Methodenartikel

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Dermestes maculatus

DOI:

10.3791/54976

⸱

28. Dezember 2016

 ,  , 
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir Protokolle für die Aufzucht eines intermediären Keimkäfers, Dermestes maculatus (D. maculatus) im Labor. Wir teilen auch Protokolle für embryonale und elterliche RNAi und Methoden zur Analyse embryonaler Phänotypen, um die Genfunktion bei dieser Spezies zu untersuchen.

Zusammenfassung

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Fortschritte in der Genomik haben die Möglichkeit eröffnet, die Artenvielfalt in einem noch nie dagewesenen Ausmaß zu untersuchen. Die Sequenz allein wird jedoch ohne Werkzeuge zur Untersuchung der Genfunktion nicht aussagekräftig sein. Die Entwicklung und der Austausch detaillierter Protokolle für die Etablierung neuer Modellsysteme in Laboratorien und für Werkzeuge zur Durchführung funktioneller Studien ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Leistungsfähigkeit der Genomik zu nutzen. Coleoptera (Käfer) sind die größte Gruppe von Insekten und bewohnen praktisch alle Arten von Lebensräumen auf dem Planeten. Studien an Käfern liefern nicht nur ideale Modelle für die Grundlagenforschung, sondern können auch Auswirkungen auf die Schädlingsbekämpfung haben, da sie häufig Schädlinge in Haushalten, in der Landwirtschaft und in der Lebensmittelindustrie sind. Es werden detaillierte Protokolle für die Aufzucht und Pflege von D. maculatus-Laborkolonien und für die Durchführung von dsRNA-vermittelter Interferenz in D. maculatus vorgestellt. Sowohl embryonale als auch elterliche RNAi-Verfahren - einschließlich der Einrichtung des Apparats, der Vorbereitung, der Injektion und der Wiederherstellung nach der Injektion - werden beschrieben. Es werden auch Methoden zur Analyse embryonaler Phänotypen vorgestellt, einschließlich Lebensfähigkeit, Musterungsdefekte bei geschlüpften Larven und Kutikulapräparationen für nicht geschlüpfte Larven. Diese Assays, zusammen mit der in situ Hybridisierung und Immunfärbung für molekulare Marker, machen D. maculatus zu einem zugänglichen Modellsystem für die Grundlagen- und angewandte Forschung. Darüber hinaus liefern sie nützliche Informationen für die Etablierung von Verfahren in anderen aufkommenden Insektenmodellsystemen.

Einleitung

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1998 berichtete Fire and Mello , daß doppelsträngige RNA (dsRNA) Hemmung der Genfunktion in Caenorhabditis elegans 1 induzieren kann. Diese Antwort , ausgelöst durch dsRNA wurde RNA - Interferenz (RNAi) genannt, und solche RNAi-vermittelte Gen - Silencing wurde berichtet , in Tieren, Pflanzen konserviert zu sein, und Pilze 2-7. In Pflanzen und einige Tiere, systemisch RNAi - Funktionen, was bedeutet , dass der Effekt auf andere Zellen / Gewebe ausbreiten , wo wird dsRNA nicht direkt eingeführt ( zusammengefasst in 8-10). Wissenschaftler haben von dieser endogenen zellulären RNAi - Antwort von dsRNAs Gestaltung Gene von Interesse zu zielen, wodurch Klopfen nach unten Genfunktion , ohne direkt die Manipulation des Genoms ( zusammengefasst in 11-14) gemacht.

RNAi ist ein leistungsfähiges Werkzeug für funktionelle Studien aufgrund der folgenden Vorteile. Erstens, selbst bei minimaler Gensequenz Informationen kann ein Gen gezielt RNAi verwendet. Dies ist besonders wichtig für studies von Nicht-Modellorganismen genomischen oder Transkriptom-Daten fehlen. Zweitens in Organismen, die RNAi-Antwort robust systemisch ist, kann RNAi-vermittelte Knock-Down bei fast jedem beliebigen Entwicklungsstadium durchgeführt werden. Diese Funktion ist sehr nützlich, um die Funktion von pleiotropen Gene zu studieren. Drittens, in einigen Fällen spreizen RNAi - Effekte auf die Gonaden und Nachkommen, so dass Phänotypen in Nachkommen 15,16 beobachtet werden. Dieses Phänomen, bekannt als elterliche RNAi (pRNAi), ist besonders vorteilhaft für Gene Embryonalentwicklung beeinflussen, zahlreiche Nachkommen von einem einzigen injiziert Mutter hergestellt ohne direkte Manipulation von Eiern untersucht werden. Aus diesen Gründen ist pRNAi die Methode der Wahl. Wenn jedoch pRNAi unwirksam ist, beispielsweise für die Gene für Oogenese erforderlich, dann embryonale RNAi (eRNAi) verwendet werden. Viertens kann RNAi verwendet werden, um das Äquivalent einer allelischen Serie, dass zur Erzeugung der Menge an dsRNA geliefert über einen Bereich variiert werden kann schwach bis stark Defekte zu produzieren. Eine solche Abstufung von Phänotypen können für das Verständnis der Genfunktion hilfreich sein, wenn das Gen in einem komplexen Prozess und / oder vollständigen Verlust der Funktion beteiligt ist, ist letal. Fünftens Lieferung von dsRNA ist in der Regel einfach und machbar, vor allem bei Tieren robusten Reaktionen systemischen RNAi zeigt. dsRNA kann durch Mikroinjektion 1,5, Fütterung / Aufnahme 17,18, Einweichen, 19,20 und Viren / Bakterien-vermittelte Abgabe 21,22 eingeführt werden. Sechstens, im Gegensatz zu einigen Gen-Targeting / Bearbeitungsmethoden, gibt es keine Notwendigkeit für Organismen tragen die Mutation zu screenen oder genetische Kreuzungen durchzuführen Homozygoten zu erzeugen, wenn RNAi verwendet wird. Daher kann im Vergleich zu vielen anderen Techniken zur Untersuchung der Genfunktion ist RNAi schnell, kostengünstig und kann für großflächige Bildschirme 23-25 aufgebracht werden.

Die breite Anwendung von RNAi stellt Mittel bereit, funktionelle Studien in einem breiten Spektrum von Organismen durchzuführen, um den Bereich der Arten für das Studium zur Verfügung expandierenden beyond die traditionellen Modellsysteme für die genetische Werkzeuge entwickelt worden. Zum Beispiel können nicht-Modellsysteme Studien mit benötigt Einblicke in die Evolution von Genen und Gen - Netzwerken zu geben , indem die Funktionen von Orthologen von Spezies zu vergleichen , die unterschiedliche Entwicklung Modi oder ausstellenden verschiedene morphologische Merkmale 26-29. Diese Art von Studien wird ein besseres Verständnis der biologischen Vielfalt zur Verfügung stellen, mit Auswirkungen sowohl für angewandte und Grundlagenforschung.

Als die größte Tiergruppe auf dem Planeten, Insekten bieten eine große Chance, die zugrunde liegenden Mechanismen Vielfalt zu erkunden. Darüber hinaus sind Insekten im Allgemeinen klein, haben kurze Lebenszyklen, hohe Fruchtbarkeit und sind leicht nach hinten im Labor. In den vergangenen zwei Jahrzehnten hat sich RNAi erfolgreich bei Insekten Spanning Aufträge angewendet worden, einschließlich Diptera (Zweiflügler) 5, Lepidoptera (Schmetterlinge und Motten) 30, Coleoptera (Käfer) 16,31, Hautflügler (SAWFLügen, Wespen, Ameisen und Bienen) 32, Hemiptera (true Bugs), Isoptera (Termiten) 34, Blattodea (Schaben) 35, Orthoptera (Grillen, Heuschrecken, Heuschrecken und katydids) 36 und Phthiraptera (Läuse) 37. Die erfolgreiche Anwendung von RNAi hat sich für die Untersuchung der Musterung in der frühen Embryonalentwicklung (anterior-posteriore Achse 32, dorsalen-ventralen Achse 28, Segmentierung 26,38) funktionelle Daten zur Verfügung gestellt, die Geschlechtsbestimmung 39,40, Chitin / Kutikula Biosynthese 41, Ecdyson 42 signalisiert, Sozialverhalten 43 und mehr. RNAi Methoden für verschiedene Insektenarten entwickelt werden , können von zusätzlichen Vorteil sein, dass sie geeignet sind , für die Schädlingsbekämpfung , nützlich zu sein ( zusammengefasst in 44-46). RNAi-Effekte werden genspezifische sowie artspezifischen, solange nicht konservierten Regionen für die Ausrichtung gewählt. Für nützlichen Insektenarten wie Honigbienen und Seidenwürmer, Gene von entscheidender Bedeutung für das Überleben der TargetingViren oder Parasiten - Infektion zu kontrollieren kann eine neue Strategie bieten diese Spezies 47,48 zu schützen.

Dermestes maculatus (D. maculatus), gebräuchliche Bezeichnung verbergen Käfer, ist weltweit mit Ausnahme der Antarktis verteilt. Als holometabolous Insekt umfasst das D. maculatus Lebenszyklus embryonale, Larven, Puppen und adulten Stadien (Abbildung 1). Weil es auf Fleisch ernährt, ist D. maculatus in Museen verwendet tote Tiere zu skeletonize und forensische Entomologen können es verwenden Zeitpunkt des Todes 49,50 abzuschätzen. D. maculatus ernährt sich von tierischen Erzeugnissen einschließlich Kadaver, getrocknetes Fleisch, Käse, und die Puppen / Kokons von anderen Insekten und somit verursacht Schäden an Haushalte, Vorrats und die Seide, Käse und Fleischindustrie 51,52. RNAi in diesem Käfer Anwendung könnte eine effiziente und umweltfreundliche Art und Weise zur Verfügung stellen ihre wirtschaftlichen Auswirkungen zu minimieren. Unser Labor hat D. maculatus als neues m verwendetodel Insekt zu studieren Segmentierung 53. Neben den Lab - Aufzucht zugänglich ist, ist D. maculatus von Interesse für die Grundlagenforschung , wie es ein Zwischenkeim - Entwickler ist es eine nützliche Art den Übergang zwischen kurz- und langfrisKeim Entwicklung zu studieren.

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Abbildung 1: Lebenszyklus von D. maculatus. Fotografien von D. maculatus in verschiedenen Lebensphasen, wie angegeben. Der Lebenszyklus vom Ei bis zum erwachsenen dauert drei Wochen bei 30 ° C, jedoch bei niedrigeren Temperaturen länger. (A, F) frisch gelegten Embryonen sind weiß bis hellgelb und oval, etwa 1,5 mm in der Länge. Embryonalentwicklung dauert ca. 55 Stunden bei 30 ° C. (B, C und G) Larven haben dunkle pigmentierte Streifen und sind mit Setae bedeckt. gehen Larvae durch mehrere instars abhängig von der Umgebung und deren Länge bis über 1 cm verlängern kann. (D, H) (E, I) Kurz nach dem Schlüpfen, erscheint dunkle Pigmentierung über die erwachsenen Käfer Körper. Erwachsene können bis zu mehrere Monate leben und eine Frau Hunderte von Embryonen über ihr Leben legen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bisher haben wir gezeigt , dass RNAi in Klopfen nach unten Genfunktion in D. wirksam ist maculatus 53. Hier unsere Erfahrung Aufzucht D. maculatus Kolonien im Labor wird zusammen mit Schritt- für -Schritt - Protokolle geteilt sowohl für die embryonale und die elterliche RNAi Set-up, Injektion, Nacheinspritzung Pflege und phänotypische Analyse. Die dsRNA-vermittelte Knock-Down und Analyseverfahren hier eingeführt nicht nur detaillierte Informationen zu Fragen in D. maculatus Adressierung, sondern auch potenzielle Bedeutung haben for RNAi in anderen nicht-Modell Käfer / Insektenarten anwenden.

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Protokoll

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1. Aufzucht von D. maculatus

HINWEIS: Eine Zuchtkolonie von D. maculatus wurde im Labor der Autoren aus adulten und kommerziell gekauften Larven aufgebaut. Die Identität der Art wurde mittels DNA-Barcodingverifiziert 53.

  1. Um einen neuen Käfig im Labor einzurichten, verteilen Sie eine dünne Schicht Holzspäne in einen mittelgroßen Insektenkäfig (30,5 x 19 x 20,3 cm3). Legen Sie ein ~ 10 x 6 x 3 cmgroßes Stück Styropor in den Käfig, damit sich die Larven zur Verpuppung verstecken können. Fügen Sie 20 - 50 Käfer hinzu (entweder erwachsene Käfer oder späte Larven). Käfer verstecken sich in den Holzspänen.
  2. Geben Sie Nassfutter für Katzen in eine Petrischale oder ein Waagschiffchen. Decken Sie den Käfig mit einem Netztuch ab und stellen Sie den Käfig in einen Inkubator.
  3. Um eine Brutkolonie im Labor zu erhalten, stellen Sie die Temperatur zwischen 25 und 30 °C ein. D. maculatus wächst bei höheren Temperaturen schneller, fördert aber auch das Wachstum von Pilzen und Milben. Um ein gesundes Volk zu erhalten, verwenden Sie 25 - 28 °C für die regelmäßige Bestandspflege und 30 °C für eine schnelle Ausdehnung des Volkes. Der Lebenszyklus dauert je nach Umweltfaktoren etwa drei Wochen bis vier Monate50 (Abbildung 2).

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Abbildung 2: D. maculatus Lab Colony. Gezeigt wird ein Foto eines typischen D. maculatus-Insektenkäfigs. Holzspäne werden ausgestreut, damit sich die Käfer verstecken können. Katzenfutter wird in eine kleine Petrischale oder ein Waagschiffchen gegeben. Styropor wird in den Käfig gelegt, um den letzten Larven im Stadium Zuflucht zu bieten, damit sie sich verpuppen können. Der hier gezeigte Käfig ist 30,5 x 19 x 20,3 cm3 groß und beherbergt einige hundert Larven, Puppen und erwachsene Tiere. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Lassen Sie die Eier im Käfig reifen. Um die Kolonie zu erweitern, richten Sie neue Käfige mit Eiern (gesammelt wie in Abschnitt 2 beschrieben), Larven oder erwachsenen Tieren, wie oben, ein. D. maculatus legt Eier im gesamten Käfig ab, insbesondere in der Nähe der Nahrungsquelle.
  2. Wechseln Sie das Nassfutter für Katzen etwa zweimal pro Woche.
    HINWEIS: Aufgrund des unangenehmen Geruchs von Katzennassfutter wurden auch alternative Futterquellen getestet (siehe Diskussion).

2. Entnahme von Embryonen

  1. Um eine Sammlung anzulegen, trennen Sie mindestens 50 Männchen und 50 Weibchen von der Kolonie. Junge Erwachsene sind am besten. Setzen Sie die erwachsenen Tiere in einen Mini-Käfig (17,8 x 10,2 x 12,7 cm3) ohne Holzspäne. Geben Sie Katzenfutter in ein Waagschiffchen.
  2. Bevor Sie mit der Entnahme beginnen, überprüfen Sie den Käfig sorgfältig auf vorhandene Embryonen und entfernen Sie diese. Legen Sie einen gespannten Wattebausch in den Käfig und lassen Sie den Käfig in einem 30 °C heißen Inkubator. Nach dem entsprechenden Zeitfenster ist der Wattebausch bereit für die Embryoentnahme.
  3. Falten Sie ein Stück schwarzes Bastelpapier (A4-Format) in der Mitte, um eine Falte zu erzeugen, und falten Sie es dann auf.
  4. Den gespannten Wattebausch aus dem Käfig nehmen. Nehmen Sie die erwachsenen Tiere aus dem Wattebausch und setzen Sie sie wieder in den Käfig.
  5. Während du den gespannten Wattebausch ganz vorsichtig zusammenkneifst, reiße ihn langsam in dünne Wattefäden auseinander, damit die Eier auf das schwarze Papier fallen können.
    HINWEIS: D. maculatus-Embryonen sind zerbrechlich und in Baumwolle schwer zu erkennen. Sie können leicht zerdrückt werden, wenn man den Wattebausch zu fest hält.

3. dsRNA-Vorbereitung

  1. DNA-Template-Vorbereitung für die dsRNA-Synthese
    1. Führen Sie 4 - 6 50 μl PCR-Reaktionen mit Primern durch, die T7-Promotorsequenzen an beiden 5'-Enden enthalten, um das DNA-Template gemäß dem Protokoll des Herstellers zu amplifizieren.
    2. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem kommerziellen PCR-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die ideale Endkonzentration des DNA-Templates liegt bei ≥ 100 ng/μl.
  2. Vorbereitung des Injektionspuffers
    1. Bereiten Sie 100 ml Injektionspuffer (0,1 mM NaH2PO4, 5 mM KCl) vor. Stellen Sie den pH-Wert mit 5 M NaOH auf 6,8 ein.
    2. Aliquote bei -20 °C lagern.
  3. dsRNA-Synthese
    1. Richten Sie eine Reaktion in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen auf Eis ein und führen Sie eine In-vitro-Transkriptionsreaktion mit T7-Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von ~ 500 ng Template pro Reaktion durch.
    2. Inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei 37 °C.
    3. Verdauen Sie das DNA-Template mit DNase gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    4. Das Rohr auf 94 °C erhitzen und 3 min auf 94 °C halten.
    5. Um die dsRNA zu glühen, kühlen Sie das Röhrchen langsam um 1 °C/min ab, bis es nach 1 Std. 45 °C erreicht
      HINWEIS: Die Schritte 3.3.2 bis 3.3.5 können in einem Thermocycler durchgeführt werden.
    6. Zur Ethanolfällung von dsRNA werden 280 μl RNasefreies Wasser zu 20 μl Reaktionsmenge hinzugefügt, um ein Endvolumen von 300 μl zu erreichen. 30 μl 3 M NaOAc (pH 5,2) und 650 μl Ethanol werden hinzugefügt. Stellen Sie das Röhrchen über Nacht in den -20 °C Gefrierschrank.
    7. Nach dem Zentrifugieren bei 15.682 x g für 30 min bei 4 °C wird das dsRNA-Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen. Granulat trocknen und in 20 μl Injektionspuffer auflösen.
    8. Die Konzentration der dsRNA wird mit einem Spektralphotometer bei A260 gemessen. Die ideale Konzentration liegt bei 3 - 5 μg/μl. Überprüfen Sie die Qualität, indem Sie 5 μl einer 1:25-Verdünnung von dsRNA 30 Minuten lang auf ein 1%iges Agarosegel bei 90 V laufen lassen. Ein einzelnes Band der erwarteten Größe ist gut sichtbar.
    9. Lagern Sie die dsRNA bei -20 °C oder kälter.
      HINWEIS: Fügen Sie für jedes RNAi-Knockdown-Experiment eine Kontroll-dsRNA hinzu, von der nicht erwartet wird, dass sie den untersuchten Prozess beeinflusst. gfp dsRNA ist eine hervorragende Kontrolle für die meisten Experimente. Bereiten Sie die Kontroll-dsRNA vor und injizieren Sie sie Seite an Seite mit der experimentellen dsRNA.

4. Montage von Mikroinjektor und Mikromanipulator

HINWEIS: Siehe Abbildung 3.

  1. Schließen Sie Stickstoff oder eine andere Luftzufuhr an den Druckeingang eines pneumatischen Pumpeninstruments an. Wenn keine pneumatische Pumpe verfügbar ist, üben Sie mit einer 50-ml-Spritze, die an einen feinen Schlauch angeschlossen ist, Druck aus.
  2. Schließen Sie einen Fußschalter an den Remote-Anschluss der Pumpe an, um den Auswurfdruckfluss zu steuern.
  3. Befestigen Sie einen Glaskapillarhalter mit Schlauch an der Auswurfdrucköffnung der Pumpe.
  4. Befestigen Sie den Kapillarhalter an einem Mikromanipulator in der Nähe eines Präpariermikroskops.

5. Embryonale RNAi

HINWEIS: Abbildung 4 zeigt ein Flussdiagramm der embryonalen RNAi von D. maculatus.

  1. eRNAi-Vorbereitung
    1. Bereiten Sie einen Deckel der Petrischale (90 mm Durchmesser) für einen Embryo vor. Legen Sie ein Stück schwarzes Filterpapier darauf, die Innenseite des Deckels abzudecken. Legen Sie einen handelsüblichen Objektträger auf das schwarze Papier.
    2. Verdünnen Sie die dsRNA mit einem Injektionspuffer auf die entsprechende Konzentration. Verwenden Sie 2 - 3 μg/μl für erste Experimente. Bewahren Sie dsRNA vor der Injektion immer auf Eis auf.
    3. Geben Sie Lebensmittelfarbe in einer Verdünnung von 1:40 zu der dsRNA und pipettieren Sie sie mehrmals vorsichtig, um sie gut zu vermischen.
  2. Entnahme von Embryonen für die Injektion
    HINWEIS: Bei 25 °C wandern die Zellkerne in Embryonen 6 - 8 Stunden nach der Eiablage (AEL) in Richtung der Eiperipherie53. Ein zelluläres Blastoderm wird innerhalb von 8 - 10 Stunden AEL53 etabliert. Um sicherzustellen, dass Embryonen vor dem zellulären Blastodermstadium zur Injektion verwendet werden, werden 0 - 3 Stunden AEL-Embryonen zur Verwendung empfohlen53. Die Entnahme, Vorbereitung und Injektion der Embryonen dauert in der Regel weniger als 2 Stunden, wenn die Glaskapillaren in gutem Zustand sind. Daher kann der gesamte Vorgang innerhalb von 5 Stunden AEL abgeschlossen werden.
    1. Entnehmen Sie die Embryonen wie in den Schritten 2.2-2.5 beschrieben.
    2. Klopfen Sie auf das schwarze Bastelpapier, um die Embryonen in den Deckel der Sammelschale zu übertragen.
    3. Kleben Sie doppelseitiges Klebeband entlang der Kante der Folie.
    4. Richten Sie die Embryonen auf dem Klebeband mit einem Pinsel senkrecht zur Gleitkante aus, wobei das vordere oder hintere Ende an der Kante liegt. Beachten Sie, dass das vordere und das hintere Ende früher Embryonen nicht ohne weiteres zu unterscheiden sind, so dass im Durchschnitt die Hälfte am hinteren Ende injiziert wird, was ideal ist.
  3. Laden der dsRNA in die Glaskapillare
    1. Nehmen Sie 2 - 4 μl dsRNA in eine 20 μl Microloader-Pipettenspitze auf.
    2. Führen Sie die Spitze in eine vorgezogene Glaskapillare (als Nadel bezeichnet) ein und pipettieren Sie die dsRNA-Lösung vorsichtig in die Kapillare. Bereiten Sie Nadeln aus handelsüblichen Glaskapillaren mit einem Mikropipettenabzieher vor. Ein Beispiel für eine ideal gezogene Nadel ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Länge und Verjüngung der Nadeln muss nach Injektionsversuchen möglicherweise optimiert werden.
    3. Befestigen Sie die Glaskapillare in den Glaskapillarhalter.
    4. Montieren Sie den Kapillarhalter in den Mikromanipulator.
  4. Injektion von dsRNA in Embryonen
    1. Übertragen Sie den Objektträger mit den Embryonen vorsichtig auf den Tisch des Präpariermikroskops.
    2. Bewegen Sie den Objektträger, um einen Embryo in die Mitte des Feldes zu bringen und das Mikroskop zu fokussieren.
    3. Positionieren Sie die Spitze der Kapillare mit dem Mikromanipulator, während Sie in das Präpariermikroskop schauen. Führe die Spitze nahe an das Ende des ersten Embryos in der Reihe.
    4. Schalten Sie die Stickstoff- oder andere Luftzufuhr ein.
    5. Stellen Sie den Wahlschalter des Magneteingangs auf Vakuum.
    6. Stellen Sie den Auswurfdruckregler auf 10 - 15 psi ein. Passen Sie den Druck je nach Gerät an.
    7. Öffnen Sie bei Bedarf die Kapillare. Sobald die Spitze geöffnet ist, füllt die farbige dsRNA-Lösung die Spitze.
    8. Bewegen Sie die Kapillarspitze nach vorne, um den Embryo zu punktieren. Wenn der Druck ideal eingestellt ist, fließt keine embryonale Flüssigkeit in die Kapillare.
    9. Treten Sie auf den Fußschalter, um dsRNA-Lösung in den Embryo auszustoßen, bis eine angemessene Menge der Lösung ausgestoßen wird. Abbildung 5 zeigt Beispiele für die Morphologie von Embryonen nach Injektion geeigneter und unangemessener Mengen der Lösung.
    10. Halten Sie die Kapillarspitze für ~ 2 Sekunden im Embryo und entfernen Sie sie dann.
    11. Bewegen Sie die Kapillare zum nächsten Embryo und wiederholen Sie die Schritte 5.4.8 - 5.4.10, bis alle Embryonen injiziert sind. Wechseln Sie die Glaskapillare, wenn sie verstopft ist oder bricht.
  5. Erholung und Inkubation nach der Injektion
    1. Legen Sie den Objektträger nach der Injektion in eine Petrischale.
    2. Gib einen nassen Wattebausch in die Petrischale. Lassen Sie den Wattebausch nicht die Rutsche berühren.
    3. Decken Sie die Petrischale ab und wickeln Sie sie mit Siegelfolie ein. Beschriften Sie die Schale mit dem Namen der dsRNA, der Konzentration, dem Datum, der Uhrzeit und der Anzahl der injizierten Embryonen.
    4. Stellen Sie die Petrischale in einen 30 °C heißen Inkubator, bis die Embryonen schlüpfen.

6. Elterliche RNAi

  1. Isolierung von Puppen für pRNAi
    1. Sammle Puppen aus der Kolonie.
    2. Sortieren Sie männliche und weibliche Puppen unter dem Mikroskop (siehe Abbildung 6). Bewahren Sie sie in zwei separaten Petrischalen in einem 30 °C-Inkubator auf, um sicherzustellen, dass vor der Injektion keine Paarung stattfindet.
    3. Überprüfen Sie jeden Tag auf geschlossene Erwachsene. Die Verpuppung dauert in der Regel 5 - 7 Tage bei 30 °C.
    4. Übertragen Sie männliche und weibliche Hündchen (siehe Abbildung 6) in zwei getrennte Petrischalen und füttern Sie sie jeden zweiten Tag mit Katzenfutter, bis sie zur Injektion bereit sind.
    5. Fahren Sie mit der Injektion fort, sobald genügend Frauen und Männer in angemessenem Alter vorhanden sind. Weibchen 4 bis 8 Tage nach der Eklosion sind am besten. Für eine typische Analyse werden 8 - 12 Weibchen verwendet. Für die Paarung wird die gleiche Anzahl von Männchen benötigt54.
  2. Injektion von dsRNA in den weiblichen Bauch
    1. dsRNA auf Eis vorbereiten (5.1.2 und 5.1.3).
    2. Befestigen Sie eine 32-Gauge-Nadel an einer 10-μl-Spritze.
    3. Betäuben Sie Weibchen im CO2 -Stadium.
    4. Laden Sie dsRNA-Lösung in die Spritze, ohne Luft aufzunehmen.
    5. Halten Sie mit einer Hand eine weibliche Bauchseite nach oben und halten Sie die Spritze mit der anderen fest.
    6. Dringen Sie mit der Nadelspitze vorsichtig in die Segmacoria (Membran) zwischen den Sterniten 2 und 3 ein. Abbildung 7 zeigt ein Weibchen während der Injektion. Wenn die Nadel nicht leicht in das Gewebe eindringt, winkeln Sie die Nadel nach oben und drücken Sie sie langsam nach unten. Führen Sie ca. 2 mm der Nadel in den Körper ein.
    7. Überprüfen Sie die Spritzenskala, während Sie den Kolben langsam drücken, und injizieren Sie ~ 2 μl pro Frau.
    8. Halten Sie die Nadel nach der Injektion mindestens 5 Sekunden lang still, bevor Sie sie aus dem Bauch der Frau entfernen.
    9. Übertragen Sie die injizierten Weibchen in eine Petrischale (90 mm Durchmesser) und füttern Sie sie mit Katzenfutter.
    10. Beschriften Sie die Petrischale mit dem dsRNA-Namen, der injizierten Menge, dem Datum und der Anzahl der weiblichen Tiere.
  3. Wiederherstellung und Verbindung nach der Injektion
    1. Inkubieren Sie die Petrischale in einem 30 °C heißen Inkubator.
    2. Nach 24 Stunden werden die injizierten Weibchen in einen Minikäfig überführt.
    3. Geben Sie die gleiche Anzahl nicht injizierter junger Männchen in den Käfig und beschriften Sie den Käfig.
    4. Legen Sie ein Wiegeschiffchen mit Katzenfutter in den Käfig.
    5. Lassen Sie den Käfig in einem 30 °C heißen Inkubator, um die Paarung zu ermöglichen. Nach 24 Stunden sollten die Weibchen mit der Eiablage beginnen und die Embryonen können täglich oder in den erforderlichen Zeitabständen entnommen werden.

7. Phänotypische Analyse nach RNAi

HINWEIS: Bei 30 °C dauert es ~ 55 Stunden, bis Eierschlüpfen 50.

  1. eRNAi-Viabilitätsanalyse
    1. Berechnen Sie die Schlupfrate, indem Sie die Anzahl der geschlüpften Larven mit der Gesamtzahl der injizierten Embryonen vergleichen. Achten Sie darauf, eine Negativkontrollinjektion einzuschließen, da Embryonen durch das Injektionsverfahren geschädigt oder getötet werden können. Typische Schlupfraten variieren zwischen 30 % und 60 %. Hüten Sie sich vor geschlüpften Larven, die ungeschlüpfte Eier fressen.
  2. pRNAi-Viabilitätsanalyse
    HINWEIS: Wenn die Lebensfähigkeit der Weibchen durch das Gen beeinflusst wird, auf das RNAi abzielt, beginnen Weibchen, die mit spezifischer dsRNA, aber nicht mit negativer dsRNA injiziert werden, zu sterben. Wenn die Eiproduktion oder die Eiablage beeinträchtigt wird, zeigen die Weibchen eine teilweise oder vollständige Sterilität. Bewertung des Überlebens der Weibchen im Vergleich zu Negativkontrollen oder Vergleich der Gesamtzahl der von Versuchs- und Kontrollweibchen gelegten Eier (7.2.3).
    1. Richten Sie die Embryonenentnahme nach Schritt 2.2 ein.
    2. Nach 24 Stunden entnehmen Sie die Embryonen gemäß den Schritten 2.4 - 2.5.
    3. Zählen Sie die Gesamtzahl der Embryonen.
    4. Übertragen Sie die Embryonen in eine 90 mm Petrischale. Beschriften Sie die Petrischale mit dem Zielgen, dem Entnahmedatum und der Anzahl der Embryonen.
    5. Inkubieren Sie die Embryonen in einem 30 °C heißen Inkubator, bis sie schlüpfen. Da geschlüpfte Larven sich von nicht geschlüpften Embryonen ernähren, sollten Sie die Petrischale häufig kontrollieren und geschlüpfte Larven mit einer Pinzette von ungeschlüpften Embryonen trennen (siehe Diskussion).
    6. Zählen Sie die Anzahl der geschlüpften Embryonen und berechnen Sie die Schlupfrate.
  3. Untersuchung von Nagelhautdefekten bei geschlüpften Larven
    1. Sammeln Sie geschlüpfte Larven in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. In einen Abzug 1 ml Fixierlösung geben.
    3. Lassen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mindestens über Nacht bei 4 °C, damit die Lösung in das Larvengewebe eindringen kann.
    4. Um dies zu visualisieren, entfernen Sie so viel Fixiermittel wie möglich aus der Tube.
    5. Spülen Sie die Larven mindestens dreimal mit PBST aus.
    6. Übertragen Sie die Larven mit einer P-1000-Pipettenspitze auf eine Multi-Well-Glasplatte mit PBST, wobei das Ende abgeschnitten wird, um es zu verbreitern.
    7. Unter einem Präpariermikroskop dehnen Sie die Larven mit einer Pinzette, um die Defekte zu untersuchen. Es ist wichtig, die Larven auszustrecken, um Defekte zu untersuchen, während sich ihr Körper im Fixiermittel zusammenzieht.
  4. Untersuchung von Nagelhautdefekten bei nicht geschlüpften Larven
    Hinweis: Dieses Verfahren ist nützlich für die Untersuchung früher embryonaler Phänotypen, insbesondere für Embryonen, die nicht bis zum Schlüpfen überleben.
    1. Bei pRNAi wird PBST in die Petrischale (7.2.4) gegeben und die nicht geschlüpften Embryonen mit einer P-1000-Pipettenspitze und dem abgeschnittenen Ende in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Für eRNAi geben Sie PBST in die Petrischale (5.5.4), bürsten Sie nicht geschlüpfte Embryonen vom Objektträger ab und übertragen Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Fixieren Sie die Embryonen mit Fixierlösung und spülen Sie sie zur Visualisierung mit PBST ab, indem Sie die Schritte 7.3.2 - 7.3.6 befolgen.
    3. Präparieren Sie mit einer Pinzette Embryonen aus der Eischale unter einem Präpariermikroskop in PBST.
    4. Übertragen Sie die Embryonen zurück in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (~ 200 μl Embryonen in jedem Röhrchen).
    5. Entfernen Sie so viel Lösung wie möglich.
    6. 1 ml 90 % Milchsäure/10 % EtOH hinzufügen. Lassen Sie das Zentrifugenröhrchen mindestens über Nacht in einem 60 °C heißen Inkubator.
      HINWEIS: Embryonen können mehrere Tage lang bei 60 °C belassen werden.
    7. Um die Embryonen zu montieren, pipettieren Sie sie mit einer P-1000-Pipettenspitze auf einen Objektträger, wobei das Ende abgeschnitten ist.
    8. Positionieren Sie die Embryonen manuell mit einer Pinzette in einer idealen Ausrichtung.
    9. Decken Sie die Embryonen mit einem Deckglas ab und visualisieren Sie sie unter dem Mikroskop mit DIC.
  5. Untersuchung zellulärer und molekularer Defekte
    HINWEIS: Dieses Verfahren ist nützlich, um die zugrunde liegenden Ursachen von Nagelhautphänotypen oder Letalität zu untersuchen, die nicht von Nagelhautdefekten begleitet werden.
    1. Für pRNAi trennen Sie die Embryonen in einem geeigneten Entwicklungsstadium von Wattebällchen und übertragen Sie sie in einen Embryo-Sammelkorb. Der Entnahmekorb kann derselbe oder ein ähnlicher sein wie der, der für die Entnahme von Drosophila-Embryonen verwendet wird.
      1. Den Eierkorb aus einem 25-ml-Szintillationsfläschchen aus Kunststoff herstellen, wobei der Boden des Fläschchens entfernt und ein Kreis aus dem Deckel ausgeschnitten wird (ca. 1 cm Durchmesser). Legen Sie einen Kreis aus superfeinem Netz mit einem Durchmesser von etwa 2,5 cm in den Deckel, schrauben Sie dann das Szintillationsfläschchen auf und verwenden Sie es auf dem Kopf.
      2. Da das Netz nach dem Waschen der Embryonen leicht entfernt werden kann, tauchen Sie das Netz in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit Wasser, um alle Embryonen zu bergen, die am Netz kleben.
    2. Für eRNAi geben Sie PBST zu einem geeigneten Zeitpunkt in die Petrischale. Bürsten Sie die Embryonen vom Objektträger ab und legen Sie sie in einen Embryo-Sammelkorb.
      HINWEIS: Fixierungs-, In-situ-Hybridisierungs-, Antikörperfärbungs- und Kernfärbeprotokolle finden sich in Xiang et al. 201553.

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Ergebnisse

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Das Labor der Autoren hat die RNAi-Technologie verwendet, um die funktionelle Evolution von Genen zu untersuchen, die die Segmentierung bei Insekten regulieren53,55. Während alle Insekten segmentiert sind, scheinen die Gene, die diesen Prozess regulieren, während der Insektenstrahlung auseinander gegangen zu sein26,38,56-63. Genetische Screenings in Drosophila identifizierten einen Satz von neun Paarregel-Segmentierungsgenen, die für die Förderung der Bildun...

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Diskussion

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Während im 20. Jahrhundert eine kleine Anzahl ausgeklügelter Modellsysteme (Mäuse, Fliegen, Würmer) entwickelt wurde, gab es im 21. Jahrhundert eine Welle neuer Tiersysteme, die in Labors auf der ganzen Welt entwickelt wurden. Diese neuen Systeme ermöglichen es den Wissenschaftlern, vergleichende, evolutionäre Fragen zu beantworten, die mit den "Standard"-Modellsystemen nicht allein untersucht werden können. Dieser Einsatz neuer Modelle erfordert die rasche Entwicklung von Methoden für die Laborkult...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Alison Heffer und Dr. Yong Lu für die Einrichtung des Mikroinjektionsgeräts und das Teilen ihres unschätzbaren Wissens und ihrer Erfahrung mit Insekten-RNAi. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01GM113230 bis L.P.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dermestes maculatus lebende KäferUnser Labor oder Carolina Biological Supply#144168Unser Laborstamm wurde durch COI-Barcoding verifiziert; Stammvariationen aus Carolina können nicht ausgeschlossen werden Nassfutter
KatzenFancy FeastFleischstücke mit Soße. Kann in den meisten Tierfutter- und Lebensmittelgeschäften gekauft
Trockenfutter für HundePurina Puppy ChowKann in den meisten Tierfutter- und Lebensmittelgeschäften
gekauft Insektenkäfig (Größe mittel, 30,5 x 19 x 20,3 cm)Exo TerraPT2260Für die Erhaltung von Bienenvölkern. Kann bei Bedarf einen größeren Käfig verwenden
Insektenkäfig (Größe Mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)Exo TerraPT2250Für die Embryonenentnahme
PetrischaleVWR89038-968
WattebauschFisher22-456-883
Megascript T7 TranskriptionskitFisherAM1334Für 40 Reaktionen
Pneumatische PumpeWPIPV830
KapillarhalterWPI
MikromanipulatorNARISHIGEMN-151
Schwarzes Filterpapier (90  mm)VWR28342-010
Lebensmittelfarbe (grün)McCormick
Kapillare aus BorosilikatglasHilgenberg1406119
Nadelabzieher (Mikropipettenabzieher)Sutter Instrument Co.P-97
Objektträger aus MikroskopglasWorldWide Life Sciences Division41351157
Versiegelungsfolie (Parafilm M)Fisher13-374-12
Modell 801 Spritze (10  &Mikro; l)Hamilton7642-01
Nadel (32 Gauge) Hamilton7762-05
Fixierlösung (Pampel's)BioQuip Products, Inc.1184CGiftig, muss in der Abzugszange gehandhabt werden
(DUMONT #5)Fine Science Tools11252-30
Deckglas (24 x 50 mm, Nr. 1.5)Globe Scientific1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader PipettenspitzeFisherE5242956003
Präpariermikroskopie für die EmbryoneninjektionLeicaM420
Präpariermikroskopie für die phänotypische Visualisierung von LarvenZeissSteREO Discover. V12
DIC MikroskopieZeissAXIO Imager. M1
für werden

Referenzen

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