Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen und Assemblierungen von integralen Membranproteinen in vitro mit verschiedenen Partnerfaktoren in einer lipidproximalen Umgebung.
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Methodenartikel
Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Studien von integralen Membranproteinen in vitro sind durch die Anwesenheit einer hydrophoben Transmembrandomäne häufig kompliziert. Weitere diese Studien zu verkomplizieren, reincorporation von Waschmittel-solubilisierte Membranproteine in Liposomen ist ein stochastischer Prozess, in dem Protein-Topologie zur Durchsetzung unmöglich ist. Dieses Papier bietet eine alternative Methode, um diese anspruchsvollen Techniken, die ein Liposom-basierten Gerüst verwendet. Protein Löslichkeit wird durch die Deletion der Transmembrandomäne erhöht und diese Aminosäuren sind mit einem Anbinden Einheit ersetzt, wie beispielsweise ein His-Tag. Dieser Haltegurt wirkt mit einer Ankergruppe (Ni 2+ koordiniert von Nitrilotriessigsäure (NTA (Ni 2+)) für His-markierte Proteine), die an der Oberfläche des Liposoms eine einheitliche Protein - Topologie erzwingt. Ein Beispiel präsentiert wird, wobei die Wechselwirkung zwischen Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) mit einem integralen Membranprotein, Mitochondrial Fission Factor (MFF) wurde investigated dieses Gerüst Liposom-Verfahren. In dieser Arbeit haben wir die Fähigkeit von Mff demonstriert effizient löslich DRP1 an die Oberfläche von Liposomen zu rekrutieren, die ihre GTPase-Aktivität stimuliert. Darüber hinaus war DRP1 der Lage, die MFF-dekorierten Lipid-Vorlage in Gegenwart von spezifischen Lipiden tubulate. Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit der Gerüst Liposomen strukturellen und funktionellen Assays und unterstreicht die Rolle von Mff Aktivitäts DRP1 regulieren.
Einleitung
Studium membran proximal Protein-Protein - Wechselwirkungen ist eine herausfordernde Fangen wegen der Schwierigkeit in der natürlichen Umgebung der integralen Membranproteine beteiligt rekapituliert 1. Dies ist aufgrund der Notwendigkeit des Waschmittels Solubilisierung und der inkonsistenten Orientierung von Proteinen in Proteoliposomen. Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine Strategie eingesetzt , wobei lösliche Membrandomänen integraler Membranproteine exprimiert werden als His-Tag - Fusionsproteine, und diese löslichen Fragmente werden auf Gerüst Liposomen über Wechselwirkungen mit NTA (Ni 2+) Kopfgruppen am Lipid verankert Oberfläch....
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Protokoll
1. Scaffold Liposome Vorbereitung
HINWEIS: eine relativ einfache und featureless Gerüst (bestehend aus DOPC (1,2-Dioleoyl - sn - glycero-3-phosphocholin oder PC) und DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-Dioleoyl, anfänglichen Experimenten sollte Idealer verwenden - sn - glycero-3 - [(N - (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure) succinyl]. (Nickelsalz)) , das weg von diesen Experimenten Lipidladung, Flexibilität und Krümmung kann als einzelne Faktoren eingeführt werden , mit dem Potential Membran-proximalen Wechselwirkungen zu ändern. Diese Änderung kann durch Zugabe definierter Mengen spezifischer Lipidbestand erre....
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Ergebnisse
Während die Interaktion zwischen DRP1 und Mff nachgewiesen wurde für mitochondriale Spaltung wichtig zu sein, hat diese Interaktion schwierig gewesen , in vitro zu rekapitulieren. Unser Ziel war es besser, die zelluläre Umgebung emulieren, wobei DRP1 und Mff interagieren. Zu diesem Zweck Liposomen , die Grenzkonzentrationen von NTA (Ni 2+) Kopfgruppen wurden durch Rehydratisieren ein Lipidfilm hergestellt , wie oben beschrieben. Die Lipidlösung besteht zunächst aus un.......
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Diskussion
Dieses Protokoll bietet ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen integralen Membranproteinen. Durch ein modulares Gerüst Liposom verwendet wird, sind Forscher, die die Aktivität eines oder mehrerer Proteine in einer Lipid-Umgebung proximal zu beurteilen. 26 - Frühere Studien haben eine ähnliche Methode für die Rezeptorenzyme der Plasmamembran 24 gezeigt. Wir haben dieses Verfahren erweitert, um Lipid-Cofaktoren integrieren und zu erforschen Wechselwi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Autoren möchten sich bei der Finanzierung durch die American Heart Association (SDG12SDG9130039) bedanken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Phosphatidylcholin (DOPC) | Avanti Polare Lipide | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamin (DOPE) | Avanti Polare Lipide | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polare Lipide | 790404 | |
| Rinderherz Cardiolipin (CL) | Avanti Polare Lipide | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | ||
| Liposomen-Extruder | Avanti Polare Lipide | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Fleckengitter | Ted Pella | 79712 | |
| Mikrofugenröhrchen | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Mikrotiterplatten-Streifen | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Farbstoff | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesiumchlorid | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachitgrün Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdat Tetrahydrat | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laborfilm | Parafilm | PM-996 | |
| Uranylacetat | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Mikroskop | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Konzentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Mikroplatten-Reader | Molekulare Bauelemente |
Referenzen
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
