Hier präsentieren wir ein Protokoll, die Kraft der Wechselwirkungen zwischen einem gut definierten anorganischen Oberfläche und entweder Peptide oder Aminosäuren durch Einzelmolekülkraftspektroskopie-Messungen mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) zu messen. Die Informationen aus der Messung erhalten wird, ist wichtig, um besser auf die Peptid-anorganischem Material Interphase zu verstehen.
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Methodenartikel
Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Wechselwirkungen zwischen Proteinen oder Peptiden und anorganischen Materialien führen zu mehreren interessanten Prozessen. Führt beispielsweise zur Bildung von Verbundmaterialien mit einzigartigen Eigenschaften Proteine mit Mineralien kombiniert. Zusätzlich wird der unerwünschte Prozess der biologischen Verschmutzung durch die Adsorption von Biomolekülen eingeleitet, vor allem Proteine, auf Oberflächen. Diese organische Schicht wird eine Haftschicht für Bakterien und ermöglicht es ihnen, mit der Oberfläche zu interagieren. die grundlegenden Kräfte zu verstehen, die die Wechselwirkungen an der organisch-anorganischen Schnittstelle regeln ist daher wichtig, für viele Bereiche der Forschung und könnte auf das Design neuer Materialien für optische, mechanische und biomedizinische Anwendungen führen. Dieses Papier zeigt eine Einzelmolekülkraftspektroskopie-Technik, die eine AFM verwendet die Adhäsionskraft zwischen entweder Peptide oder Aminosäuren und anorganischen Oberflächen gut definiert zu messen. Diese Technik beinhaltet ein Protokoll für das Biomolekül auf dem AFM BefestigungsSpitze eine kovalente flexiblen Linker durch und Einzelmolekülkraftspektroskopie-Messungen durch Rasterkraftmikroskop. Außerdem wird eine Analyse dieser Messungen enthalten.
Einleitung
Die Wechselwirkung zwischen Proteinen und anorganischen Mineralien führt zum Aufbau von Verbundmaterialien mit besonderen Eigenschaften. Dazu gehören Materialien mit hoher mechanischer Festigkeit oder einzigartigen optischen Eigenschaften. 1, 2 erzeugt beispielsweise die Kombination des Proteins Kollagen mit dem Mineral Hydroxylapatit entweder weichen oder harten Knochen für unterschiedliche Funktionalitäten. 3 Kurze Peptide können auch anorganische Materialien mit hoher Spezifität zu binden. 4, 5,
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Protokoll
1. Tipp Modifikation
- Kauf Siliziumnitrid (Si 3 N 4) AFM Kragarmen mit Siliziumspitzen (nominal Auslegerradius ~ 2 nm).
- Reinigen Sie jede AFM Cantilever von 20 min in wasserfreiem Ethanol getaucht. Trocken bei Raumtemperatur. Behandeln dann die Auskragungen von ihnen zu O 2 Plasma für 5 Minuten ausgesetzt wird .
- Hängen Sie das saubere oben genannten Tipps (3 cm) einer Lösung, die Methyltriethoxysilan und 3- (Aminopropyl) triethoxysilan in einem Verhältnis von 15: 1 (v / v) in einem Exsikkator unter einer inerten Atmosphäre (entweder Stickstoff oder Argon) und schließen Sie den Exsikkator eine Vakuumpumpe.....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt die Spitze Änderungsverfahren. Im ersten Schritt wird eine Plasmabehandlung ändert sich die Oberfläche des Siliciumnitrid-Spitze. Die Spitze präsentiert OH-Gruppen. Diese Gruppen werden dann mit den Silanen reagieren. Am Ende dieser Stufe wird die Oberfläche der Spitze wird durch freie NH2 - Gruppen abgedeckt werden. Diese freien Amine reagiert dann mit Fmoc PEG-NHS, eine kovalente Linker. Die Fmoc Gruppe des PEG-Linker wird durch pipyridine,.......
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Diskussion
Die Schritte 1.3, 1.4 und 1.7 in dem Protokoll mit umfangreichen Sorgfalt erstellt und auf sehr sanfte Weise werden sollte. In Schritt 1.3, sollte die Spitze nicht mit dem Silan-Gemisch in Kontakt stehen und die Silanisierung Verfahren in einer inerten Atmosphäre (frei von Feuchtigkeit) durchgeführt werden sollte. 45 Dies wird getan , um Mehrschichtbildung zu verhindern und weil Silanmoleküle leicht hydrolysieren in Gegenwart von Feuchtigkeit. 45
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch das Marie Curie International Reintegration Grant (EP7) unterstützt. P. D. dankt dem Israel Council for Higher Education.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Siliziumnitrid (Si3N4) AFM-Ausleger mit Silikonspitzen | Bruker (Camarilo, CA, USA) | MSNL10, nominale Ausleger Radius ~2 nm | |
| Methyltriethoxysilan | Acros Organics (New Jersey, USA) | Zur Silaylierung der AFM-Spitze | |
| 3-(Aminopropyl)-Triethoxysilan | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Zur Silaylierung der AFM-Spitze | |
| Triisopropylsilan | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Wird zur Peptidentschützung | |
| verwendet N-Ethyldiisopropylamin | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Wird zur Modifikation der Spitze | |
| verwendet Triethylamin | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Wird für die Spitze verwendet Modifikation | |
| Piperidin | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Verwendet für die Entschützung der Spitze Fmoc | |
| Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimid (FMOC-PEG-NH) | Iris Biotech GmbH (Deutschland, Deutschland) | Wird als kovalenter flexibler Linker verwendet (MW = 5.000 Da) | |
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) | Alfa Aser (Heysham, England) | Wird als Kupplungsreagenz verwendet. | |
| N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) | Acros Organics (New Jersey, USA) | Verwendung als Lösungsmittel im Verfahren zur Modifikation der Spitze | |
| DMF (Dimethylformamid) | Merck (Darmstadt, Deutschland) | Verwendung als Lösungsmittel im Verfahren zur Modifikation der Spitze | |
| Chloroform | Bio-Lab (Jerusalem, Israel) | Verwendung als Lösungsmittel im Verfahren zur Modifikation der Spitze | |
| Ethanol (wasserfrei) | Gadot (Netanya, Israel) | Wird als Lösungsmittel im Verfahren zur Modifikation der Spitze verwendet | |
| Trifluoressigsäure (TFA) | Merck (Darmstadt, Deutschland) | ||
| Essigsäureanhydrid | Merck (Darmstadt, Deutschland) | ||
| Peptide | GL Biochem (Shanghai, China). | ||
| Phenylalanin und Tyrosin | Biochem (Darmstadt, Deutschland) | ||
| 30 % TiO2Dispersion im Gemisch aus Lösungsmittel 2-(2-Methoxyethoxy)ethanol (DEGME) und Ethyl-3-ethoxypropionat (EEP) | Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) | (30 %) in dem Gemisch aus Lösungsmittel 2-(2-Methoxyethoxy)ethanol (DEGME) und Ethyl-3-ethoxypropionat (EEP). Wird für die Substratvorbereitung von TiO2 | |
| Glimmersubstrate | TED PELLA, INC. (Redding, Kalifornien, USA) | 9,9 mm Durchmesser |
Referenzen
- Addadi, L., Weiner, S. Control and design principles in biological mineralization. Angew. Chem., Int. Ed. 31 (2), 153-169 (1992).
- Meyers, M. A., Chen, P. Y., Lin, A. Y. M., Seki, Y. Biological materials: Structure and mechanical properties. Prog. Mater. Sci. 53 (1), 1-206 (2008).
- Villee, C. A. J.....
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Nachdrucke und Genehmigungen
