Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Dermestes maculatus

10.5K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/54976

⸱

28. Dezember 2016

 ,  , 
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Protokolle für die Aufzucht eines intermediären Keimkäfers, Dermestes maculatus (D. maculatus) im Labor. Wir teilen auch Protokolle für embryonale und elterliche RNAi und Methoden zur Analyse embryonaler Phänotypen, um die Genfunktion bei dieser Spezies zu untersuchen.

Zusammenfassung

Fortschritte in der Genomik haben die Möglichkeit eröffnet, die Artenvielfalt in einem noch nie dagewesenen Ausmaß zu untersuchen. Die Sequenz allein wird jedoch ohne Werkzeuge zur Untersuchung der Genfunktion nicht aussagekräftig sein. Die Entwicklung und der Austausch detaillierter Protokolle für die Etablierung neuer Modellsysteme in Laboratorien und für Werkzeuge zur Durchführung funktioneller Studien ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Leistungsfähigkeit der Genomik zu nutzen. Coleoptera (Käfer) sind die größte Gruppe von Insekten und bewohnen praktisch alle Arten von Lebensräumen auf dem Planeten. Studien an Käfern liefern nicht nur ideale Modelle für die Grundlagenforschung, sondern können auch Auswirkungen auf die Schädlingsbekämpfung haben, da sie häufig Schädlinge in Haushalten, in der Landwirtschaft und in der Lebensmittelindustrie sind. Es werden detaillierte Protokolle für die Aufzucht und Pflege von D. maculatus-Laborkolonien und für die Durchführung von dsRNA-vermittelter Interferenz in D. maculatus vorgestellt. Sowohl embryonale als auch elterliche RNAi-Verfahren - einschließlich der Einrichtung des Apparats, der Vorbereitung, der Injektion und der Wiederherstellung nach der Injektion - werden beschrieben. Es werden auch Methoden zur Analyse embryonaler Phänotypen vorgestellt, einschließlich Lebensfähigkeit, Musterungsdefekte bei geschlüpften Larven und Kutikulapräparationen für nicht geschlüpfte Larven. Diese Assays, zusammen mit der in situ Hybridisierung und Immunfärbung für molekulare Marker, machen D. maculatus zu einem zugänglichen Modellsystem für die Grundlagen- und angewandte Forschung. Darüber hinaus liefern sie nützliche Informationen für die Etablierung von Verfahren in anderen aufkommenden Insektenmodellsystemen.

Einleitung

1998 berichtete Fire and Mello , daß doppelsträngige RNA (dsRNA) Hemmung der Genfunktion in Caenorhabditis elegans 1 induzieren kann. Diese Antwort , ausgelöst durch dsRNA wurde RNA - Interferenz (RNAi) genannt, und solche RNAi-vermittelte Gen - Silencing wurde berichtet , in Tieren, Pflanzen konserviert zu sein, und Pilze 2-7. In Pflanzen und einige Tiere, systemisch RNAi - Funktionen, was bedeutet , dass der Effekt auf andere Zellen / Gewebe ausbreiten , wo wird dsRNA nicht direkt eingeführt ( zusammengefasst in 8-10). Wissenschaftler haben von dieser endogenen zellulären RNAi - Antwort von dsRNAs Gestaltung Gene von Interesse zu zielen, wodurch Klopfen nach unten Genfunktion , ohne direkt die Manipulation des Genoms ( zusammengefasst in 11-14) gemacht.

RNAi ist ein leistungsfähiges Werkzeug für funktionelle Studien aufgrund der folgenden Vorteile. Erstens, selbst bei minimaler Gensequenz Informationen kann ein Gen gezielt RNAi verwendet. Dies ist besonders wichtig für studies von Nicht-Modellorganismen genomischen oder Transkriptom-Daten fehlen. Zweitens in Organismen, die RNAi-Antwort robust systemisch ist, kann RNAi-vermittelte Knock-Down bei fast jedem beliebigen Entwicklungsstadium durchgeführt werden. Diese Funktion ist sehr nützlich, um die Funktion von pleiotropen Gene zu studieren. Drittens, in einigen Fällen spreizen RNAi - Effekte auf die Gonaden und Nachkommen, so dass Phänotypen in Nachkommen 15,16 beobachtet werden. Dieses Phänomen, bekannt als elterliche RNAi (pRNAi), ist besonders vorteilhaft für Gene Embryonalentwicklung beeinflussen, zahlreiche Nachkommen von einem einzigen injiziert Mutter hergestellt ohne direkte Manipulation von Eiern untersucht werden. Aus diesen Gründen ist pRNAi die Methode der Wahl. Wenn jedoch pRNAi unwirksam ist, beispielsweise für die Gene für Oogenese erforderlich, dann embryonale RNAi (eRNAi) verwendet werden. Viertens kann RNAi verwendet werden, um das Äquivalent einer allelischen Serie, dass zur Erzeugung der Menge an dsRNA geliefert über einen Bereich variiert werden kann schwach bis stark Defekte zu produzieren. Eine solche Abstufung von Phänotypen können für das Verständnis der Genfunktion hilfreich sein, wenn das Gen in einem komplexen Prozess und / oder vollständigen Verlust der Funktion beteiligt ist, ist letal. Fünftens Lieferung von dsRNA ist in der Regel einfach und machbar, vor allem bei Tieren robusten Reaktionen systemischen RNAi zeigt. dsRNA kann durch Mikroinjektion 1,5, Fütterung / Aufnahme 17,18, Einweichen, 19,20 und Viren / Bakterien-vermittelte Abgabe 21,22 eingeführt werden. Sechstens, im Gegensatz zu einigen Gen-Targeting / Bearbeitungsmethoden, gibt es keine Notwendigkeit für Organismen tragen die Mutation zu screenen oder genetische Kreuzungen durchzuführen Homozygoten zu erzeugen, wenn RNAi verwendet wird. Daher kann im Vergleich zu vielen anderen Techniken zur Untersuchung der Genfunktion ist RNAi schnell, kostengünstig und kann für großflächige Bildschirme 23-25 aufgebracht werden.

Die breite Anwendung von RNAi stellt Mittel bereit, funktionelle Studien in einem breiten Spektrum von Organismen durchzuführen, um den Bereich der Arten für das Studium zur Verfügung expandierenden beyond die traditionellen Modellsysteme für die genetische Werkzeuge entwickelt worden. Zum Beispiel können nicht-Modellsysteme Studien mit benötigt Einblicke in die Evolution von Genen und Gen - Netzwerken zu geben , indem die Funktionen von Orthologen von Spezies zu vergleichen , die unterschiedliche Entwicklung Modi oder ausstellenden verschiedene morphologische Merkmale 26-29. Diese Art von Studien wird ein besseres Verständnis der biologischen Vielfalt zur Verfügung stellen, mit Auswirkungen sowohl für angewandte und Grundlagenforschung.

Als die größte Tiergruppe auf dem Planeten, Insekten bieten eine große Chance, die zugrunde liegenden Mechanismen Vielfalt zu erkunden. Darüber hinaus sind Insekten im Allgemeinen klein, haben kurze Lebenszyklen, hohe Fruchtbarkeit und sind leicht nach hinten im Labor. In den vergangenen zwei Jahrzehnten hat sich RNAi erfolgreich bei Insekten Spanning Aufträge angewendet worden, einschließlich Diptera (Zweiflügler) 5, Lepidoptera (Schmetterlinge und Motten) 30, Coleoptera (Käfer) 16,31, Hautflügler (SAWFLügen, Wespen, Ameisen und Bienen) 32, Hemiptera (true Bugs), Isoptera (Termiten) 34, Blattodea (Schaben) 35, Orthoptera (Grillen, Heuschrecken, Heuschrecken und katydids) 36 und Phthiraptera (Läuse) 37. Die erfolgreiche Anwendung von RNAi hat sich für die Untersuchung der Musterung in der frühen Embryonalentwicklung (anterior-posteriore Achse 32, dorsalen-ventralen Achse 28, Segmentierung 26,38) funktionelle Daten zur Verfügung gestellt, die Geschlechtsbestimmung 39,40, Chitin / Kutikula Biosynthese 41, Ecdyson 42 signalisiert, Sozialverhalten 43 und mehr. RNAi Methoden für verschiedene Insektenarten entwickelt werden , können von zusätzlichen Vorteil sein, dass sie geeignet sind , für die Schädlingsbekämpfung , nützlich zu sein ( zusammengefasst in 44-46). RNAi-Effekte werden genspezifische sowie artspezifischen, solange nicht konservierten Regionen für die Ausrichtung gewählt. Für nützlichen Insektenarten wie Honigbienen und Seidenwürmer, Gene von entscheidender Bedeutung für das Überleben der TargetingViren oder Parasiten - Infektion zu kontrollieren kann eine neue Strategie bieten diese Spezies 47,48 zu schützen.

Dermestes maculatus (D. maculatus), gebräuchliche Bezeichnung verbergen Käfer, ist weltweit mit Ausnahme der Antarktis verteilt. Als holometabolous Insekt umfasst das D. maculatus Lebenszyklus embryonale, Larven, Puppen und adulten Stadien (Abbildung 1). Weil es auf Fleisch ernährt, ist D. maculatus in Museen verwendet tote Tiere zu skeletonize und forensische Entomologen können es verwenden Zeitpunkt des Todes 49,50 abzuschätzen. D. maculatus ernährt sich von tierischen Erzeugnissen einschließlich Kadaver, getrocknetes Fleisch, Käse, und die Puppen / Kokons von anderen Insekten und somit verursacht Schäden an Haushalte, Vorrats und die Seide, Käse und Fleischindustrie 51,52. RNAi in diesem Käfer Anwendung könnte eine effiziente und umweltfreundliche Art und Weise zur Verfügung stellen ihre wirtschaftlichen Auswirkungen zu minimieren. Unser Labor hat D. maculatus als neues m verwendetodel Insekt zu studieren Segmentierung 53. Neben den Lab - Aufzucht zugänglich ist, ist D. maculatus von Interesse für die Grundlagenforschung , wie es ein Zwischenkeim - Entwickler ist es eine nützliche Art den Übergang zwischen kurz- und langfrisKeim Entwicklung zu studieren.

figure-introduction-1
Abbildung 1: Lebenszyklus von D. maculatus. Fotografien von D. maculatus in verschiedenen Lebensphasen, wie angegeben. Der Lebenszyklus vom Ei bis zum erwachsenen dauert drei Wochen bei 30 ° C, jedoch bei niedrigeren Temperaturen länger. (A, F) frisch gelegten Embryonen sind weiß bis hellgelb und oval, etwa 1,5 mm in der Länge. Embryonalentwicklung dauert ca. 55 Stunden bei 30 ° C. (B, C und G) Larven haben dunkle pigmentierte Streifen und sind mit Setae bedeckt. gehen Larvae durch mehrere instars abhängig von der Umgebung und deren Länge bis über 1 cm verlängern kann. (D, H) (E, I) Kurz nach dem Schlüpfen, erscheint dunkle Pigmentierung über die erwachsenen Käfer Körper. Erwachsene können bis zu mehrere Monate leben und eine Frau Hunderte von Embryonen über ihr Leben legen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bisher haben wir gezeigt , dass RNAi in Klopfen nach unten Genfunktion in D. wirksam ist maculatus 53. Hier unsere Erfahrung Aufzucht D. maculatus Kolonien im Labor wird zusammen mit Schritt- für -Schritt - Protokolle geteilt sowohl für die embryonale und die elterliche RNAi Set-up, Injektion, Nacheinspritzung Pflege und phänotypische Analyse. Die dsRNA-vermittelte Knock-Down und Analyseverfahren hier eingeführt nicht nur detaillierte Informationen zu Fragen in D. maculatus Adressierung, sondern auch potenzielle Bedeutung haben for RNAi in anderen nicht-Modell Käfer / Insektenarten anwenden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Zucht von D. maculatus

HINWEIS: Eine Zuchtstation von D. maculatus wurde im Labor der Autoren mit kommerziell erworbenen erwachsenen Tieren und Larven eingerichtet. Die Artenidentität wurde mittels DNA-Barcoding53 bestätigt.

  1. Um eine neue Käfiganlage im Labor einzurichten, streuen Sie eine dünne Schicht Sägemehl in einen mittelgroßen Insektenkäfig (30,5 x 19 x 20,3 cm3). Stellen Sie einen etwa 10 x 6 x 3 cm3 großen Styroporblock in den Käfig, damit sich die Larven zur Verpuppung verstecken können. Geben Sie 20–50 Käfer (entweder erwachsene Tiere oder Larven im letzten Entwicklungsstadium) hinzu. Die Käfer verstecken sich in dem Sägemehl.
  2. Fügen Sie nasses Katzenfutter in einer Petrischale oder einem Wiegeboot hinzu. Bedecken Sie den Käfig mit einem Maschennetz und stellen Sie ihn in einen Inkubator.
  3. Für die dauerhafte Haltung einer Zuchtgruppe im Labor stellen Sie die Temperatur auf 25–30 °C ein. D. maculatus wächst bei höheren Temperaturen schneller, allerdings fördert dies auch das Wachstum von Pilzen und Milben. Um eine gesunde Population zu erhalten, verwenden Sie 25–28 °C für die reguläre Bestandspflege und 30 °C, um die Population schnell zu vergrößern. Die Entwicklungsdauer beträgt je nach Umweltfaktoren etwa drei Wochen bis vier Monate50 (Abbildung 2).

Insekten-Biodegradationsversuch; Aufbau mit Styropor, Sägespänen, Katzenfutter; ökologische Studie.
Abbildung 2: D. maculatus-Laborpopulation. Es ist eine Fotografie eines typischen Insektenkäfigs für D. maculatus dargestellt. Sägespäne werden verteilt, damit sich die Käfer verstecken können. Katzenfutter wird in einer kleinen Petrischale oder Wägeboot hinzugefügt. Styropor wird als Unterschlupf für letzte Larvenstadien zum Verpuppen in den Käfig gelegt. Der hier gezeigte Käfig hat die Maße 30,5 × 19 × 20,3 cm3 und beherbergt einige hundert Larven, Puppen und erwachsene Tiere. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

  1. Lassen Sie die Eier im Käfig zur Reifezeit. Um die Kolonie zu vergrößern, richten Sie neue Käfige mit Eiern (wie in Abschnitt 2 beschrieben gesammelt), Larven oder erwachsenen Tieren ein, wie oben beschrieben. D. maculatus legt Eier im gesamten Käfig ab, besonders in der Nähe der Nahrungsquelle.
  2. Ersetzen Sie das Nassfutter für Katzen etwa zweimal pro Woche.
    HINWEIS: Aufgrund des unangenehmen Geruchs von Nassfutter für Katzen wurden auch alternative Nahrungsquellen getestet (siehe Diskussion).

2. Sammlung von Embryonen

  1. Richten Sie eine Sammlung ein, indem Sie mindestens 50 Männchen und 50 Weibchen aus der Kolonie aussortieren. Junge erwachsene Tiere eignen sich am besten. Stellen Sie die erwachsenen Tiere in einen kleinen Käfig (17,8 x 10,2 x 12,7 cm3) ohne Sägemehl. Geben Sie Katzenfutter in ein Wiegeboot.
  2. Überprüfen Sie vor Beginn der Sammlung den Käfig sorgfältig auf eventuell vorhandene Embryonen und entfernen Sie diese. Legen Sie einen aufgezogenen Wattebausch in den Käfig und stellen Sie den Käfig in einen 30 °C Inkubator. Nach dem geeigneten Zeitfenster ist der Wattebausch bereit für die Embryonensammlung.
  3. Falten Sie ein Stück schwarzes Tonpapier (A4-Größe) zur Hälfte, um eine Falzlinie zu erzeugen, und entfalten Sie es anschließend wieder.
  4. Entnehmen Sie den aufgezogenen Wattebausch aus dem Käfig. Entfernen Sie die erwachsenen Tiere vom Wattebausch und setzen Sie sie zurück in den Käfig.
  5. Ziehen Sie den aufgezogenen Wattebausch vorsichtig auseinander, indem Sie ihn langsam in dünne Wattefasern zerreißen, wobei die Eier auf das schwarze Papier fallen.
    HINWEIS: D. maculatus-Embryonen sind empfindlich und im Wattebausch schwer sichtbar. Sie können leicht zerquetscht werden, wenn der Wattebausch zu fest gehalten wird.

3. Vorbereitung von dsRNA

  1. Vorbereitung der DNA-Vorlage für die dsRNA-Synthese
    1. Führen Sie 4–6 PCR-Reaktionen mit einem Volumen von jeweils 50 µl unter Verwendung von Primern durch, die an beiden 5'-Enden T7-Promotorsequenzen enthalten, um die DNA-Vorlage gemäß den Herstelleranweisungen zu amplifizieren.
    2. Reinigen Sie das PCR-Produkt mithilfe eines kommerziellen PCR-Reinigungskits gemäß den Herstelleranweisungen. Die ideale Endkonzentration der DNA-Vorlage sollte ≥ 100 ng/µl betragen.
  2. Vorbereitung des Injektionspuffers
    1. Stellen Sie 100 ml Injektionspuffer (0,1 mM NaH2PO4, 5 mM KCl) her. Stellen Sie den pH-Wert mit 5 M NaOH auf 6,8 ein.
    2. Lagern Sie Aliquots bei -20 °C.
  3. Synthese von dsRNA
    1. Richten Sie eine Reaktion in einer 0,2-ml-PCR-Röhrchen auf Eis ein und führen Sie eine in vitro-Transkription mit T7-Polymerase gemäß den Herstelleranweisungen unter Verwendung von etwa 500 ng Vorlage pro Reaktion durch.
    2. Inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei 37 °C.
    3. Spalten Sie die DNA-Vorlage mit DNase gemäß den Herstelleranweisungen.
    4. Erhitzen Sie das Röhrchen auf 94 °C und halten Sie es 3 Minuten lang bei 94 °C.
    5. Um die dsRNA zu annealen, kühlen Sie das Röhrchen langsam um 1 °C/min ab, bis nach 1 Stunde eine Temperatur von 45 °C erreicht ist.
      HINWEIS: Die Schritte 3.3.2 bis 3.3.5 können in einem Thermocycler durchgeführt werden.
    6. Um die dsRNA per Ethanolpräzipitation zu fällen, geben Sie 280 µl RNase-freies Wasser zu 20 µl der Reaktionslösung, um ein Endvolumen von 300 µl einzustellen. Fügen Sie 30 µl 3 M NaOAc (pH 5,2) und 650 µl Ethanol hinzu. Stellen Sie das Röhrchen über Nacht in den Gefrierschrank bei -20 °C.
    7. Nach einer Zentrifugation bei 15.682 × g für 30 Minuten bei 4 °C waschen Sie das dsRNA-Pellet mit 70 %igem Ethanol. Trocknen Sie das Pellet und lösen Sie es in 20 µl Injektionspuffer auf.
    8. Messen Sie die Konzentration der dsRNA mithilfe eines Spektrophotometers bei A260. Die ideale Konzentration liegt zwischen 3 und 5 µg/µl. Überprüfen Sie die Qualität, indem Sie 5 µl einer 1:25-Verdünnung der dsRNA auf einem 1 %igen Agarosegel bei 90 V für 30 Minuten laufen lassen. Eine einzelne Bande der erwarteten Größe sollte deutlich sichtbar sein.
    9. Lagern Sie die dsRNA bei -20 °C oder darunter.
      HINWEIS: Bei jedem RNAi-Knockdown-Experiment sollte eine Kontroll-dsRNA mitgeführt werden, die voraussichtlich keinen Einfluss auf den untersuchten Prozess hat. gfp-dsRNA eignet sich hervorragend als Kontrolle für die meisten Experimente. Bereiten Sie die Kontroll-dsRNA parallel zur experimentellen dsRNA vor und injizieren Sie sie gleichzeitig.

4. Zusammenbau von Mikroinjektor und Mikromanipulator

HINWEIS: Siehe Abbildung 3.

  1. Schließen Sie eine Stickstoff- oder andere Luftversorgung an den Druckeingang eines pneumatischen Pumpengeräts an. Falls eine pneumatische Pumpe nicht verfügbar ist, wenden Sie Druck mit einer 50-ml-Spritze an, die an feine Schläuche angeschlossen ist.
  2. Schließen Sie einen Fußschalter an den Fernanschluss der Pumpe an, um den Ausstoßdruck zu steuern.
  3. Bringen Sie einen Glas-Kapillarhalter mit Schlauch an der Ausstoßdrucköffnung der Pumpe an.
  4. Befestigen Sie den Kapillarhalter an einem Mikromanipulator in der Nähe eines Stereomikroskops.

5. Embryonales RNAi

HINWEIS: Abbildung 4 zeigt ein Flussdiagramm der embryonalen RNAi bei D. maculatus.

  1. Herstellung von eRNAi
    1. Bereiten Sie einen Petrischalen-Deckel (90 mm Durchmesser) zur Sammlung von Embryonen vor. Legen Sie ein Stück schwarzes Filterpapier in den Deckel, um dessen Innenseite abzudecken. Stellen Sie einen Standard-Mikroskopobjektträger auf das schwarze Papier.
    2. Verdünnen Sie die dsRNA mit Injektionspuffer auf die geeignete Konzentration. Verwenden Sie für erste Experimente 2–3 µg/µl. Bewahren Sie die dsRNA stets auf Eis auf, bis sie injiziert wird.
    3. Geben Sie Lebensmittelfarbe in einer Verdünnung von 1:40 zur dsRNA hinzu und pipettieren Sie vorsichtig mehrmals, um gut zu mischen.
  2. Sammlung von Embryonen zur Injektion
    HINWEIS: Bei 25 °C wandern die Kerne in Embryonen 6–8 Stunden nach der Eiablage (AEL) zur Eioberfläche53. Ein zelluläres Keimblatt (cellular blastoderm) bildet sich innerhalb von 8–10 Stunden nach der Eiablage53. Um sicherzustellen, dass Embryonen vor dem Stadium des zellulären Keimblatts für die Injektion verwendet werden, werden Embryonen im Zeitraum von 0–3 Stunden nach der Eiablage empfohlen53. Die Sammlung, Vorbereitung und Injektion von Embryonen dauert normalerweise weniger als 2 Stunden, sofern die Glas-Kapillaren in gutem Zustand sind. Daher kann der gesamte Prozess innerhalb von 5 Stunden nach der Eiablage abgeschlossen werden.
    1. Sammlen Sie die Embryonen gemäß den Schritten 2.2–2.5.
    2. Klopfen Sie leicht auf das schwarze Tonpapier, um die Embryonen in den Petrischalen-Deckel zu überführen.
    3. Befestigen Sie doppelseitiges Klebeband entlang der Kante des Objektträgers.
    4. Richten Sie die Embryonen mit einem Pinsel senkrecht zur Kante des Objektträgers auf dem Klebeband aus, wobei das vordere oder hintere Ende an der Kante liegt. Beachten Sie, dass vorderes und hinteres Ende früher Embryonen nicht leicht zu unterscheiden sind; daher werden im Durchschnitt die Hälfte der Embryonen am hinteren Ende injiziert, was ideal ist.
  3. Befüllen der Glas-Kapillare mit dsRNA
    1. Aspirieren Sie 2–4 µl der dsRNA in eine 20-µl-Mikrolader-Pipettenspitze.
    2. Führen Sie die Spitze in eine vorgezogene Glas-Kapillare (als Nadel bezeichnet) ein und pipettieren Sie die dsRNA-Lösung vorsichtig in die Kapillare. Stellen Sie die Nadeln aus kommerziellen Glas-Kapillaren mit einem Mikropipettenzug her. Ein Beispiel einer idealen gezogenen Nadel ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Länge und das Taper der Nadeln müssen möglicherweise nach ersten Injektionsversuchen optimiert werden.
    3. Befestigen Sie die Glas-Kapillare in der Kapillarhalterung.
    4. Montieren Sie den Kapillarhalter am Mikromanipulator.
  4. Injektion der dsRNA in Embryonen
    1. Überführen Sie den Objektträger mit den Embryonen vorsichtig auf den Tisch des Stereomikroskops.
    2. Bewegen Sie den Objektträger, um einen Embryo in die Bildmitte zu bringen, und stellen Sie das Mikroskop scharf.
    3. Positionieren Sie die Spitze der Kapillare mit Hilfe des Mikromanipulators, während Sie durch das Stereomikroskop schauen. Führen Sie die Spitze nahe an das Ende des ersten Embryos in der Reihe heran.
    4. Schalten Sie die Stickstoff- oder andere Druckluftzufuhr ein.
    5. Stellen Sie den Eingangsschalter des Magnetventils auf Vakuum.
    6. Stellen Sie den Ausstoßdruckregler auf 10–15 psi ein. Passen Sie den Druck je nach Gerät an.
    7. Öffnen Sie die Kapillare gegebenenfalls. Sobald die Spitze offen ist, füllt sich die Spitze mit der gefärbten dsRNA-Lösung.
    8. Bewegen Sie die Kapillarspitze vorwärts, um den Embryo zu durchstechen. Bei idealer Druckeinstellung tritt kein embryonales Fluid in die Kapillare ein.
    9. Treten Sie auf den Fußschalter, um die dsRNA-Lösung in den Embryo zu injizieren, bis eine geeignete Menge an Lösung eingeführt wurde. Abbildung 5 zeigt Beispiele für die Embryomorphologie nach Injektion geeigneter und ungeeigneter Lösungsmengen.
    10. Halten Sie die Kapillarspitze etwa 2 Sekunden lang im Embryo, und ziehen Sie sie dann heraus.
    11. Bewegen Sie die Kapillare zum nächsten Embryo und wiederholen Sie die Schritte 5.4.8–5.4.10, bis alle Embryonen injiziert sind. Wechseln Sie die Glas-Kapillare, falls sie verstopft oder bricht.
  5. Nachbehandlung und Inkubation nach der Injektion
    1. Legen Sie nach der Injektion den Objektträger in eine Petrischale.
    2. Geben Sie einen feuchten Wattebausch in die Petrischale. Achten Sie darauf, dass der Wattebausch den Objektträger nicht berührt.
    3. Decken Sie die Petrischale ab und umwickeln Sie sie mit Versiegelungsfolie. Beschriften Sie die Schale mit dem Namen der dsRNA, der Konzentration, dem Datum, der Uhrzeit und der Anzahl der injizierten Embryonen.
    4. Stellen Sie die Petrischale in einen 30 °C-Inkubator, bis die Embryonen schlüpfen.

6. Parentales RNAi

  1. Isolation von Puppen für die pRNAi
    1. Sammeln Sie Puppen aus der Kolonie.
    2. Sortieren Sie männliche und weibliche Puppen unter dem Mikroskop (siehe Abbildung 6). Bewahren Sie sie in zwei separaten Petrischalen in einem 30 °C Inkubator auf, um sicherzustellen, dass keine Paarung vor der Injektion erfolgt.
    3. Überprüfen Sie täglich auf geschlüpfte adulte Tiere. Die Verpuppung dauert gewöhnlich 5–7 Tage bei 30 °C.
    4. Transferieren Sie geschlüpfte Männchen und Weibchen (siehe Abbildung 6) in zwei getrennte Petrischalen und füttern Sie sie im Zwei-Tage-Rhythmus mit Katzenfutter, bis sie für die Injektion bereit sind.
    5. Fahren Sie mit der Injektion fort, sobald genügend Weibchen und Männchen im geeigneten Alter vorliegen. Weibchen 4 bis 8 Tage nach dem Schlupf eignen sich am besten. Für eine typische Analyse werden 8–12 Weibchen verwendet. Eine gleiche Anzahl Männchen wird für die Paarung benötigt54.
  2. Injektion von dsRNA in den weiblichen Abdomen
    1. Bereiten Sie die dsRNA auf Eis vor (5.1.2 und 5.1.3).
    2. Befestigen Sie eine Nadel mit 32 Gauge an einer 10-µL-Spritze.
    3. Narkotisieren Sie die Weibchen auf einer CO2-Plattform.
    4. Füllen Sie die dsRNA-Lösung in die Spritze, ohne Luft einzuziehen.
    5. Halten Sie ein Weibchen mit der einen Hand ventralseitig nach oben und die Spritze mit der anderen Hand.
    6. Durchdringen Sie vorsichtig die Segmacoria (Membran) zwischen den Sterniten 2 und 3 mit der Nadelspitze. Abbildung 7 zeigt ein Weibchen während der Injektion. Falls die Nadel das Gewebe nicht leicht durchdringt, neigen Sie die Nadel leicht nach oben und drücken Sie langsam nach unten. Führen Sie etwa 2 mm der Nadel in den Körper ein.
    7. Überwachen Sie die Skala der Spritze, während Sie den Kolben langsam betätigen, und injizieren Sie etwa 2 µl pro Weibchen.
    8. Halten Sie die Nadel nach der Injektion mindestens 5 Sekunden lang still, bevor Sie sie aus dem Abdomen des Weibchens entfernen.
    9. Transferieren Sie die injizierten Weibchen in eine Petrischale (90 mm Durchmesser) und füttern Sie sie mit Katzenfutter.
    10. Beschriften Sie die Petrischale mit dem Namen der dsRNA, der injizierten Menge, dem Datum und der Anzahl der Weibchen.
  3. Erholung nach der Injektion und Paarung
    1. Inkubieren Sie die Petrischale in einem 30 °C Inkubator.
    2. Transferieren Sie die injizierten Weibchen nach 24 Stunden in einen Minikäfig.
    3. Fügen Sie dem Käfig eine gleiche Anzahl nicht-injizierter junger Männchen hinzu und beschriften Sie den Käfig.
    4. Stellen Sie ein Wiegeschälchen mit Katzenfutter in den Käfig.
    5. Lassen Sie den Käfig im 30 °C Inkubator, um die Paarung zu ermöglichen. Nach 24 Stunden sollten die Weibchen mit der Eiablage beginnen, und Embryonen können täglich oder in den erforderlichen Zeitabständen gesammelt werden.

7. Phänotypische Analyse nach RNAi

HINWEIS: Bei 30 °C dauert es etwa 55 Stunden, bis die Eier schlüpfen50.

  1. eRNAi-Vitalitätsanalyse
    1. Berechnen Sie die Schlupfrate, indem Sie die Anzahl der geschlüpften Larven mit der Gesamtanzahl der injizierten Embryonen vergleichen. Stellen Sie sicher, dass eine negative Kontrollinjektion durchgeführt wird, da die Embryonen durch das Injektionsverfahren verletzt oder getötet werden können. Typische Schlupfraten liegen zwischen 30 % und 60 %. Achten Sie darauf, dass geschlüpfte Larven nicht ungeschlüpfte Eier fressen.
  2. pRNAi-Vitalitätsanalyse
    HINWEIS: Falls die Weibchen-Vitalität durch das mittels RNAi anvisierte Gen beeinträchtigt wird, beginnen Weibchen, die mit spezifischem dsRNA, aber nicht mit negativem Kontroll-dsRNA injiziert wurden, zu sterben. Falls die Ei-Produktion oder das Eiablageverhalten beeinträchtigt ist, zeigen die Weibchen eine teilweise oder vollständige Sterilität. Bewerten Sie das Überleben der Weibchen im Vergleich zu den Negativkontrollen oder vergleichen Sie die Gesamtanzahl der von experimentellen und kontrollierten Weibchen abgelegten Eier (7.2.3).
    1. Richten Sie die Embryosammlung gemäß Schritt 2.2 ein.
    2. Sammeln Sie nach 24 Stunden die Embryonen gemäß den Schritten 2.4–2.5.
    3. Zählen Sie die Gesamtanzahl der Embryonen.
    4. Überführen Sie die Embryonen in eine 90 mm große Petrischale. Beschriften Sie die Petrischale mit dem anvisierten Gen, dem Sammeldatum und der Anzahl der Embryonen.
    5. Brüten Sie die Embryonen in einem 30 °C warmen Inkubator bis zum Schlupf aus. Da geschlüpfte Larven von ungeschlüpften Embryonen fressen, überprüfen Sie die Petrischale regelmäßig und trennen Sie geschlüpfte Larven mithilfe einer Pinzette von ungeschlüpften Embryonen (siehe Diskussion).
    6. Zählen Sie die Anzahl der geschlüpften Embryonen und berechnen Sie die Schlupfrate.
  3. Untersuchung von Kutikula-Defekten bei geschlüpften Larven
    1. Sammeln Sie geschlüpfte Larven in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Fügen Sie im Abzug 1 ml Fixierungslösung hinzu.
    3. Lassen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mindestens über Nacht bei 4 °C stehen, damit die Lösung das Larvengewebe durchdringen kann.
    4. Entfernen Sie zur Visualisierung so viel Fixierungslösung wie möglich aus dem Röhrchen.
    5. Waschen Sie die Larven mindestens dreimal mit PBST.
    6. Überführen Sie die Larven mit einer abgeschnittenen P-1000-Pipettenspitze (zur Verbreiterung) in eine Mehrbrunnen-Glasplatte, die mit PBST gefüllt ist.
    7. Dehnen Sie die Larven unter dem Stereomikroskop mit einer Pinzette aus, um Defekte zu untersuchen. Es ist entscheidend, die Larven auszudehnen, da sich ihre Körper in der Fixierungslösung zusammenziehen.
  4. Untersuchung von Kutikula-Defekten bei ungeschlüpften Larven
    HINWEIS: Dieses Verfahren eignet sich zur Untersuchung früher embryonaler Phänotypen, insbesondere bei Embryonen, die das Schlüpfen nicht überleben.
    1. Für pRNAi geben Sie PBST in die Petrischale (7.2.4) und überführen ungeschlüpfte Embryonen mit einer abgeschnittenen P-1000-Pipettenspitze in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für eRNAi geben Sie PBST in die Petrischale (5.5.4), bürsten Sie die ungeschlüpften Embryonen von der Objektträgerfläche ab und überführen sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Fixieren Sie die Embryonen mit der Fixierungslösung und waschen Sie sie zur Visualisierung gemäß den Schritten 7.3.2–7.3.6 mit PBST.
    3. Lösen Sie die Embryonen unter dem Stereomikroskop in PBST mit einer Pinzette vorsichtig aus der Eihülle.
    4. Überführen Sie die Embryonen zurück in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (~ 200 µl Embryonen pro Röhrchen).
    5. Entfernen Sie so viel Lösung wie möglich.
    6. Fügen Sie 1 ml 90 %iger Milchsäure/10 %igen Ethanol hinzu. Stellen Sie das Zentrifugenröhrchen mindestens über Nacht in einen 60 °C warmen Inkubator.
      HINWEIS: Die Embryonen können mehrere Tage lang bei 60 °C belassen werden.
    7. Um die Embryonen zu präparieren, pipettieren Sie sie mit einer abgeschnittenen P-1000-Pipettenspitze auf einen Objektträger.
    8. Positionieren Sie die Embryonen manuell mit einer Pinzette in einer idealen Orientierung.
    9. Bedecken Sie die Embryonen mit einem Deckglas und betrachten Sie sie unter dem Mikroskop mittels DIC.
  5. Untersuchung zellulärer und molekularer Defekte
    HINWEIS: Dieses Verfahren eignet sich zur Untersuchung der zugrundeliegenden Ursachen von Kutikula-Phänotypen oder Letalität, die nicht mit Kutikula-Defekten einhergeht.
    1. Für pRNAi trennen Sie die Embryonen im geeigneten Entwicklungsstadium von den Wattebäuschen und überführen sie in einen Embryosammelkorb. Der Sammelkorb kann derselbe oder ähnlich dem sein, der für Drosophila-Embryosammlungen verwendet wird.
      1. Stellen Sie den Eikorb aus einem 25 ml großen Kunststoff-Scintillationszähler her, bei dem der Boden entfernt wurde, und schneiden Sie eine kreisförmige Öffnung (ca. 1 cm Durchmesser) in den Deckel. Legen Sie einen Kreis aus sehr feinem Netz (ca. 2,5 cm Durchmesser) in den Deckel, schrauben Sie das Scintillationsgefäß darauf und verwenden Sie es verkehrt herum.
      2. Da das Netz leicht entfernt werden kann, sobald die Embryonen abgespült sind, tauchen Sie das Netz zur Rückgewinnung eventuell daran haftender Embryonen in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Wasser.
    2. Für eRNAi geben Sie im geeigneten Entwicklungsstadium PBST in die Petrischale. Bürsten Sie die Embryonen von der Objektträgerfläche ab und überführen Sie sie in einen Embryosammelkorb.
      HINWEIS: Protokolle zur Fixierung, in situ-Hybridisierung, Antikörperfärbung und Kernfärbung finden sich bei Xiang et al. 201553.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Im Labor der Autoren wurde die RNAi-Technologie verwendet, um die funktionelle Evolution von Genen zu untersuchen, die die Segmentierung bei Insekten regulieren53,55. Obwohl alle Insekten segmentiert sind, scheinen sich die Gene, die diesen Prozess steuern, während der radiativen Diversifizierung der Insekten verändert zu haben26,38,56-63. Genetische Screens bei Drosophila identifizierten eine Gruppe von neun Pair-Rule-Segmentierungsgenen, die für die Ausbil...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Während im 20. Jahrhundert eine kleine Anzahl ausgeklügelter Modellsysteme (Mäuse, Fliegen, Würmer) entwickelt wurde, gab es im 21. Jahrhundert eine Welle neuer Tiersysteme, die in Labors auf der ganzen Welt entwickelt wurden. Diese neuen Systeme ermöglichen es den Wissenschaftlern, vergleichende, evolutionäre Fragen zu beantworten, die mit den "Standard"-Modellsystemen nicht allein untersucht werden können. Dieser Einsatz neuer Modelle erfordert die rasche Entwicklung von Methoden für die Laborkult...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Alison Heffer und Dr. Yong Lu für die Einrichtung des Mikroinjektionsgeräts und das Teilen ihres unschätzbaren Wissens und ihrer Erfahrung mit Insekten-RNAi. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01GM113230 bis L.P.) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dermestes maculatus lebende KäferUnser Labor oder Carolina Biological Supply#144168Unser Laborstamm wurde durch COI-Barcoding verifiziert; Stammvariationen aus Carolina können nicht ausgeschlossen werden Nassfutter
KatzenFancy FeastFleischstücke mit Soße. Kann in den meisten Tierfutter- und Lebensmittelgeschäften gekauft
Trockenfutter für HundePurina Puppy ChowKann in den meisten Tierfutter- und Lebensmittelgeschäften
gekauft Insektenkäfig (Größe mittel, 30,5 x 19 x 20,3 cm)Exo TerraPT2260Für die Erhaltung von Bienenvölkern. Kann bei Bedarf einen größeren Käfig verwenden
Insektenkäfig (Größe Mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)Exo TerraPT2250Für die Embryonenentnahme
PetrischaleVWR89038-968
WattebauschFisher22-456-883
Megascript T7 TranskriptionskitFisherAM1334Für 40 Reaktionen
Pneumatische PumpeWPIPV830
KapillarhalterWPI
MikromanipulatorNARISHIGEMN-151
Schwarzes Filterpapier (90  mm)VWR28342-010
Lebensmittelfarbe (grün)McCormick
Kapillare aus BorosilikatglasHilgenberg1406119
Nadelabzieher (Mikropipettenabzieher)Sutter Instrument Co.P-97
Objektträger aus MikroskopglasWorldWide Life Sciences Division41351157
Versiegelungsfolie (Parafilm M)Fisher13-374-12
Modell 801 Spritze (10  &Mikro; l)Hamilton7642-01
Nadel (32 Gauge) Hamilton7762-05
Fixierlösung (Pampel's)BioQuip Products, Inc.1184CGiftig, muss in der Abzugszange gehandhabt werden
(DUMONT #5)Fine Science Tools11252-30
Deckglas (24 x 50 mm, Nr. 1.5)Globe Scientific1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader PipettenspitzeFisherE5242956003
Präpariermikroskopie für die EmbryoneninjektionLeicaM420
Präpariermikroskopie für die phänotypische Visualisierung von LarvenZeissSteREO Discover. V12
DIC MikroskopieZeissAXIO Imager. M1
für werden

Referenzen

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
  3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
  4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
  5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
  7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
  8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208(2004).
  9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
  10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
  12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
  13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
  14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
  16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
  19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
  22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
  23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822(2015).
  24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674(2015).
  26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
  27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
  28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
  29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
  30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
  31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
  32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
  33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
  34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
  35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
  36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
  37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
  38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440(2014).
  39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
  40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602(2012).
  41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
  42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
  43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
  44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
  45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
  47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
  48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
  49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
  50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
  51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
  52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
  53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32(2015).
  54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
  55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
  56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
  57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490(2012).
  58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
  59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
  60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
  61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
  62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
  63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
  64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
  65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
  66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
  67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
  68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
  69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
  70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
  71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
  72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
  73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5(2013).
  74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
  75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
  76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

RNA-Interferenzembryonale RNAiparentale RNAiKäferzuchtdsRNA-InjektionEmbryoinjektionphänotypische AnalyseKutikulapräparation
Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Dermestes maculatus
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.