Method Article

Studium dynamischer Prozesse von Nano-Größe Objekte in Liquid Scanning Transmission Electron Micros mit

DOI:

10.3791/54943

⸱

February 5th, 2017

 , 
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, University of Saarland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt den Betrieb eines Flüssigkeitshalteströmungs Probe zum Abtasten Transmissionselektronenmikroskopie von AuNPs in Wasser, wie für die Beobachtung von nanoskaligen dynamischen Prozessen.

Abstract

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Die Proben vollständig in Flüssigkeit eingebettet sind, bei einer nanoskaliger Ortsauflösung mit Scanning Transmission Electron Micros (STEM) unter Verwendung einer mikrofluidischen Kammer in dem Probenhalter für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und STEM montiert sucht werden. Das mikrofluidische System besteht aus zwei Silizium-Mikrochips dünne Siliziumnitrid (SiN) Membranfenster unterstützen. Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Schritte der Probenbeladung und Datenerfassung. Am wichtigsten von allem ist, um sicherzustellen, dass der Flüssigkeitsraum richtig zusammengebaut ist, wodurch eine dünne Flüssigkeitsschicht und eine Vakuumdichtung bereitstellt. Dieses Protokoll umfasst auch eine Anzahl von Tests erforderlich während der Probenladedurchzuführen, um eine korrekte Montage zu gewährleisten. Sobald die Probe in das Elektronenmikroskop eingelegt ist, muss die Flüssigkeitsdicke gemessen werden. Fehlerhafte Montage in einer zu dicken Flüssigkeit führen kann, während eine zu dünne Flüssigkeit die Abwesenheit von Flüssigkeit, beispielsweise wenn eine Blase gebildet hinweisen. Schließlich wird das Protokollerklärt, wie Bilder gemacht und wie dynamische Prozesse untersucht werden können. Eine Probe AuNPs enthält, wird sowohl in reinem Wasser und in Kochsalzlösung abgebildet.

Introduction

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Herkömmliche Scanning Transmission Electron Micros (STEM) wird durch den Bereich von Proben geeignet für die Analyse, insbesondere die trockenen und festen Proben geeignet für die Platzierung in einem Hochvakuum begrenzt. Allerdings betreffen viele wissenschaftliche und technologische Fragen nanoskaligen Materialien und Prozesse in flüssigen Umgebung. In flüssigen Proben können vollständig eingebettet nun mit STEM mit einem Konzept untersucht werden , die eine mikrofluidische Kammer in dem Probenhalter für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und STEM 1 montiert beinhaltet. Dieses neu entwickelte Technik immer beliebter geworden, da sie neue Einblicke in wichtige Prozesse verschiedener Forschungsthemen, einschließlich dem Wachstum, Auflösung und Aggregationsprozesse von Nanopartikeln 2, 3, 4, 5, 6. Nicht nur Metalle, sondern auch biominerals 7 und biologische Systeme 8, 9, 10, 11 untersucht werden. Die Probenbeladung und Bildaufnahme für Flüssigphasen-STEM ist anders als bei STEM von trockenen Proben und beinhalten ein Protokoll, das spezielle Ausbildung erfordert.

Das mikrofluidische System besteht aus zwei Silizium - Mikrochips Stütz Siliziumnitrid (SiN) Membranfenster transparent für den Elektronenstrahl bei 200 keV Energie 12 (siehe 1A). Details zu den Abmessungen und der Umgang mit diesen Mikrochips kann an anderer Stelle 12 gefunden werden, 13. Die Probe enthält in der Regel nanoskalige Objekte. In diesem Papier haben wir beobachtet, Gold-Nanopartikel (AuNPs). Die AuNPs werden oben Fenster (in Bezug auf eine nach unten fahrenden Elektronenstrahl) oder schweben in der liqu immobilisiertIch würde. Nanoskaliger Ortsauflösung in STEM wird durch Abtasten des Elektronenstrahls über die AuNPs und das Sammeln übertragen gestreuten Elektronen mit dem Ringförmige Dunkelfeld (ADF) Detektor 9 erhalten. Die beiden Mikrochips werden in einem kleinen Schlitz in der Spitze des Flüssigkeitsströmungs TEM Halter 1 (der Halter arbeitet sowohl STEM und TEM aber als TEM Halter bezeichnet) angeordnet. Einer der Mikrochips enthält, einen Abstandshalter, so daß ein Flüssigkeitsraum zwischen den Mikrochips geformt ist. O-Ringe an beiden Seiten der beiden Mikrochips bereitzustellen Vakuumieren des Flüssigkeitsraum 13 (siehe 1B).

Das Ziel dieses Artikels ist es, die grundlegenden Schritte der Probenbeladung und die Datenerfassung zu zeigen, so dass interessierte Nutzer einen einfachen Zugang zu dieser aufstrebenden neuen Technik finden. Ein System, erhältlich von einem bestimmten Unternehmen verwendet wird, aber das Protokoll gilt auch für Systeme anderer Unternehmen. Die Technik istkomplexer als herkömmliche TEM und STEM, und eine Reihe von praktischen Aspekte müssen berücksichtigt werden , wenn es mit einem flüssigen Haltersystem 13 arbeiten. Am wichtigsten von allem ist, um sicherzustellen, dass der Flüssigkeitsraum richtig zusammengebaut ist, wodurch eine dünne Flüssigkeitsschicht und eine Vakuumdichtung bereitstellt. Daher ist es sehr wichtig, sauber zu arbeiten und die Staubbildung während der Herstellung und Montage des Flüssigkeitsströmungs TEM Halter zu verhindern. Insbesondere müssen die O-Ringe und die beiden Silizium-Mikrochips von Verunreinigungen frei zu sein. Selbst kleine Staubteilchen auf einem der Mikrochips kann stark die Dicke der zusammengebauten Zelle zu erhöhen, die das Erreichen einer nützlichen räumliche Auflösung zu verhindern. Eine Vakuumdichtung ist wichtig, so dass keine Verschmutzung oder Beschädigung wird im Elektronenmikroskop nach dem Versuch verbleiben. Dieses Protokoll beschreibt den Ladevorgang und mehrere notwendigen Tests. Der Betrieb des Elektronenmikroskops ist einfach, but es erfordert einige zusätzliche Schritte im Vergleich zu Mikroskopie von festen Proben. Mit zunehmender Flüssigkeitsdicken werden mehr Elektronen absorbiert und von der Flüssigkeit gestreut; eine Messung der Flüssigkeitsdicke ist wesentlich. Schließlich erklärt das Protokoll, wie Bilder aufgenommen und wie dynamische Prozesse untersucht werden können.

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Abbildung 1: Flüssigkeitsdurchflusszelle für Scanning Transmission Electron Micros (STEM). (A) Schematische Darstellung der zusammengesetzten Flüssigkeit Zelle. Zwei Siliziummikrochips mit Siliziumnitrid (SiN) -Membran Fenster sind zwischen zwei O-Ringen angeordnet. Die Flüssigkeit wird zwischen der SiN-Membran eingeschlossen und somit von dem Unterdruck in dem Elektronenmikroskop getrennt. Ein fokussierter Elektronenstrahl tastet die Probe. Der Kontrast wird von gestreuten Elektronen erhalten. Gold-Nanopartikel (AuNPs) an der SiN-Membran in der Flüssigkeit immobilisiert, kann aber auch in der BewegungFlüssigkeit. (B) Schematische Seitenansicht Querschnitt des Stapels von zwei Mikrochips mit O-Ringen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

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Abbildung 2: Reinigungsverfahren der Si - Mikrochips. (A) Zwei Becher werden mit 40-60 ml Aceton und Ethanol gefüllt jeder. (B) Die Si - Mikrochips werden in das Becherglas mit Aceton gefüllt war . Die Seite mit der SiN-Membran sollte nach oben zeigen. Die Reflexion der beiden Si-Mikrochips zeigt deutlich die Nut an der Rückseite von zwei Mikrochips. (C) Nach 2 min werden die Si - Mikrochips zu dem zweiten Becherglas mit Ethanol gefüllt übertragen. Nach weiteren 2 min werden die Si-Mikrochips zu einer Reinraumgewebe zum Trocknen überführt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3: Liquid Flow Transmission Electron Microscopy (TEM) Halter Ausrüstung. (A) Der Flüssigkeitsstrom TEM Halter mit Kunststoffschlauch und einer Spritze für einen Flüssigkeitsstrom. (B) Die Spitze des Flüssigkeitshalteströmungs TEM von der Halterwelle entfernt, der Deckel des Flüssigkeits Zellkompartiment, O-Ringe und zwei Siliziummikrochips. Der Schlauch ragt von der linken Seite der Spitze. (C) Das flüssige Zellkammer zeigt einen O-Ring, der Steckplatz für die Mikrochip - Platzierung. (D) Verschiedene Pinzette auf eine staubfreie Oberfläche (Aluminiumfolie). (E) Der Deckel des Flüssigkeits Zellkompartiment mit zwei O-Ringen. (F) Zwei Silizium - Mikrochips mit SiN - Membran - Fenster. Links: die Probe Mikrochip ohne Spacer; rechts: die Abdeckung Mikrochip mit einem 200 & mgr; m Spacer. (G) Eine mikrofluidische Pumpensystem. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses figu anzuzeigenRe.

1. Herstellung der Mikrochips

1. Reinigung der Mikrochips

  1. Bereiten Sie einen Arbeitsplatz mit einem niedrigen Staubgehalt in einem laminaren Luftstrom Haube mit einem Staub Partikelfilter.
  2. Reinigen Sie eine Lichtmikroskopie Glasobjektträger mit einem faserfreien Tuch und reinem Ethanol für die Platzierung und den Transport der Mikrochips. Legen Sie die Objektträger aus Glas auf einem Reinraum Gewebe in einer Petrischale.
    HINWEIS: Vermeiden Sie technische Ethanol jederzeit verwenden.
  3. Wählen Sie 5 Basismikrochips (ohne Spacer) für die Probenplatzierung und 5 Mikrochips mit einem Abstandhalter 200 nm dick.
    HINWEIS: Die Fensterabmessungen sind 20 x 400 & mgr; m 2 und die SiN - Dicke beträgt 50 nm. Da gibt es eine gewisse Toleranz von den Dimensionen ist, wird empfohlen, die Abmessungen mit einem Lichtmikroskop zu überprüfen.
  4. Verwenden Sie Kohlenstoff beschichteten Pinzette die Mikrochips aus dem Aufbewahrungsbehälter zu entfernen und legen Sie sie auf dem Glasträger. Besorgen Sie sich die Mikrochips fest, aber sorgfältig auf ihre long Seiten. Gehen Sie mit dem Mikrochip, so dass die SiN Membranseite immer nach oben zeigt.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die fragile SiN-Membran auf der oberen Seite zu berühren. Seien Sie auch vorsichtig mit den Mikrochips Umgang mit ihren scharfen Kanten zu vermeiden, Risse, die Probleme aufgrund von Siliziumpartikeln mit Wohnsitz auf dem Mikrochip oder auf spätere Leckagen führen kann.
    HINWEIS: für das Verfahren Schulung der Mikrochips aus der klebrigen Oberfläche zu entfernen, kann auf (billig) Dummy-Mikrochips durchgeführt werden.
  5. Platzieren Sie die Mikrochips auf eine Reinraum Gewebe in einer Petrischale. Schließen Sie die Schale und überträgt es auf den Abzug.
    HINWEIS: Die Schritte Aceton beinhalten, werden in einem Abzug für die chemische Sicherheit durchgeführt.
  6. Nehmen Sie zwei 120-ml-Glasbecher. Spülen einem Becherglas mit Aceton und das andere mit Ethanol um sie zu reinigen. Füllen Sie das erste mit 40-60 ml Aceton und das andere mit 40-60 ml Ethanol.
    HINWEIS: Es ist wichtig, HPLC-Qualität Flüssigkeiten auch für diesen Schritt in dem Protokoll zu verwenden.
  7. ÜbertragungDie Mikrochips in das Becherglas mit Aceton, um die Schutzschicht zu entfernen, widerstehen. Bewegen Sie den Becher mit der Hand , um wirksam die Mikrochips spülen, aber sein nicht vorsichtig , um die Mikrochips den Kopf zu stellen - siehe Abbildung 2.
  8. Nach 2 min, die Mikrochips entfernen und packe sie schnell in den Becher mit dem Ethanol. Bewegen Sie den Becher mit der Hand mit Ethanol für 2 Minuten keine Reste der Lackschicht zu entfernen. Decken Sie den Becher mit Aluminiumfolie und überträgt es auf den laminaren Luftstrom Werkbank.
    HINWEIS: Lassen Sie sich nicht die Mikrochips während der Übertragung austrocknen die Ablagerung von Schmutz zu vermeiden.
  9. Entfernen Sie die Mikrochips aus dem Becher und legen sie auf ein neues Reinraumgewebe. Lassen Sie sie für ein paar Minuten trocken und übertragen die Mikrochips auf dem Lichtmikroskop Glasobjektträger in der Petrischale.
    HINWEIS: Die nassen Mikrochips lässt sich einfach um umdrehen, den Kopf zu stellen, oder auf die Pinzette haften, wenn sie losgelassen wird. Dies kann durch pres vermieden werdenDie Mikrochips weich auf dem Filterpapier singen und die Pinzette weg in horizontaler Richtung ziehen.
  10. Schließen Sie die Petrischale und übertragen die Mikrochips auf dem Plasma-Reiniger.
  11. Setzen Sie den Glasobjektträger mit den Mikrochips in das Plasma-Reiniger. Führen Sie einen 5 min Reinigungsprogramm die Oberfläche des Siliziumnitrid-Membran hydrophil zu machen und Kohlenwasserstoffe zu entfernen.
    HINWEIS: Geeignete Einstellungen für unsere Plasmareiniger aufgetragen sind: 70 mTorr Gasströmung von 11,5 sccm für O 2 und 35,0 sccm für Ar, 50 W Vorwärts Radio Frequency (RF) Ziel, 5 W HF - Bereich und max RF reflektiert. Jede Plasma fähig ist, eine Oberflächenladung induziert, ist geeignet.
  12. Setzen Sie den Glasobjektträger mit dem Mikrochip zurück in die Petrischale, den Deckel schließen, und überträgt es auf dem Lichtmikroskop.
  13. Untersuchen Sie die Mikrochips unter einem Lichtmikroskop für mögliche Membran platzt oder verbleibenden Schmutzpartikel. Besondere Vorsicht bei den Fensterflächen und prüfen, ob kleine Flecken anzeigt arupture der Membran. Entlassen Mikrochips mit beschädigten Membranen.
  14. Schließen Sie die Petrischale und speichern sie in der laminaren Luftstrom Werkbank.

2. Herstellung der Probe auf den Mikrochips

  1. Bereiten Sie eine wässrige Lösung AuNP (Citrat stabilisiert) durch geringe Mengen der Stammlösungen Mischen mit 30 nm Durchmesser, Citrat-stabilisierten AuNPs bei einer Konzentration von ~ 3 M.
  2. Legen Sie die Mikrochips auf einer sauberen, klebrigen Oberfläche in einer Transportbox für Tröpfchen application / Probe Ablagerung.
  3. Platzieren eines Tropfens (1-2 ul) der Probenlösung auf der SiN Membranseite des frisch plasma gereinigt Mikrochip (mit einem Mikrochip ohne Abstandshalter) und die Lösung trocken im Luftstrom laminar Werkbank lassen.
    Hinweis: Dieses Verfahren kann wiederholt werden, um die Konzentration von AuNPs auf der SiN-Membran zu erhöhen.
  4. Anwenden 1 ul deionisiertem Wasser auf dem Mikrochip zur Entfernung von Salz und / oder Tenside. Nach 30 s, sorgfältigdie Wassertropfen mit Filterpapier entfernen. Lassen Sie die Mikrochips in der Luft in der laminaren Luftstrom Werkbank trocknen.
    Hinweis: eine ausreichend große Anzahl von AuNPs wird auf dem Mikrochip eingehalten haben und nicht mehr weg in Wasser gewaschen werden.
  5. Verwenden Sie die vorbereiteten Probe Mikrochips innerhalb von 4 h, wie die SiN seine hydrophiliert Oberflächeneigenschaften im Laufe der Zeit verliert, die die Flüssigkeit verursachen kann während eines Experiments zu verhalten sich anders. Hinweis: Siehe, um weitere Informationen zu den Diskussionsteil.
  6. Verwenden Sie eine geschlossene Transportbox für die Speicherung und Übertragung der Mikrochips.

2. Vorbereitung des Liquid Flow TEM-Halter

  1. Reinigen des Flüssigkeitsstrom TEM Halter
    1. Reinigen Sie alle Werkzeuge (Pinzette und Schraubenzieher), die in Kontakt mit Vakuum Teile unter Verwendung von Aceton und Ethanol in einem Ultraschallbad sein wird, und legen sie auf die staubfreie Oberfläche durch ein Stück neue Aluminiumfolie platziert auf der Werkbank zur Verfügung gestellt. Die Arbeit mit HandschuhenKontaminierung des Flüssigkeitsströmungs TEM Halter zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Werkzeuge müssen nicht ausgiebig gereinigt werden, wenn man sicher ist, dass sie für die Arbeit mit Vakuum Teile sauber sind. Handschuhe können vermieden werden, wenn man die Ausrüstung der Handhabung ohne Berührung der Vakuumteile fähig ist.
    2. Platzieren Sie den Flüssigkeitsstrom TEM Halterung unter dem binokularen Lichtmikroskop in der Weise, dass die Spitze des Halters der Flüssigkeitskammer enthält, beobachtet werden kann. Siehe Abbildung 3.
    3. Entfernen Sie den Deckel des Halters Spitze und legen Sie es auf die staubfreie Oberfläche.
      HINWEIS: Die Titan-Deckel gegen Kratzer empfindlich ist durch härtere Materialien wie die Pinzette verursacht. Es wird empfohlen, polymerbeschichteten Pinzette für empfindliche Materialien zu verwenden.
    4. Bereiten Sie mindestens 1-2 ml reinem Wasser (HPLC-Qualität).
      HINWEIS: Wenn eine HPLC-Qualität Flüssigkeit nicht verwendet, so empfiehlt es sich zu prüfen, ob die verwendeten Flüssigkeiten enthalten keine Mikropartikel, die möglicherweise zu Verstopfungen des Strömungssystems führen könnte; filter die Flüssigkeit, wie mit einem Mikroporenfilter benötigt.
    5. Verwenden Sie eine Glasspritze (1 ml), um das gesamte Flusssystem mit 0,5 ml reinem Wasser zu spülen. Es wird empfohlen, eine mikrofluidische Spritzenpumpensystem zu verwenden. Verwenden Sie eine Pipette und / oder Filterpapier, um die Flüssigkeit zu entfernen in der flüssigen Zellkammer ausgestoßen wird. Prüfen Sie alle Schläuche für einen Flüssigkeitsstrom. Trocknen Sie die Halter Spitze danach mit Filterpapier und / oder einer Pipette.
    6. Verwenden Sie das Lichtmikroskop zu überprüfen, dass die Spitze des Halters sauber und trocken ist. Bei Bedarf waschen Sie die Spitze des Halters mit Wasser oder Ethanol keine feste Rückstände zu entfernen, die hinterlassen wurden von der getrockneten Lösung hinter könnten. Entfernen Sie Stücke von Staub oder Reste von Fasern als auch. Entfernen Sie vorsichtig, diese Stücke mit einer Pinzette, damit die Vermeidung der Titanoberfläche verkratzen. Überprüfen Sie auch innerhalb der O-Ring-Nuten und die Reste der Flüssigkeit zu entfernen mit einem kleinen Stück Reinraum- Gewebe.
      HINWEIS: Wenn der Halter mit diesem Verfahren nicht sauber zu werden, dann ist es empfehlenswert,die Spitze aus der Halterung und reinigen in Aceton für 2 min und in Ethanol für weitere 2 min unter Verwendung eines Ultraschallbades zu entfernen.
    7. Überprüfen Sie alle weiteren Teile der Spitze (O-Ringe, Deckel und Schrauben) unter dem Lichtmikroskop und Entfernen von Staub, Fasern, etc ...
      HINWEIS: Gelegentlich kleine Stücke von den Schrauben oder die Si-Mikrochips mit Ursprung ebenfalls entfernt werden. Reinigen Sie bei Bedarf kurz die Vakuumteile mit HPLC-Qualität Ethanol. Der Deckel und die Schrauben können mit Ultraschall gereinigt werden, da für die Spitze erläutert. Vermeiden Sie die O-Ringe häufig in Ethanol auf, da es die O-Ringe der Zeit brüchig machen können, verringern ihre Vakuumdichtigkeit. Das System wird ohne Vakuumfett betrieben, aber wenn Dichtungsprobleme auftreten, können Vakuumfett verwendet werden.
    8. Setzen Sie die O-Ringe in die entsprechenden Nuten des Halters und prüfen, ob sie passen und stehen nicht auf jeder Seite der Nut.
    9. Halten Sie den Flüssigkeitsstrom TEM Halter frei von Staub , bis der Probenbeladung (zB., Indem sie sie mit Aluminiumfolie) abdecken.
  2. Montage der Flüssigkeitsstrom TEM Halter
    HINWEIS: Das folgende Verfahren beschreibt den Ladevorgang von Mikrochips in einem Probenhalter mit optimaler Orientierung für STEM. In dieser Konfiguration wird die Basis-Mikrochip mit der Probe, sobald die obere Mikrochip in das Mikroskop übertragen werden. Siehe Abbildung 4. Für TEM, die höchste räumliche Auflösung wird am Boden der Flüssigkeitszelle in Bezug auf eine Abwärtsbewegungs Elektronenstrahls erhalten. Somit würden die Mikrochips, die umgekehrt montiert ist.
    1. Verwenden Sie gebogene Pinzette, um die Probe Mikrochip auf der langen Seite zu packen und legen Sie sie in den Schlitz (Tasche) in der Spitze des Flüssigkeitsströmung TEM Halter. Halten Sie die SiN Seite nach oben. Überprüfen Sie die korrekte Platzierung des Mikrochips in den Schlitz ein Fernglas Lichtmikroskop.
      HINWEIS: Wenn der O-Ring unter dem Mikrochip nicht richtig platziert ist, kann der Mikrochip herausragen fROM mit dem Schlitz.
    2. Platzieren eines Tropfens von 0,3 & mgr; l der gefilterten Flüssigkeit für das Experiment an der Probe-Mikrochip mit einer Mikropipette. Falls erforderlich, befestigen Sie den Mikrochip an Ort und Stelle mit einer Pinzette, da die Kapillarkräfte des Tropfens kann der Mikrochip aus seiner Tasche zu ziehen.
    3. Verwenden der Oberseite nach unten gebogenen Pinzette den zweiten Mikrochip (der mit der Abstandsschicht) zu nehmen. Vorsichtig umdrehen den Mikrochip. Setzen Sie den Abstandshalter Mikrochip auf der Basis Mikrochip in den Schlitz ein.
      Hinweis: Dieses Verfahren getan werden muss ausreichend schnell die Trocknung des Tropfens auf dem Probenmikrochip zu vermeiden.
    4. Überprüfen Sie die korrekte Platzierung eines binokularen Lichtmikroskop, während ein Stück lichtreflektierendes Material unterhalb der Spitze des Probenhalters zu bewegen. Beide Mikrochips ausgerichtet werden müssen exakt parallel die beste Überlappung der SiN Fenster zu erreichen.
      HINWEIS: Falls die Fenster nicht überlappen, können die Mikrochips durch Drücken an einer Seite mit einer Spitze neu positioniert werdendie Pinzette, aber vermeiden, dass die Mikrochips zu viel bewegen, wie die SiN-Membran leicht beschädigt werden können. Einige Mikrochips sind mit einer gekreuzten Konfiguration (das Fenster von einem Mikrochip senkrecht zu dem Fenster in dem anderen Mikrochip); Diese Konfiguration erleichtert die Ausrichtung der beiden Mikrochips noch verringert auch das Sichtfeld in dem Elektronenmikroskop.
    5. Nehmen Sie die Vorderseite des Probenkammerdeckel mit der Pinzette und umdrehen. Ohne die Mikrochips zu berühren, legen Sie die Rückseite des Deckels an der Spitze. Öffnen Sie langsam die Pinzette in einer Weise, dass der Deckel nur auf dem unteren Zweig der Pinzette aufliegt. Sie vorsichtig den Deckel nach unten, bis es auf den beiden Mikrochips ruht. Entfernen Sie die Pinzette.
    6. Überprüfen Sie die Ausrichtung der Fenster der beiden Mikrochips. Falls erforderlich, entfernen Sie den Deckel, passen Sie die Positionierung der Mikrochips, und positionieren Sie den Deckel wieder.
    7. Setzen Sie die Schrauben und befestigen Sie sie in ihren üblichen Plätzen. Überprüfen Sie die Ausrichtung der beiden Fenster. ichf erforderlich, entfernen Sie die Schrauben wieder fest und die Mikrochips einzustellen.
      HINWEIS: Die Schrauben nicht zu fest fixieren, da dies zu Schäden führen kann. Eine Vakuumdichtung wird erreicht, wenn die Schrauben nur anziehen.
    8. Überprüfen Sie die Abdichtung durch einen Flüssigkeitsstrom durch das System Initiieren einer Fließgeschwindigkeit von 4 & mgr; l / min verwendet wird. Wenn keine undichten auf beiden Seiten der Spitze beobachtet wird, ist dies ein guter Indikator für die Vakuumdichtigkeit.
    9. Bringen Sie die Halterung an der Vakuumpumpstation und überprüfen Sie die Vakuumdichtigkeit. Das Vakuum sollte mindestens 10 -5 mbar innerhalb von 5 min von Pump erreichen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, vor der Verwendung der Pumpstation mit einem Dummy-Halter zu testen.
    10. Bringen Sie die Halterung an dem Elektronenmikroskop in seinem Gehäuse aus Sammeln von Staub zu verhindern.
      HINWEIS: Jede kommerzielle Halter kommt mit einem Gehäuse.

3. STEM einer Probe in Flüssigkeit

  1. Einstellen des Elektronenmikroskops für STEM HINWEIS: Der Betrieb des Elektronenmikroskops in diesem Protokoll beschrieben ist, auf Standardverfahren beruhen, die in der Bedienungsanleitung zu finden sind. Das Protokoll beschreibt die erforderliche Detail über Standardverfahren für die Datenerfassung auf flüssigen Proben.
    1. Starten Sie das Mikroskop mit STEM-Modus ausgerichtet. In der Probenhalter, legen Sie eine Testprobe aus einer dünnen Kohlenstoffschicht mit AuNPs. Passen Sie die Einstellungen des MINT-Mikroskop wie folgt: Stellen Sie die Sondenstrom auf 0,18 nA und die Konvergenz-Halbwinkel des Elektronenstrahls auf 20 mrad durch eine Punktgröße von 4C auswählen und auf die Objektivöffnung von 30 um. Wählen Sie eine 8 cm Kameralänge.
    2. Notieren Sie sich die auf dem Fluoreszenzschirm gemessenen Stromdichte angegeben, während der ADF-Detektor eingesetzt wird. Entfernen Sie den Probenhalter.
      HINWEIS: Dieser Stromwert benötigt wird, später von der Dicke der Flüssigkeit zu bestimmen.
    3. Starten Sie den Flüssigkeitsstrom mit reinem Wasser. Verwenden Sie keinen Strom von 2 überschreitenul / min.
    4. Setzen Sie den Flüssigkeitsstrom TEM Halter in das Elektronenmikroskop und starten Evakuierung. Überprüfen Sie sowohl die Vakuum Anzeige der Vorvakuumkammer und die Dauer der Evakuierung. Wenn das Vakuumniveau Standard ist und die Dauer des Pumpvorgang nicht die normale Evakuierungszeit überschreiten (von ca. 1 min) um einen Faktor von zwei, legen Sie die Halterung.
    5. Öffnen des Strahlventil, wenn das Vakuum der Hauptprobenkammer in einem Bereich ist, der seine Öffnung ermöglicht. Legen Sie die ADF-Detektor durch die ADF-Taste drücken.
      HINWEIS: Dieses Protokoll zu einem ADF-Detektor bezieht sich oberhalb der Phosphorschirm des Elektronenmikroskops positioniert.
    6. Stellen Sie das Mikroskop in kontinuierlichen Bildaufnahmemodus eine Bildgröße von 512 x 512 Pixeln, eine Pixelverweilzeit von 2 & mgr; s, und mit einer Vergrößerung von 20.000 verwendet. Die Suche nach dem SiN-Fenster durch die Stufe in der x und y-Richtung zu übersetzen.
      HINWEIS: Die Mikrochips alle Elektronen blockieren, die durch die Probe auf die Erkennungoder; Signal steht an der Stelle der SiN nur sichtbar. Siehe Abbildung 5. Manchmal ist es einfacher, die SiN-Fenster finden, indem die Fluoreszenz-Bildschirm angezeigt wird.
    7. Sobald das Fenster gefunden wurde, stellen Sie die Kontrast- und Helligkeitseinstellungen (die entsprechenden Knöpfe verwendet wird), so dass der Rand des Fensters sichtbar wird. Bewegen, um die Kante in Richtung der Mitte des Sichtfeldes durch Betätigung der x- und y-Translation Tasten des Probentisches. Drücken Sie die Reset-Taste des Objektivs.
      HINWEIS: Die Helligkeit muss weitgehend im Vergleich zu einer Vakuumprobe in der Flüssigkeit aufgrund der starken Streuung reduziert werden.
    8. Gehen durch Grob die scharfe Ecke am Rand des Fensters SiN Fokussierung durch die vertikale Positionseinstellmechanismus (z-Translation) des Probentisches. Stellen Sie sicher, dass die Probenposition durch Drehen der Bühne an der euzentrischen Höhe von 5 ° und Drehen zurück. Eigenschaften der Probe und der Ecke des SiN-Fenster bei niedrigen Vergrößerungen nicht verschieben sollte.
    9. Nachjustieren die vertikale Position nach Bedarf wieder die Fensterkante in der Mitte des Betrachtungsbereich zu platzieren. Speichern Sie die Position der Bühne den Speicherknopf, der Software.
    10. Bewegen zu einer Position , in kleine Stücke von Schmutz oder anderen Gegenständen mit hohem Kontrast (beispielsweise AuNPs) vorhanden sind , um die Bühne in der x und y - Richtung zu übersetzen. Stellen Sie den Fokus der Objektivlinse so, dass alle Objekte scharf im Fokus erscheinen.
    11. Notieren Sie sich die Stromdichte an der Phosphorschirm gemessen sichtbar über die Betriebssoftware, welche die übertragenen Strom durch die Flüssigkeitsaufnahme und durch die Öffnung des ADF-Detektor. Berechnen Sie die Dicke der Flüssigkeitszelle unter Verwendung von Gleichung 1 nur gehen, wenn die Flüssigkeitsdicke bestimmt wurde und nicht mehr als 3 & mgr; m.
      14
      figure-protocol-3 Gleichung 1
      SiN mit t die Dicke der amorphen Siliziumnitrid - Membran und t Wasser die Dicke der Wasserschicht. Die mittlere freie Weglänge beträgt l SiN = 0,79 & mgr; m von SiN, = und l Wasser = 3,0 um Wasser für den Detektor - Halbwinkel von 35 mrad 14 zu öffnen.
    12. Beachten Sie sorgfältig die Flüssigkeit bei niedrigen Vergrößerungen, um sicherzustellen, dass Gasblasen nicht vorhanden sind. Gasblasen können durch die Verwendung kontinuierlicher Flüssigkeitsstrom und Sondenstrom niedriger als 0, 5 nA verhindert werden.
    13. Übersetzen der Bühne in den x und y-Richtung bis zu einem Bereich mit mindestens 20 AuNPs has gefunden. Stellen Sie die Bildgröße auf 1.024 x 1.024 Pixel, die Pixel Verweilzeit bis 19 & mgr; s, und die Vergrößerung auf 400.000. Erwerben Sie Bilder von AuNPs an die SiN-Membran geklebt durch den Erwerb Taste drücken.
      HINWEIS: Sobald Bilder haben , in denen die AuNPs sichtbar sind mit starkem Kontrast und scharfen Kanten (siehe Abbildung 6) erhalten worden ist , kann man sicher sein , dass das Experiment richtig eingestellt ist. Bei unerwarteten Problemen kommen, fahren Sie nicht mit dem Experiment, aber stellen Sie sicher, um die Ursache zu beheben.
  2. STEM der Auflösung AuNPs
    1. Entfernen Sie den Flüssigkeitsstrom TEM Halter aus dem Mikroskop und den Flüssigkeitsstrom zu stoppen.
    2. Vorbereitung mindestens 1 ml einer Lösung von 0,1 M Natriumchlorid in HPLC-reinem Wasser in einer Glasspritze.
    3. Stellen Sie die Strömungssystem auf eine Geschwindigkeit von 20 ul / min und spülen das gesamte Strömungssystem mit 0,3 ml der Kochsalzlösung. Verwenden Sie Filterpapier, um die Flüssigkeit zu sammeln wird auf die ausgeworfeneandere Ende des Schlauchs. Danach neu zu justieren das Strömungssystem zu 2 & mgr; l / min.
    4. Überprüfen Sie die Integrität des SiN-Fenster mit einem binokularen Lichtmikroskop. Wenn kein Leck festgestellt wird, legen Sie den Flüssigkeitsstrom TEM Halter in das Mikroskop.
    5. Prüfen Sie die Vakuumanzeige der Pre-Vakuumkammer und die Dauer der Evakuierung. Wenn das Vakuumniveau Standard ist und die Dauer des Pumpvorgang nicht übersteigt die normale Evakuierungszeit (von etwa 1 min) um einen Faktor von zwei, legen Sie die Halter
    6. Bewegen Sie die Bühne hinter dem Mikroskop zurück in seine vorherige Position der gespeicherten Tischposition verwenden. Stellen Sie das Mikroskop in kontinuierlichen Bildaufnahmemodus eine Bildgröße von 512 x 512 Pixeln, eine Pixelverweilzeit von 2 & mgr; s, und mit einer Vergrößerung von 20.000-Verwendung. Stellen Sie den Kontrast, Helligkeit, Schärfe und euzentrischen Höhe, wie 3.1.7-3.1.9 in Schritten beschrieben.
    7. Suchen Sie einen Ort von Interesse auf der Bühne in der x- und y-Richtung zu übersetzen. Stellen Sie die Bildgrößezu 1.024 x 1.024 Pixel, der Pixelverweilzeit bis 2 & mgr; s, und die Vergrößerung auf 500.000. Nehmen Sie eine Reihe von STEM Bilder durch manuelles den Erwerb Taste drücken, sobald das vorherige Bild aufgenommen wurde.
      HINWEIS: Die AuNPs sobald der Elektronenstrahl über die Probe gescannt wird beginnen, sich aufzulösen. Partikel außerhalb des bestrahlten Bereichs sind davon nicht betroffen und kann sofort nach dem beobachtet werden. Der Zeitstempel wird in dem Bild-Header gespeichert. Es ist auch möglich, Software für die automatisierte Sammlung von einer Reihe von Bildern in einem Film zu verwenden.
  3. Auseinanderbauen und die TEM - Halter nach dem Versuch der Reinigung
    1. Wenn die Flüssigphasen-TEM Experimente abgeschlossen sind und der Halter aus dem Elektronenmikroskop zurückgezogen ist, reinigen die Schläuche, die Flüssigkeitskammer, und seine Komponenten, um jegliche feste Teilchen oder Restsalz zu entfernen, die zukünftige Experimente beeinflussen könnten.
    2. Lösen Sie die hintere Schraube leicht an, so dass es immer noch fixiert istin seinem Schlitz jedoch kann der Deckel leicht entfernt werden. Lösen Sie die vordere Schraube, entfernen Sie sie, und legen Sie sie in einer staubfreien Umgebung.
    3. Entfernen Sie den Deckel und legen Sie sie in staubfreien Umgebung für die Lagerung.
    4. Entfernen Sie die beiden Mikrochips aus der Tasche. Trennen Sie sie, indem Sie sie vorsichtig in Wasser oder in der verbleibenden Lösung des Experiments eintaucht. Legen Sie die Mikrochips auf Seidenpapier mit dem SiN Membranseite nach oben und lassen Sie sie zur weiteren Analyse in der Luft trocknen.
    5. Entfernen Sie die O-Ringe und reinigen Sie die entsprechenden Nuten mit HPLC-Qualität Wasser. Lagern Sie die O-Ringe in einer staubfreien Umgebung.
    6. Verwenden Sie eine Glasspritze (5 ml) Sie alle Schläuche zu spülen (Eingang und Ausgang), die jeweils mit 5 ml HPLC-Wasser. Sammeln Sie die Flüssigkeit mit einem kleinen Becher unterhalb der TEM-Halter Spitze platziert. Nach dem Spülen, verwenden Sie eine Pipette und / oder Filterpapier, die restliche Flüssigkeit aus dem Flüssigkeitsraum zu entfernen.
    7. Überprüfen Sie die Spitze des TEM-Halter und entfernen Sie Reste wie gebrochene Kanten des Silizium-MikroChips, Fasern oder Staub. Wenn Salz noch sichtbar ist, wiederholen Sie den Reinigungsvorgang. Bringen Sie die O-Ringe in ihre Rillen.
    8. Lagern Sie den TEM-Halter und seine Komponenten in einer staubfreien Umgebung.
  4. Verfahren Alternative zu 3.2: STEM von Gold - Nanopartikeln zu bewegen
    HINWEIS: Eine andere Montageverfahren erforderlich, um die Bewegung von AuNPs in Flüssigkeit zu studieren.
    1. Auslassen Schritt 1.2. Legen Sie die AuNPs auf dem Silizium-Mikrochip unmittelbar vor ihnen in der TEM-Halter in Schritt 2.2 eingeführt wird. Halten, die durch eine flüssige Schicht zu jeder Zeit abgedeckt, um Probe eine starke Befestigung der AuNPs an die SiN-Membran zu vermeiden. Die anderen Schritte des Protokolls sind die gleichen. Eine Reihe von MINT-Bilder wird in Schritt 3.2.6 erhalten.

figure-protocol-4
Abbildung 4: Montage des Liquid Flow TEM - Halter. (A) Das flüssige Zellfach mit the kleiner O-Ring in seiner Nut platziert. Der Einschub zeigt die Ansicht von oben. (B) Die Basismikrochip in der jeweiligen Fassung gebracht. Der Einschub zeigt die Seitenansicht in einem solchen Winkel, dass der Mikrochip von Lichtreflexion sichtbar ist. (CD) ein Tropfen der Lösung wird auf dem Mikrochip hinzugefügt. (EG) Platzierung der Abdeckung Mikrochip. (HALLO) Platzierung des Deckels des flüssigen Zellkompartiment. (J) Fixierung des Deckels mit den beiden Schrauben. (K) Flüssigkeitsstrom TEM Halter montiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5: Erste Positionierung und Fokussierung STEM Mikroskopische Aufnahmen verwenden. (A) , um das SiN Fenster zu suchen, ist die Bühne in Richtung der hellsten sig bewegtnal. Der Silizium-Mikrochip ist dünn genug für einige Elektronen durch das Fenster schließen zu übergeben. (B) Der Rand des fokussierten SiN Fenster einige AuNPs erscheinen hell auf dem dunklen (weniger Streuung) SiN Membranfenster zeigt. Der Rand des Mikrochips ist hell aufgrund einer übermäßigen Streuung. (C) Die Fokussierung erfolgt an der Ecke des SiN - Fenster. Die Bilder zeigen unter orientierten, im Fokus, und Situationen über konzentriert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Results

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Der Flüssigkeitsstrom TEM Halter wurde verwendet, um das Verhalten von AuNPs in Flüssigkeit zu studieren. AuNPs wurden auf der SiN - Membran in reinem Wasser stabil immobilisiert und mit nanoskaliger Auflösung unter Verwendung von Flüssigphasen - STEM (Abbildung 6) abgebildet. Ausgezeichnete Kontrast wurde auf der stark streu Gold erhalten. Die Stromdichte auf dem Leuchtstoffschirm für eine trockene Testprobe gemessen wurde, betrug 20 pA / cm², während es bis 8 pA / cm² mit dem Flüssigkeitsstrom TEM Halter eingeführt betrug. Unter Verwendung von Gleichung 1, t Wasser = 2,4 ± 0,5 & mgr; m, viel größer als das, was auf der Basis der Abstandshalterdicke von 200 nm zu erwarten war. Nichtsdestoweniger ist die Dicke nicht zu groß für die Abbildung der AuNPs mit Nanometer räumlicher Auflösung. Die Flüssigkeit Dicke war dicker als die nm 200 durch den Abstandshalter festgelegt aufgrund der SiN-Membranen, Unebenheit der Mikrochips zu prall und Schmutz auf den Mikrochips befinden.

16, obwohl reaktive Radiolyseprodukte (e - aq, H •, H +, OH •) , die aus der Wechselwirkung des Elektronenstrahls mit Wasser kann einzelne Goldatome, was zu einer Änderung der Form des 15 AuNPs oxidieren. Wenn jedoch das Flüssigkeitsströmungssystem wurde verwendet, Chloridionen in einem zweiten Experiment einzuführen, die Stabilität der AuNPs verändert. Chloridionen in der Lage sind oxidiert Goldatome in Form von tetrachloroaureat Stabilisierung AuCl 4 -. 7 zeigt , dass die AuNPs langsam während einer STEM - Bildgebung Zeitraffer-Serie gelöst, ähnlich zu den Ergebnissen 16 bereits berichtet. Für die verwendeten Elektronendosisleistung, es dauerte ~ 300 s die 30 nm großen AuNPs aufzulösen.

Die Bewegungen von AuNPs in wate r wurden in einem dritten Experiment (Figur 8) untersucht. Vor dem Experiment wurde der Flüssigkeitsstrom TEM Halter wurde, um jegliche Spuren von Salz zu entfernen gereinigt. Abweichend von dem ersten Experiment eine alternative Probe wurde Vorbereitungs Ansatz 14 eine schwächere Bindung der AuNPs auf die SiN - Membran zu erreichen. In diesem Experiment wurde die AuNP Lösung auf dem Silizium-Mikrochip angeordnet und in den Flüssigkeitsstrom TEM Halter zusammengebaut, ohne die Lösung trocknen gelassen. Auf diese Weise verwendet die AuNPs leicht aus der SiN-Membran bei der Bildgebung bei der Dosisrate abgelöst. Einige der AuNPs wegbewegt von dem Sichtfeld in die bulk-Lösungen, während die übrigen AuNPs innerhalb des Sichtfeldes in der Nähe des SiN Fenster blieb. Die Bewegungen dieser AuNPs wurden beobachtet, und schließlich sie agglomeriert. Nach einer Weile auch diese Agglomerate aus der SiN-Membran abgelöst und zog aus dem Blickfeld und in die Lösung.

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Abbildung 6: Scanning Transmission Electron Micros (STEM) Mikroskopische Aufnahme von AuNPs 30 nm im Durchmesser an der Spitze einer reinen Wasserschicht. Das gezeigte Bild ist ein ausgewählter Bereich des Originalbildes. Die Bildgröße 1.024 x 1.024 Pixel war, die Pixelverweilzeit betrug 19 & mgr; s betrug die Pixelgröße 0,73 nm, und die Vergrßerung war 400,000X. Die Elektronendosis betrug somit 7,1 x 10 4 e - / nm². Die Stromdichte auf dem Leuchtstoffschirm gemessen betrug 8 pA / cm 2, so dass die Flüssigkeitsdicke berechnet wurde auf 2,4 & mgr; m betragen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 7: Zeitraffer-Serievon STEM Mikroskopische Aufnahmen von AuNPs in Saline. (AD) Bilder von der Zeitraffer-Serie von MINT - Bilder in 30 s Intervallen extrahiert. Die AuNPs lösen sich allmählich in Flüssigkeit als Folge der Anwesenheit von Chloridionen. Die Pixelverweilzeit betrug 2 & mgr; s, die Rahmenzeit des Zeitserien wurde 1,75 s betrug die Pixelgröße 0,44 nm, und die Vergrßerung war 500,000X. Die Elektronendosis pro Bild betrug 1,2 x 10 4 e - / nm². Die Flüssigkeitsdicke betrug 2,4 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

figure-results-3
Abbildung 8: STEM Mikroskopische Aufnahme von AuNPs in reines Wasser bewegen. (A) SiN - Membran mit AuNPs, von denen mehrere mit Pfeilen markiert sind. (B) Bewegungsspurender ausgewählten AuNPs (siehe A). Einige AuNPs bewegen aus dem Sichtfeld während der Zeit der Bildgebung entfernt. Die übrigen AuNPs bewegen seitlich entlang der SiN-Membran und starten Agglomerations. Nach einer kritischen Clustergröße zu erreichen, versenden Sie sie von der Membran und weg von dem Gebiet der view.The Pixelverweilzeit wurde 1 & mgr; s, war die Rahmenzeit 0,52 s, war die Pixelgröße 1,8 nm und die Vergrößerung war 120,000X. Die Elektronendosis pro Bild betrug 3,5 x 10 2 e - / nm² und die Flüssigkeitsdicke betrug 2,4 um. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

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Das beschriebene Protokoll ermöglicht STEM von AuNPs in einer Flüssigkeit, einschließlich der Beobachtung dynamischer Prozesse. Der Zusammenbau des Halters ist ein leicht zu erlernende Technik. mehrere Aspekte müssen jedoch in Betracht gezogen werden, wenn sie mit dem Flüssigkeitsstrom TEM Halter arbeiten. Zum Beispiel gebrochene Kanten des Si-Mikrochip oder große Partikel auf den O-Ringen in Leckage der Flüssigzelle führen kann. Auf der anderen Seite, großen Teilchen (> 200 nm, zB Staub oder Si Debris) auf der SiN - Membran in einer erhöhten Dicke der Flüssigkeitszelle führen kann, was zu einer geringen Abbildungskontrast oder einer niedrigen räumlichen Auflösung und kann sogar dazu führen , SiN Fenster zu brechen. Wichtig ist das Ergebnis beeinflussen der Versuche kann, Rückstände von Salz oder anderen Chemikalien in unerwünschter Weise. Daher ist es entscheidend, dass die verschiedenen Schritte der Probenvorbereitung und Halteranordnung werden sorgfältig und in einem sauberen und staubfreien Umgebung durchgeführt.

Die Dicke der Flüssigkeit cell bestimmt die erreichbare Auflösung sowie den Kontrast der erhaltenen Bilder 17. Diese Dicke kann auf einer der beiden Si-Mikrochips angeordnet über Abstandshalter eingestellt werden. Je nach den Abmessungen der Probe, können unterschiedliche Dicken der Flüssigkeitszelle realisiert werden. Für die Untersuchung von AuNPs ist es möglich, kleine Abstandshalter (200-500 nm) zu verwenden, während die gesamte eukaryotischen Zellen benötigen größere Abstandshalter von bis zu 5 & mgr; m. Die Dicke der Flüssigkristallzelle wird durch die Ausbauchung der von der Druckdifferenz zwischen der Flüssigkeitszelle und dem umgebenden Vakuum resultierende Membran Fenster SiN beeinflusst. Dieser Effekt wird mehr mit größeren SiN Membran Fenster ausgeprägt. Somit wird, um die Dicke der Flüssigkeitszelle zu minimieren, wird empfohlen, Fenster kleine SiN-Membran zu verwenden. In Fall ist es schwierig, eine Überlappung zwischen zwei kleinen Fenster zu finden, können sie in einer gekreuzten Konfiguration zusammengebaut werden, um eine andere Basismikrochip verwendet wird. Alternative Konfigurationen largely verhindern prall und bestehen aus einem monolithischen Mikrochip 18 oder Membran , die durch Säulen 19 abgestützt Fenster, aber diese weisen Nachteile in Bezug auf Probenbeladung. Einer der schwierigsten Aspekte der gegenwärtigen Technologie ist die fehlende präzise Kontrolle über die Flüssigkeitsdicke. Oft wird die Flüssigkeit viel dicker als das, was von den Distanzmaße verwendet zu erwarten ist, wie es hier gezeigt ist. Mehrere Gruppen verwendet geschlossenen Flüssigkeitskammern 4, 20, 21, 22; Diese Systeme haben einige Vorteile in Bezug auf die räumliche Auflösung, da die Flüssigkeitsdicke durch Induzieren einer Blase in der Flüssigkeit reduziert werden kann. Alternativ können die SiN Fenster zum Einsturz gezwungen werden, zu einer dünneren Flüssigkeitsschicht führt. Drittens (Graphen zum Beispiel) das Gehäuse von anderen dünneren Fenstern besteht 23, auch in viel dünner Flüssigkeiten resultierendenals das, was mit dem System beschrieben, in diesem Protokoll möglich ist. Jedoch ist es unmöglich, Flüssigkeit in diesen Systemen zu fließen.

Wie für jede hochauflösende Mikroskopie Technik, müssen eine Reihe von experimentellen Aspekte berücksichtigt werden. Der wichtigste Aspekt ist die Wechselwirkung des Elektronenstrahls mit der Flüssigkeit oder der Probe. Zusätzlich zu Strahlenschäden, die die erreichbare räumliche Auflösung für viele feste Proben 24, die flüssigen Proben werden auch durch Elektronenstrahl-generierte Radiolyseprodukte 15, 25 beeinflusst begrenzt. Da diese Produkte das Experiment beeinflussen können, sorgfältige Interpretation der Daten und experimentellen Designs sind von wesentlicher Bedeutung 26. Die Mikroskop-Einstellungen sollten entsprechend den Zielen einer bestimmten Studie ausgewählt werden. ADF STEM ist leistungsfähiger für die Bildgebung Nanopartikel einer hohen Atomzahl (Z) in größeren Dicken der Flüssigkeitszelle, WHIle TEM ergibt einen besseren Kontrast auf Low-Z - Materialien und ist in der Regel schneller, erfordert aber dünner Flüssigkeitsschichten 3. Statt den ADF - Detektor verwendet wird , ist Hellfeld (BF) Detektor manchmal zu Bild , um die Flüssigkeit Zelle verwendet, da BF STEM zur Abbildung Low-Z Materialien in dicken Schichten 27 vorteilhaft ist. Mit zunehmender Dicke der Flüssigkeitszelle wird mehr Strom benötigt. Dies erhöht jedoch auch die Konzentrationen von Radiolyseprodukte und erhöht Strahlenschäden. Es sollte auch beachtet werden, dass eine Invertierung des Kontrastes in dem ADF-Detektor für sehr dicke Flüssigkeiten (> 10 um für Wasser) beobachtet.

Die flüssigen Bedingungen wurden zwischen unseren Experimenten verändert durch den Halter von dem Mikroskop zu entfernen und sowohl die Probe und die Flüssigkeit auszutauschen. Neben der Salzkonzentration zu ändern, ist es ohne weiteres möglich , andere Eigenschaften der Flüssigkeit zu ändern , indem in verschiedenen Flüssigkeiten fließen (beispielsweise kann manPufferlösungen verwenden , um einen bestimmten pH 16 eingestellt oder organischen Lösungen oder andere Additive einführen). Es ist auch möglich, die Flüssigkeit zu wechseln, während der Halter noch in das Mikroskop eingesetzt ist, indem Flüssigkeiten durch das Mikrofluidsystem fließt. Aber in diesem Fall ist es nicht bekannt, zu welchem ​​Zeitpunkt die Flüssigkeit an den Probenwechsel zeigen. Es ist auch bemerkenswert , dass Mikrochips Elektroden zur Verfügung stehen, so nanoskaligen Elektrochemie Experimente unterstützen kann 28 durchgeführt werden.

Die Studienobjekte sind nicht auf AuNPs in Wasser beschränkt, sondern eine Vielzahl von Proben kann unter Verwendung des oben beschriebenen Protokoll untersucht werden, einschließlich Siliciumdioxid, Titanoxid und Polymeren. Wenn Bewegungen der Objekte zu schnell sind innerhalb des Erfassungs in einem Bild zu erfassen, kann die Viskosität durch eine Größenordnung unter Verwendung einer Mischung aus 50% Glycerin und 50% Wasser reduziert werden.

Aus den oben genannten Punkte,eine Reihe von Vorteilen, Möglichkeiten und werden auch Nachteile offensichtlich. Wenn sie mit Flüssigphasen-STEM arbeiten, die wichtigsten Nachteile zu berücksichtigen sind, dass: 1) ein Experiment durch die dynamische Wechselwirkung des Elektronenstrahls mit der gesamten Probe (das Objekt unter Beobachtung, die Flüssigkeit und die SiN-Membranen) beeinflusst wird; 2) Probenhandhabung ist mühsam, und es ist oft schwierig, eine dünne Flüssigkeitsschicht zu erreichen, weil die Probe oder die Mikrochips einige Mikrometer große Partikel enthalten; 3) die Flüssigkeitsdicke unterscheidet sich in der Regel weitgehend von der beabsichtigten Dicke durch den Abstandshalter festgelegt; und 4) die räumliche Auflösung und Kontrast hängt stark von der Flüssigkeit Dicke und der Differenz zwischen der Änderungsdichte des Beobachtungsobjekts und der Flüssigkeit.

Gegenwärtig existieren reichlich Methoden für die Mikroskopie von Objekten in Flüssigkeit mit Nanometer-räumlicher Auflösung. Die Elektronenmikroskopie in amorphem Eis ist eine leistungsstarke Technik 29,aber die beteiligten experimentellen Verfahren sind empfindlich, nicht alle Experimente ermöglichen die Herstellung der Probe in Eis und zeitaufgelöste Experimente sind unmöglich. Röntgenmikroskopie 30, 31 könnte im Prinzip verwendet werden, aber es hat eine begrenzte räumliche Auflösung und ist nicht allgemein in Laboratorien zur Verfügung. Rasterkraftmikroskopie in Flüssigkeit wurde festgestellt , sondern ist eine Oberflächentechnik nur 32, 33, 34, 35. Die Lichtmikroskopie zeigt keine ausreichende räumliche Auflösung. In der Gegenwart Elektronenmikroskopie in Flüssigkeit scheint die leistungsfähige Technik für die direkte Mikroskopie von nanoskaligen Objekten und Prozessen in Flüssigkeit.

Flüssigphasen-TEM und STEM sind noch nicht Routine analytische Techniken sind aber noch in der Entwicklung. Die Anzahl der Parameter zu berücksichtigen, ist beträchtlich, und es ist often schwierig experimentellen Ergebnisse zu reproduzieren. Darüber hinaus ist die quantitative Daten schwierig zu erhalten, da die Effekte zu untersuchende mit Prozessen als Folge des Elektronenstrahls auftretenden miteinander verflochten sind. Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, das experimentelle Protokoll zu standardisieren, damit für alle relevanten Basis Aspekte des Experiments ausmacht. Wir hoffen, dass dieses Protokoll zu einer besseren Reproduzierbarkeit der experimentellen Arbeit in diesem aufstrebenden Gebiet führen wird.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken E. Arzt für seine Unterstützung durch INM. Die Forschung wurde unter anderem durch den Leibniz-Wettbewerb 2014 gefördert.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Binokulares LichtmikroskopLeicaM60 CMO
Rastertransmissionselektronenmikroskop mit sphärischem AberrationskorrektorJEOLTEM-Probenhalter
DENS SolutionsOcean
Mikrofluidische SpritzenpumpeHarvard ScientificPicoPlus
PlasmareinigerGatanSolarus950
Chemikalien
Aceton, Rotisolv  Plus für HPLCSigma-Aldrich7328.2
Wasser, chromasolv Plus für HPLCSigma-Aldrich34877-2.5L
Ethanol, Rotisolv HPLCQualität CarlRoth P076.2
Gold kolloidcitrat stabilisiert, Durchmesser 30 nmBritish-BiocellEM. GC20
Materials
mit Siliziumnitrid-Membranen von 50 nm Dicke und Abmessungen von 20 &; Mikro; m x 0,40 mmDENS Lösungenfür das Ozeansystem
Spacer Silizium-Mikrochips mit Siliziumnitrid-Membranen von 50 nm Dicke, Abmessungen von 20 &; Mikro; m x 0,40 mm und Abstandshalterdicke von 200 nmDENS Lösungenfür das Ocean-System
Mikrofluidische Peek-SchläucheUpchurch Scientific1570
Kunststoffpinzetten
(Antimagnetisches Anti-Säure-Edelstahlgehäuse mit ESD-PVDF (SV)-Spitzen)ideal-tek2ASVR.SA
Teflonbeschichtete Pinzette aus gebogenem Stahl (EMS SA mit "PTFE" Beschichtung)Elektronenmikroskopie Sciences78322-7Te
Teflonbeschichtete Pinzette aus Stahl mit breitem Schnabel (EMS 2A "PTFE" Beschichtung)Elektronenmikroskopie Sciences78322-2ATe
Hamilton Spritze, 1 mL, gasdicht (Modell 1001 TLLX SYR)Hamilton81323
Reinraumgewebe Sontara Micropure AP (224 x 224mm)DuPontSontara MicroPure
ARM200F Flüssigkeitsfluss Base Silizium-Mikrochips mit austauschbaren Spitzen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).">Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
  2. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).">Ross, F. M. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).
  3. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).">de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).
  4. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).">Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
  5. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).">Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).
  6. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).">Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).
  7. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).">Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).
  8. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).">Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).
  9. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).">de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
  10. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).">Evans, J. E., et al. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).
  11. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).">Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).
  12. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).">Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
  13. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).">de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).
  14. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).">Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).
  15. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).">Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).
  16. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).">Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).
  17. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).">Schuh, T., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).
  18. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).">Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).
  19. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).">Creemer, J. F., et al. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).
  20. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).">Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).
  21. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).">Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346(2004).
  22. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).">Chen, Q., et al. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).
  23. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).">Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
  24. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).">Reimer, L., Kohl, H. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  25. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).">Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).
  26. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).">Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).
  27. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).">Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).
  28. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).">Unocic, R. R., et al. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).
  29. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).">Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).
  30. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).">Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).
  31. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).">Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).
  32. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).">Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).
  33. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).">Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).
  34. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).">Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).
  35. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).">Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).

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