um eine parallele Ebene von koronalen Abschnitte zu erhalten, stellen Sie sicher, dass das Gehirn Riss in der Mittellinie des Gehirns Matrix angeordnet ist; es ist wichtig, unnötige Schwankungen in den Abschnitten zu vermeiden.
    Hinweis: Erhalten Gehirnscheiben bei 2-3 mm hinter Bregma; Dies ermöglicht die Trennung des SCZ vom SVZ.
  4. Unter dem Binokular mit geringer Vergrößerung, Mikro-sezieren die SCZ aus der weißen Substanz Bereich des Cortex und Hippocampus mit einer gebogenen Nadel 30G 6,9. Dann entfernen Sie die Rinde Regionen über dem SCZ. Platzieren Sie den sezierten SCZ Region von den Scheiben in eine 35 mm Petrischale aus Kunststoff auf Eis ohne kaltem PBS.
    Hinweis: Die Kontamination von zusätzlichen Regionen reifen Neuronen, welche die Lebensfähigkeit von aNSCs und Neurosphere Bildung b beeinflussen könnteneil sie unterliegen in aNSZ nach folgenden Kriterien Kulturbedingungen Zelltod.
  5. Mit einer gebogenen 30 G-Nadel, sofort hacken die sezierten Gewebe in kleine Stücke.
    Hinweis: Wenn eine längere Zeit zum Präparieren des SCZ Gewebe erforderlich ist, bevor Zerkleinern der sezierten Gewebe in kaltem PBS tauchen.
  6. Re-suspendieren des zerkleinerten Gewebe mit 1 ml Verdauungspuffer, zu übertragen, das Gewebe zu einem 15 ml-Röhrchen mit 2 ml Verdauungspuffer, und inkubiere für 30 min in einem Wasserbad 37 ° C.
    Hinweis: Das Röhrchen wird alle 10 Minuten gut zu mischen.

3. subcallosa Zone abgeleiteten adulten neuralen Stammzellkultur

  1. Tippen Sie auf das Rohr leicht das verdaute Gewebe zu trennen, und dann zentrifugiert werden die Röhrchen bei 145 xg für 5 min. Überstand verwerfen, erneut suspendiert, um die verdaute Gewebe mit 1 ml vorgewärmtes N2 Medium, um die Verdauung Puffer zu waschen und sanft die Probenlösung maximal 5 mal pipettieren eine P1000 Pipette.
    Hinweis: Über Verreiben mit einem schmalenPipettenspitze kann die Lebensfähigkeit der Zellen und das anschließende Wachstum verringern.
  2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 145 xg für 5 min. Nach Verwerfen des Überstandes, resuspendieren in 1 ml Medium N2 des Zellpellets.
  3. Vorbereitung 1 ml N2-Medium in einer nicht-beschichteten 6-Well-Platte und 1 ml der suspendierten Zellen auf ein Endvolumen von 2 ml zu machen.
  4. In EGF (20 ng / ml) und bFGF (20 ng / ml) in jede Vertiefung. Schütteln Sie die 6-Well-Kulturschale mit der Hand mit den plattierten Zellen die zusätzlichen Wachstumsfaktoren zu mischen. Halten Sie die 6-Well - Platte in einem 37 ° C und 5% CO 2 Inkubator.
  5. Hinzufügen, EGF (20 ng / ml) und bFGF (20 ng / ml) zu jedem Well täglich für 8 Tage. Jeden dritten Tag, 200 & mgr; l N2 Medien die ungefähre 2 ml Volumen des Mediums aufrechtzuerhalten.

4. Passagierung von NSCs als Neurosphären und Monolayer-Kulturen

  1. Sammeln Sie die Neurosphären und sie auf einem neuen 15 ml konischen Röhrchen.
    Hinweis: Die Anzahl der Neurosphären (> 50 & mgr; m Durchmesser) per gut von der SCZ einer einzelnen Maus Gehirn war 64,3 ± 7,31, die als die des SVZ weniger war (190,5 ± 6,33) 9.
  2. Inkubieren der Neurosphären mit 0,5 ml Dissoziationspuffer für 5 min in einem Wasserbad 37 ° C, um die Neurosphären in einzelne Zellen dissoziiert. Primäre Neurosphären können in einzelne Zellen und gepflegt über mehrere Passagen als Neurosphere oder Monolayer-Kulturen voneinander zu trennen sind.
    Hinweis: Der Ausbau SCZ-aNSCs als Monoschicht auf Neurosphären überlegen ist, weil SCZ-aNSCs kann> 10-mal in einer Monokultur-Format agiert werden, aber <5 mal in einem Neurosphere Kultur Format.
    Achtung: SCZ-aNSCs zeigen eine starke Aggregation, und es ist schwierig, sie in einzelne Zellen zu distanzieren. Somit wird der Neurosphärenkultur Format nicht für Routinezellexpansion empfohlen.
  3. Pipettieren vorsichtig die Probenlösung nach oben und unten mit einer P1000 Pipette weniger als 5-mal und Zentrifuge das Rohr bei 145 g für 5 min. Überstand verwerfen und neu sudie Neurosphären mit 1 ml Medium N2 verbringen.
    Hinweis: Über eine schmale Pipettenspitze Verreiben kann die Lebensfähigkeit der Zellen und das anschließende Wachstum verringern.
  4. Um die Zellen zu zählen, machen Sie eine 1: 1-Gemisch aus der Zellsuspension (10 ul) und der 0,4% Trypanblau-Lösung und dann die Anzahl der lebenden Zellen auf einer Zählkammer zählen. Nach der Beschichtung / Laminin eine 6-Well - Platte mit der PLO, die Platte , die Zellen bei 2,5 x 10 5 Zellen / ml mit 2 ml N2 - Medium für jede Vertiefung.
    Hinweis: Änderungen in der Zelldichte ihren Zustand und Differenzierungspotenzial beeinflussen können.
  5. Pflegen die SCZ-aNSCs mit einer täglichen Behandlung von Wachstumsfaktoren (2 ml, 20 ng / ml) für 5 Tage, und diese Passage ihnen.

5. Differenzierung von subcallosa Zone abgeleiteten adulten neuralen Stammzellen

  1. Platte aNSCs auf eine PLO / Laminin-beschichtete 18 mm Deckglas mit 1 x 10 5 Zellen / ml in 1 ml N2 mit Wachstumsfaktoren (20 ng / ml) für die Differenzierung der SCZ-aNSCs.
  2. Am nächsten Tag,Wenn die Zellen fest an dem Deckglas angebracht ist, das Wachstumsmedium mit N2 tauschen die Wachstumsfaktoren zu entfernen.
  3. Nach 6 Tagen, wasche die differenzierten Zellen mit 1 ml PBS Zelltrümmer zu entfernen und sie für die Immunfärbung fixieren.
    Hinweis: BrdU in die neu synthetisierte DNA der proliferierenden Zellen eingebaut werden. Daher kann, falls gewünscht, BrdU (10 & mgr; g / ml) zugegeben werden, um Zellen zu leben vor der Fixierung der Zellen.

6. Immunostaining adulten neuralen Stammzellen und Differentiated Vorläufern

  1. Für die Immunfärbung, waschen Sie die Zellen mit PBS und fixieren Sie diese mit 4% PFA für 20 min bei Raumtemperatur.
    Achtung: PFA ist sehr giftig; Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen.
  2. Entfernen Sie die 4% PFA, spülen Sie die fixierten Zellen mit PBS 3 mal, und dann bei 4 ° Cuntil sie für die Immunfärbung benötigt werden.
  3. Inkubieren der Zellen auf dem Deckglas mit Blockierungslösung (3% Rinderserumalbumin und 0,1% Triton X-100 in 1 × Pmindestens 30 min bei Raumtemperatur BS) für.
  4. Bereiten Sie die primären Antikörper in frischen Blockierungslösung und die Proben unter über Nacht bei 4 ° C.
    1. Immunostaining die aNSCs
      1. Beflecken die aNSCs mit Anti-Nestin und Anti-BrdU-Antikörper. Vor der Fixierung hinzufügen 20 ug BrdU in die aNSCs und brüten sie für 2 h. Führen der Denaturierungsschritt unter Verwendung von 2 N HCl für 20 min bei 37 ° Cbefore den Blockierungsschritt durchzuführen.
    2. Immunostaining die differenzierten Vorläufern:
      1. Verwenden anti-O4, anti-Tubulin-bIII und Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) -Antikörper die differenzierten Vorläufern zu etikettieren.
  5. Waschen der Proben mit 3 mal PBS und Inkubieren sie mit sekundären Fluoreszenzfarbstoffe konjugiert Antikörper (1: 500) in Blocking-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Proben 3 mal mit PBS.
    Hinweis: Verwenden Sie sekundäre Antikörper, die die Gastgeber des primären entsprechenAntikörper. Hoechest33343 (1: 2000) wird für die Kernfärbung verwendet.
  6. In einem Glasobjektträger Montagelösung und fahren Sie mit Montage. Beobachten und Bild der Probe auf einem konfokalen Mikroskop bei mehreren Wellenlängen: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm) und Hoechest33343 (405 nm).

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Ergebnisse

Definition des Kultursystems für aNSCs aus dem unbekannten neurogene Region ist von wesentlicher Bedeutung für diese Zellen zu verstehen und für ihre mögliche Verwendung in Gehirn Reparatur 12 zu entwickeln. Es ist bekannt , dass NSC in verschiedenen Entwicklungsstadien oder in unterschiedlichen Bereichen unterschiedlich 3,4 verhalten. Vor kurzem wurde berichtet , dass SCZ-abgeleiteten Zellen Differentialpotentiale für die neuronale Differenzierung in vivo ...

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Diskussion

Dieses Dokument beschreibt ein detailliertes Protokoll NSC von der adulten Maus SCZ zu erzeugen und sie für verschiedene Anwendungen zu erhalten. Es gibt drei wichtige Schritte zur Ermittlung der In - vitro - Kultursystem erforderlich zu reinigen und SCZ-NSCs erweitern. Erstens ist es wichtig, sicherzustellen , dass die SCZ Region genau von anderen potentiellen neurogener Bereiche (1B) präpariert wird. Dick und präzise Abschnitte der SCZ Regionen enthielten , wurden mit einem 1 mm Abst...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Brain Research Program durch die National Research Foundation (NRF), finanziert vom koreanischen Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (Zuschüsse NRF-2015M3C7A1028790); und durch einen Zuschuss aus dem Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziert vom Ministerium für Gesundheit und Soziales, Republik Korea (HI14C3347).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mittlere Bauteile
DMEM/F12 Gibco11320-033+L-Glutamin, +Natriumbicarbonat
Pen/StrepInvitrogen15140-122
N2 SupplementGibco17502-048
B27 SupplementGibco17504-044
Growth factor
bFGFR& D233-FB
GibcoPHG0313
Buffer
PBS (10x)BIOSOLUTIONBP007a1x Verdünnung
HBSSGibco14175-095
Dissoziationspuffer
Dispase IIRoche04-942-078-001
PapainWorthington3126
AccutaseICTAT-104
Tool
FeinzangeWPI555229F
SchereStorzE3321-C
Gehirnmatrix (1 mm)RWD68707
Zweischneidiger RasiererDORCOST-300
30 G NadelSUNGSHIMN1300
Materialien
15 ml RöhrchenSPL50015
50 ml RöhrchenSPL50050
35 mm SchaleSPL10035Petrischale
100 mm SchaleSPL10090Petrischale
Deckglas (18 mm)Deckglaser111580
12-Well-SchaleSPL32012nicht beschichtet
6-Well-SchaleSPL32006non-coating
Beschichtungsmaterialien
PLOSigmaP49570,01%
LamininGibco23017-01510 mg/ml
Primäre Antikörper 
NestinMilliporeMAB353Maus (1:1.000)
EGFRAbcamab2430Kaninchen (1:1.000)
DCXSanta CruzSC8066Ziege (1:500)
Tuj1SigmaT2200Kaninchen (1:2.000)
GFAPInvitrogen13-0300Ratte (1:1.000)
O4MilliporeMAB345Maus (1:500)
BrdUAbcamab6326Ratte (1:500)
Sekundäre Antikörper
Anti-Maus 488InvitrogenA212021:500
Anti-Maus cy3Jackson715-165-151
Anti-Maus 647Jackson715-606-150
Anti-Kaninchen 488AlexaA21206
Anti-Kaninchen cy3Jackson711-165-152
Anti-Kaninchen 647Jackson711-605-152
Anti-Kaninchen 488AlexaA11055
Anti-Kaninchen cy3Jackson705-165-147
Anti-Kaninchen 647InvitrogenA21447
Anti-Ratte 488InvitrogenA21208
Anti-Ratte cy3Jackson712-166-150
Anti-Ratte 647Jackson712-605-153
Immunfärbematerialien
BSAMillipore82-100-63% BSA mit 0,1% Triton X-100 in PBS
Triton X-100usb22686
4% PFABiosesangP2031
Hoechest33342Life TechnologyH3570Farbstoff zum Färben von Zellkernen

Referenzen

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