Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

Parkinson-Krankheit (PD) ist eine unheilbare, altersbedingte neurodegenerative Erkrankung. Die Ursache für diese relativ häufige Erkrankung bleibt kaum verstanden. Es ist weit verbreitet Neuronenverlust im gesamten Gehirn, mit ausgeprägter neuronaler Degeneration von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra (SNC), was zu einem diagnostischen klinischen Merkmale der Bradykinesie, Rigor und Tremor.

Primäre Mischkulturen SNc dopaminergen Neuronen enthalten, sind besonders relevant für die Parkinson-Krankheit. Ventralen Tegmentum (VTA) dopaminergen Neuronen wurden in Lohn und Sucht beteiligt. Ventrale mesencephalen (VM) primären gemischten embryonalen Kulturen enthalten sowohl SNc und VTA dopaminergen (DA) Neuronen und GABAergen Neuronen. VM Primärkulturen können für Neuroprotektion Assays nützlich sein und die selektive Anfälligkeit von dopaminergen Neuronen aufzuklären. Es gibt keine zuverlässige Möglichkeit, dopaminergen Zellen in Kultur, die auf Morphologie zu identifizieren. ErSingle-Cell, High-Yield-RNA-Sequenzierung Bibliotheken re entwickeln wir Techniken einzelne dopaminergen Neuronen zu identifizieren und zu ernten, und zu konstruieren.

Wir berichten Vertreter RNA Transkriptom-Daten für einzelne dopaminergen und GABA-erge Neuronen aus Mittelhirns Kulturen isoliert. Dieses Protokoll kann für Neuroprotektion, Neurodegeneration und pharmakologische Tests verwendet werden, um die Wirkungen von verschiedenen Behandlungen auf dem DA / GABA Transkriptom zu studieren. Da dopaminergen Neuronen eine kleine Minderheit der exprimierten Neuronen in der primären VM Kulturen repräsentieren, die Fähigkeit, zuverlässig diese Neuronen in lebenden Kulturen identifizieren eine erweiterte Palette von Single-Cell-Studien ermöglichen. Diese neuen Techniken werden Fortschritte erleichtern, die Mechanismen zu verstehen, Platz auf der zellulären Ebene und Anwendungen an anderer Stelle in den Bereichen der Neurowissenschaften und Molekularbiologie haben.

HINWEIS: Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren durch die National Institutes of Health durchgeführt und Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am California Institute of Technology genehmigt.

1. Ableitung der primären dopaminergen Zellkulturen von embryonalen Mäusegehirn

1. Lösungen und Kulturmedium
   1. Herstellung von Ascorbinsäure-Stammlösung
      1. Man wiegt 352 mg Ascorbinsäure. Hinzufügen sterilem H ₂ O zu einem endgültigen Gesamtvolumen von 20 mL. Platz in 37 ° C warmen Wasserbad auflösen. Man filtriert durch 0,2 & mgr; m Spritzenspitze und lagern in 500 ul Aliquots bei -20 ° C.
   2. Herstellung von Papain-Stammlösung
      1. Verdünnte Papain bis 15 Einheiten / ml in 1x Hanks'-Gleichgewichtssalzlösung (HBSS). Pipette auf und ab 5 mal gründlich zu mischen. Vorbereitung am Tag der Präparation.
   3. Herstellung von DNase-Stammlösung
      1. Man wiegt 20 mg DNase. Hinzufügen sterilem H ₂ O zu einer Gesamt Endvolumen von 20 mL. Sterilfilter mit 0,2 & mgr; m Spritzenfilter Spitze. Lagerung bei -20 ° C in 1 ml-Anteile.
   4. Herstellung von Stopplösung
      1. Verdünne 5 mL Spender equine Pferdeserum zu 10% in 45 ml 1x HBSS. Sterilfilter mit einer 0,2 & mgr; m Spritzenfilter Spitze. Lagerung bei 4 ° C.
   5. Herstellung von 4% Rinderserumalbumin (BSA) Stammlösung
      1. Abwiegen 2 g BSA und fügen 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bis zu einer Gesamt Endvolumen von 45 mL. Filter sterilisieren mit 0,2 & mgr; m Spritzenfilter Spitze. Lagerung bei 4 ° C.
   6. Herstellung von Plating Medium
      1. In 494 ml Medium, fügen 1,25 ml Kulturmedium, das L-Alanyl-L-Glutamin (eine stabilisierte Quelle von L-Glutamin) und 5 ml Spenderpferdeserum enthält. Filter sterilisieren mit 0,2 & mgr; m Spritze filter Spitze. Lagerung bei 4 ° C.
   7. Herstellung von Zellkulturmedium
      1. In 196 ml Agarmedium, 4 ml B27 und 200 & mgr; l Ascorbinsäure. Filter sterilisieren mit 0,2 & mgr; m-Filter. Lagern Sie die Lösung bei 4 ° C und innerhalb einer Woche.
   8. Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung
      Achtung: Allgemeine Vorsichtsmaßnahmen für die Verwendung von Paraformaldehyd sind wie folgt: eine Abzugshaube verwenden, Haut- und Augenkontakt zu vermeiden, vermeiden Inhalation des Dampfes, halten Sie von der Hitze oder offenen Flammen fernhalten. Tragen Sie geeignete Schutzkleidung tragen. PFA kann Sensibilisierung und Dermatitis verursachen, daher die Hände waschen nach Gebrauch gründlich.
      1. 10 ml 16% PFA und 30 ml 1x PBS, pH 7,4.
   9. Herstellung von 0,1% Triton X-100
      1. Pipette 1 ml Triton X-100 in 9 ml 1x PBS eine 10% ige Lösung herzustellen. Pipette langsam viskose Lösung zu ermöglichen Pipettenspitze zu füllen. Warm in 37 ° C warmen Wasserbad zu dislösen. Lagern Sie 10% Lager bei 4 ° C.
      2. Verdünnen Sie 10% Lager auf 0,01% ( zum Beispiel durch die Durchführung 2 serielle Verdünnungen 01.10: Verdünnen von 1 ml 10% ige Lösung in 9 ml 1x PBS 1% ige Lösung zu machen; 1 ml 1% ige Lösung in 9 ml 1x PBS zu machen 0,1% ige Lösung).
   10. Herstellung von 10% und 1% Eselsserum
       1. 1 ml Serum Esel zu 9 ml 1x PBS für eine 10% ige Lösung. 0,5 mL Eselserum auf 49,5 ml 1x PBS, pH 7,4 für eine 1% ige Lösung.
   11. Herstellung von 1x PBS
       1. Verdünnte 10x PBS durch Zugabe von 50 ml in 450 ml H ₂ O. Der pH - Wert der Lösung auf pH 7,4 bis 1x einem pH - Meter verwendet.
2. Die Beschichtung der Kulturschalen
   1. Poly-L-Ornithin-Coating
      1. Mantel nur die 10 mm Durchmesser Glasboden in der Mitte aller 35-mm-Schalen mit 120 & mgr; l Poly-L-Ornithin mit einer sterilen Technik. bei 37 ° C für 1 h inkubiert. Verwenden Sie ein Vakuum Absauger das Poly-Lo abzusaugenrnithine. Spülen Sie das Geschirr zweimal mit sterilem H ₂ O
   2. Laminin-Beschichtung (Stammkonzentration von 1 mg / ml)
      1. Verdünne 20 & mgr; l Laminin mit 2 ml sterilem H ₂ O (Endkonzentration 0,01 mg / ml).
      2. Mantel nur die 10 mm Durchmesser Glasboden in der Mitte aller Gerichte mit 120 & mgr; l von Laminin verdünnt auf 0,01 mg / ml unter Verwendung einer sterilen Technik und Inkubation für 1 h oder O / N bei 37 ° C vor dem Gebrauch.
3. Maus Dissection
   HINWEIS: Die Verfahren in dieser Präparation werden für minimale Exposition von Zellen entwickelt, wie sie sich aus embryonalen sacs zur Kultur-Inkubator überführt werden. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Entfernen nur einen Teil des Gehirns für die Präparation des Mittelhirns erhalten. Isolation des Mittelhirns schneller abläuft, ohne dass das gesamte Gehirn zu sezieren die Region zuzugreifen. Siehe Tabelle der Materialien für die Mausstamm in dieser Studie verwendet. Euthanize eine zeitlich schwangere Maus auf Schwangerschafts - Tag 14 mit CO _2.
4. Sprühen Sie den Bauch der eingeschläfert Maus mit 70% Ethanol. Fassen Sie die Haut des Unterleibs mit einer Pinzette mit 2 x 3 Zähne und öffnen Sie die Bauchhöhle mit stumpfer Klinge chirurgische Scheren. Machen Sie zwei Schnitte seitlich und proximal auf jeder Seite zu bewegen. Falten Sie über die Bauchdecke einer Pinzette in die Bauchhöhle zu belichten.
   HINWEIS: Der Uterus nun freigelegt ist. Aussetzen der Pleurahöhle und die Schaffung von Pneumothorax stellt auch sicher, dass das Tier nicht erholt.
5. Schneiden beide Enden des uterine horn den Uterus zu trennen. Legen Sie in eine Petrischale in einer sterilen Haube.
6. Mit gerader Spitze einer Pinzette in jeder Hand öffnen Sie den Embryosack und den Embryo zu entfernen. Schnell enthaupten am Hals Kopf mit der Zange durch Kneifen. Stabilisieren Sie den Kopf mit der Zange fest auf die Schnauze gelegt, so dass die dorsale Oberfläche zugänglich ist.
7. Mit den in der anderen ha gehalten Zangend, kneifen die Schicht der Haut und den Schädel kurz vor dem Kamm des Mittelhirns. Ziehen Sie die Haut und den Schädel kaudal entlang der Mittellinie zurück. Setzen Sie Zange um den Grat mit einer Spitze zwischen der Rinde und Hirns und die andere über das Cerebellum.
8. Pinch und das gesamte Mittelhirns zu entfernen, hinter dem Vorderhirns auf rostralen Seite und des Kleinhirns auf der Schwanzseite zu verlassen. Legen Sie in einer Petrischale mit kaltem HBSS unter einem Binokular.
9. Wiederholen Sie den Vorgang für die restlichen Embryonen.
10. Unter dem Binokular, Flip über das Gehirn Segment, so dass die Bauchseite jetzt zugänglich ist. Es gibt nun vier Quadranten sichtbar. Entfernen Sie alle der Meningen und Gefäße durch sanft die Meningen Greifen und Ziehen nach oben weg vom Gehirn.
11. Verwenden einer Pinzette, um das Gehirn Segment zu stabilisieren, während die Mittelhirns zu trennen. Legen Sie eine Zange der Zange in den Ventrikel etwa in der Mitte des Segments. Sprechen Sie die erste Prise vom Rücken her, ich zeigennto die Schale, dann medial auf jeder Seite. Nehmen Sie die beiden unteren Quadranten, indem seitliche Schnitte auf beiden Seiten.
    HINWEIS: Das Gewebe von Interesse ist im ventralen minderwertig Abschnitt, der dicht erscheint. Dieser Bereich enthält sowohl die VTA und die SNc.
12. Trim und entsorgen Sie das Gewebe, das weniger dicht ist: das kann die obere und untere Colliculi enthält. Platzieren Sie den sezierten Gewebe sowohl die VTA und SNc in frischem HBSS auf einem separaten Bereich der Petrischale enthält.
    HINWEIS: In diesem Stadium der Mäusehirnen (E14), wobei die interessierende Region in der ventralen Mittelhirns von einem Ventrikel von der zona incerta und andere hypothalamisch Zellgruppen getrennt ist. Je mehr längliche Struktur der Entwicklungs embryonalen Mausgehirn ermöglicht die Unterscheidung zwischen diesen Bereichen, die im erwachsenen Gehirn der Maus näher beieinander angeordnet sind.
13. Wiederholen Sie dies für alle übrigen Gehirn Segmente.
14. Nachdem alle Gehirnsegmente seziert wurden, verwenden Pinzette und ein No. 11 Skalpell Quartal each midbrain Abschnitt in Stücke von ungefähr gleicher Größe.

2. Ernten Cultured-dopaminerge Neurone für die RNA-Sequenzierung

HINWEIS: Eine Übersicht über die Zellernte und Einzelzellen - RNA-Sequencing - Protokoll ist in Abbildung 1 wiedergegeben.

1. Schritte vor dem Tag des Experiments zu Perform
   1. Sauber Borsilikatglas Kapillarrohr durch in 100% Ethanol für 15 min beschallt und dann wieder in destilliertem H ₂ O für 15 min. Lassen Sie den Schlauch und backen über Nacht in einem Ofen bei 200 ° C RNase zu inaktivieren.
   2. Verwenden Sie frisch geöffnetenRNase-freie Pipettenspitzen durch Mischen von 19 ul 10fach Lysepuffer aus dem Sequenzierungs-Kits mit 1 & mgr; l RNase-Inhibitor-Lösung (20 & mgr; l Gesamtvolumen) in einem Mikrozentrifugenröhrchen eine Stammlösung von 10-fach Reaktionspuffer vorbereitet. Spin down die Mischung kurz eine Mikrozentrifuge und halten auf dem Eis.
   3. Fügen Sie 2 uL des 10x Reaktionspuffer zu jedem der einzelnen 0,2 ml PCR-Röhrchen (verwendet, um die geernteten Neuronen zu sammeln). Beschriften Sie die Röhrchen mit entsprechenden Tags identifizieren Neuronen, geerntet werden und Lagerung tiefgefroren bei 4 ° C.
2. Schritte auf dem Tag des Experiments zu Perform
   1. Die Herstellung der Ernte Pipettes.
      1. Ziehen groß Spitze Durchmesser Mikropipetten (2 - 8 & mgr; m) aus dem gebackenen Kapillarschlauchs eine Mikroelektrode Puller und die glasbeschichteten Heizwendel eines Mikroschmiede verwenden. Stellen Sie den Abzieher zu bilden Mikro mit einer langen Verjüngung. Verwenden Sie einen Mikroschmiede mit einem kalibrierten Okularstrichplatte ausgestattet und einem High-Power objektive die Spitze der Mikropipette auf die gewünschte Spitze zu brechen Größe (10 - 20 & mgr; m).
      2. Befestigen Sie die Mikropipette in die Mikroschmiede Pipettenhalter und montieren Sie den Halter auf der Mikroschmiede. Bringen, die Spitze der Mikropipette in Fokus über dem glasbeschichteten Heizfaden der mechanischen Manipulator des Mikroschmiede und Schalter auf der Strom zu dem Heizfaden verwendet, es zu erhitzen. Berühren Sie die Pipettenspitze auf die erhitzte Filament. Schalten Sie den Strom, wenn die Pipettenspitze auf den entsprechenden Durchmesser geschmolzen ist.
         HINWEIS. Das Abschalten des Strom off bewirkt, dass der Faden plötzlich nach unten und lösen sich von der Pipettenspitze zu bewegen, eine große, offene bestückte Pipette mit dem gewünschten Durchmesser zu erzeugen.
      3. Speichern Sie die fertigen Mikro in einem geschlossenen Kasten, bis sie benötigt.
   2. Die Ernte der Neurone.
      HINWEIS. Kultivierte Neuronen wurden nach einer modifizierten Version eines zuvor veröffentlichten Protokoll ⁶ geerntet.
      1. gründlich clean alle Oberflächen der Zellernte Raum, der mit den Kulturen Speisen in Berührung kommen, und Sammelröhrchen mit flüssigen Desinfektionsmittel und Wasser durch mit Wasser gespült. Wischen Sie die desinfizierten Flächen mit 80% Ethanol nach unten und dann ein RNase-Inhibitor-infundiert wischen.
      2. Füllen Sie zwei isolierte Behälter mit Eis, eines mit regelmäßigen (Wasser) Eis und ein weiteres mit Trockeneis. Legen Sie die 0,2 ml PCR-Sammelröhrchen gefüllt zuvor mit 2 ul 10x Reaktionspuffer auf dem regulären Eis.
      3. Entfernen Sie die Kulturschale die Neuronen aus dem Inkubator enthält, lassen Sie das Kulturmedium aus der Schale gründlich mit 2 ml RNase-freiem Dulbecco-PBS (DPBS) und ersetzen mit 1 ml DPBS für die Ernte.
      4. Identifizieren fluoreszierend, TH-positiven Neuronen in der primären Mittelhirns Kulturen unter Verwendung eines invertierten, Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem 40x Phase Ziel ausgestattet, eine Hg-Lampe und einem GFP-Filtersatz.
      5. Platzieren Sie die Pipette über die Zelle soma mit einem motorisierten oder manuellen micromanipulator. Saugen Sie das Neuron in die Glasmikropipette sanfte Saugwirkung durch den Mund durch den Kunststoffschlauch an den Seitenanschluss des Mikrohalter angebracht angewendet. Ab sofort entfernen Sie die Mikropipette die Zelle von der Badelösung enthält.
      6. Setzen Sie die Pipettenspitze in einem 0,2 ml PCR-Röhrchen Sammlung mit Reaktionspuffer, und brechen die Spitze gegen die Seite des Rohres, in der Nähe der Unterseite. Auszutreiben die verbleibende Flüssigkeit (0,5 bis 1,5 & mgr; l) aus dem gebrochenen Spitze der Mikropipette durch ein steriles 21 G Injektionsnadel in der Rückseite der Mikropipette Plazieren und Anwenden äußeren Drucks.
      7. Zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen für 5 s mit einem Desktop-Mikrozentrifuge und frieren sie in Trockeneis. Bewahren Sie die Sammelröhrchen, die einzelnen Zellen bei -80 ° C enthält. Typischerweise werden 5 Zellen pro Schale über einen Zeitraum von 1 Stunde bei Raumtemperatur geerntet.

3. Single-Zell-RNA-Seq von Bibliotheken

<li> Die Erzeugung der cDNA des ersten Strangs
Hinweis: Für die folgenden Schritte Reagenzien aus dem kommerziellen Sequenzierungs-Kit verwenden.
1. Bringen Sie die folgenden Reagenzien auf Eis zu dem PCR-Schrank. Vorbereiten eines ersten Stranges Mastermix plus 10% durch die folgenden Reagenzien bei Raumtemperatur in einem PCR Schrank Kombination: 2 & mgr; l 5x Erststrang-Puffer, 0,25 & mgr; l DTT (100 mM), 1 & mgr; l dNTP-Mix (10 mM), 1 & mgr; l Oligonukleotid ( 12 & mgr; M), 0,25 & mgr; l RNase-Inhibitor und 1 ul reverse Transkriptase (100 Einheiten). Dies ist die Reverse-Transkriptase-Master-Mix (5,5 & mgr; l Gesamtvolumen pro Reaktion).
2. Nehmen Sie die Proben aus dem -80ºC auf Trockeneis und bringen auf dem PCR-Schrank. Fügen Sie die folgenden auf die einzelnen Zellprobe: 1 & mgr; l 3 'Primer 1 und 1 & mgr; l RNA Spikes quantifiziert. Bringen Proben auf einem Kühlerblock zu einem Heiß Deckel Thermocycler voreingestellten bei 72 ° C.
3. Die Röhrchen in den Thermocycler für 3 min bei 72 ° C, und setzen Sie dann die Proben auf einem PCR-Kühler Rack.In 5,5 ul des Master-Mix (aus Schritt 3.1.1) zu jedem Reaktionsgefäß geben und vorsichtig mischen durch Pipettieren. Dreh die 0,2 & mgr; l Röhrchen 5 s und in einem Thermocycler inkubiert wie folgt: 42 ° C für 90 min, 70 ° C für 10 min. Halten bei 4 ° C.
1. Reinigung von Amplified First Strand cDNA.
   HINWEIS: Die PCR-amplifizierte cDNA wird gereinigt durch Immobilisierung auf magnetischen Kügelchen. Verwenden Sie eine magnetische Trennvorrichtung für 0,2 ml-Röhrchen.
   1. Aliquotieren die magnetischen Kügelchen in 1,5 ml-Röhrchen. Vor jedem Einsatz bringen Wulst Aliquots auf Raumtemperatur für mindestens 30 Minuten und gut mischen zu zerstreuen. Vortex magnetische Kügelchen, bis es gleichmäßig gemischt.
   2. In 25 ul von magnetischen Kügelchen zu jeder Probe. Mischen Sie durch das gesamte Volumen bis Pipettieren und unten mindestens 10-fach gründlich zu mischen. bei RT inkubieren 8 min die cDNA binden an die Perlen zu lassen.
2. Herstellung von PCR Master Mix
   1. Bereiten Sie die ds-cDNA-Amplifikation PCR-Master-Mix für alle Reaktionen mit einem additional 10% von 5 & mgr; l 10x PCR-Puffer, 2 & mgr; l dNTP-Mix (10 mM) Mischen, 2 & mgr; l PCR-Primer 2 (12 & mgr; M), 2 & mgr; l 50x 2 Polymerase Mix und 39 & mgr; l Nuklease freie Wasser (50 & mgr; l Gesamtvolumen / Reaktion).
3. Amplifikation von First Strand
   1. Platzieren Sie die Proben und die magnetischen Kügelchen an der magnetischen Trennvorrichtung ≥5 min, bis die Flüssigkeit vollständig klar erscheint, und es gibt keine Perlen im Überstand belassen.
   2. Halten Sie die Proben auf der Trennvorrichtung, Pipette den Überstand und entsorgen. Dreh die Proben für 5 s, die Flüssigkeit von der Seite des Röhrchens zu sammeln. Legen Sie die Proben auf der magnetischen Trennvorrichtung für 30 s, dann entfernen Sie alle verbleibenden Überstand mit einer P10 pipettor.
   3. Zugabe von 50 & mgr; l des PCR-Mastermix in jede DNA enthaltenden Röhrchen aus dem vorherigen Schritt an die Kügelchen gebunden. Das Röhrchen wird in einem vorgewärmten Thermocycler (95 ° C) mit einem beheizten Deckel. Sie leitet die thermischen Zyklen die folgende progra mitm: 95 ° C für 1 min, 26 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 65 ° C für 30 s, 68 ° C für 6 min. Dann 72 ° C 10 min. Halten bei 4 ° C.
      HINWEIS: Bitte Sequenzierung Bedienungsanleitung für weitere Details und die Beispieleinstellungen zu optimieren.
4. Reinigung von Amplified doppelsträngige cDNA
   1. In 90 ul Perlen zu jeder Probe. Mischen Sie durch das gesamte Volumen bis Pipettieren und unten mindestens 10-fach gründlich zu mischen. bei RT inkubieren 8 min die cDNA binden an die Perlen zu lassen. Platzieren Sie die Proben und Perlen auf der magnetischen Trennvorrichtung für ≥5 min, bis die Flüssigkeit vollständig klar erscheint, und es gibt keine Perlen im Überstand belassen.
   2. Während die Proben auf der magnetischen Trennvorrichtung vorhanden sind, entfernen Sie den Überstand und entsorgen. Halten Sie die Proben auf der magnetischen Trennvorrichtung. In 140 & mgr; l frisch zubereiteter 85% Ethanol zu jeder Probe ohne die Perlen zu stören. Warten Sie 30 s. Pipette den Überstand ab. cDNA wird an die bea gebunden bleibends während des Waschvorgangs.
   3. Wiederholen Sie das Ethanol waschen noch einmal.
   4. Kurz gesagt, die Proben drehen, die Flüssigkeit von der Seite des Röhrchens zu sammeln. Legen Sie die Proben auf der magnetischen Trennvorrichtung für 30 s, dann entfernen Sie alle verbleibenden Ethanol mit einer Pipette. Legen Sie die Proben bei Raumtemperatur für 2 - 2,5 Minuten , bis das Pellet trocken ist und nicht mehr glänzend (dh bevor ein Riss erscheint).
      HINWEIS: Trocknen Sie das Pellet nur, bis sie gerade trocken ist. Das Pellet sieht matt ohne Glanz. Wenn das Pellet nicht trocken ist, wird Ethanol in den Probenbehältern verbleiben, die die amplifizierte cDNA Wiederfindungsrate und die Ausbeute verringert. Wenn das Pellet übertrocknet ist, werden Risse in dem Pellet sein. Es dauert länger als 2 min zu rehydrieren und können amplifizierte cDNA Erholung und die Ausbeute verringern.
   5. Sobald die Kügelchen trocken sind, fügen 22,5 ul Elutionspuffer den Wulst Pellet zu decken. Entfernen Sie die Proben aus der magnetischen Trennvorrichtung und gründlich mischen die Perlen zu resuspendieren. Imcubate bei RT für 10 min zu rehydrieren.
   6. Dreh die Proben für 5 s, die Flüssigkeit von der Seite des Röhrchens zu sammeln. Legen Sie die Proben wieder auf dem magnetischen Trennvorrichtung für ≥1 min, bis die Lösung vollständig klar ist.
      ANMERKUNG: Eine kleine Population von Perlen nicht gegen den Magneten während der Inkubation Pellet kann. Pipette diese nicht pelletierten Perlen nach oben und unten, sie mit dem Überstand zu suspendieren, und sie dann in Richtung der Magnet pipettieren, wo der Rest der Perlen bereits pelletiert haben (ohne die bestehende Pellet zu stören).
   7. Fortsetzung der Inkubation, bis keine Perlen im Überstand bleiben. Übertragen Sie klare Überstand, der gereinigte cDNA aus jedem Röhrchen zu einer Nuklease-frei, mit geringer Haftung Rohr. Beschriften Sie jedes Röhrchen mit Probeninformationen und bei -20 ° C. Die Proben können auf unbestimmte Zeit bei -20 ° C gelagert werden.
5. Die Messung der DNA-Konzentration und Fragmentgröße
   1. Führen Sie eine Qualitätskontrolle durch ein 1 & mgr; l al Quantifizierungiquot der cDNA auf einem Fluorometer. Beurteilen , 1 ul (3 ng) von ds-cDNA ein Elektrophorese - System (wie unter Punkt ¹ beschrieben).
6. Die Fragmentierung der DNA
   HINWEIS: eine DNA-Probenvorbereitung Kit verwenden.
   1. In 20 ul cDNA (35 ng Gesamt) zu einer Röhre. Zugeben von 25 & mgr; l DNA Tagment (TD) mit dem Rohrpuffer die cDNA enthält.
   2. In 5 ul TDE1 (Tagment DNA-Enzym) in das Röhrchen. Pipette nach oben und unten 10x zu mischen. Verwenden Sie für jede Probe eine neue Spitze. Zentrifuge bei 280 × g bei 20 ° C für 1 min.
   3. Legen Sie die Proben in einem Thermocycler mit beheizbarem Deckel und führen Sie es an: 55 ° C, 5,5 min. Schnell werden 50 & mgr; l QG-Lösung (Gel-Extraktions-Kits) hinzufügen. Pipette nach oben und unten 10x zu mischen. Weiterhin direkt zum nächsten Schritt.
7. Reinigung von fragmentierter DNA
   1. In 170 & mgr; l Perlen, Pipette nach oben und unten 10x zu mischen. Lassen Sie es für 10 Minuten zu sitzen. Setzen Sie Rohre auf den Magneten. Lassen Sie die Röhrchen für 10 Minuten auf dem Magneten sitzen.Während die Proben auf der magnetischen Trennvorrichtung sind, pipettieren Sie den Überstand und entsorgen.
   2. Lassen Sie das Rohr auf dem Magneten und mit 200 & mgr; l 85% Ethanol. Lassen Sie für 30 s sitzen, dann Ethanol zu entfernen. Wiederholen Sie das Ethanol zu waschen. Drehen Sie das Rohr 1000 × g bei RT.
   3. Setzen Sie den Schlauch wieder auf den Magneten. Pipette restliche Ethanol ab. Lassen Sie die Proben für 15 min bei RT trocknen.
   4. In 21 & mgr; l Elutionspuffer aus dem Gel-Extraktions-Kits. Lassen Sie den Schlauch der Magnet, Pipette nach oben sitzen ab und nach unten 10x zu mischen. Lassen Sie das Rohr für 15 min bei RT sitzen.
   5. Rück das Rohr zu dem Magneten für 5 min. Pipette 20 ul Lösung (gereinigte DNA) in ein neues Röhrchen.
8. Tagging und PCR-Amplifikation der fragmentierten DNA
   HINWEIS: In diesem Schritt wird die gereinigte DNA wird über einen begrenzten Zyklus PCR Programm amplifiziert. Der PCR-Schritt fügt auch Index 1 (i7) und Index 2 (i5) sowie gemeinsame Adapter (P5 und P7) (erforderlich für die Cluster-Generation und Sequenzierung). Wenden Sie sich an die DNA sreichlich Vorbereitung Guide für weitere Details.
   1. In ein neues Röhrchen 5 ul Index 2 Primer (weiße Kappe) hinzufügen. Mit fügen Sie eine neue Pipettenspitze 5 ul Index 1 Primer (orangefarbene Kappe). Werden 15 & mgr; l PCR-Mastermix in jedes Röhrchen.
   2. Zugabe von 5 & mgr; l PCR-Primer-Cocktail zu jedem Röhrchen. Geben Sie 20 & mgr; l der gereinigten DNA mit dem Rohr. Pipette vorsichtig auf und ab 3 bis 5 mal.
   3. Führen PCR unter Verwendung des folgenden Programms auf einem Thermocycler: 72 ° C für 3 min, 98 ° C für 30 s, 5 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 63 ° C für 30 s, 72 ° C für 3 min. Halten bei 10 ° C. Fahren Sie direkt mit dem PCR-clean-up oder lagern Sie die Probe bei 4 ° C für bis zu 2 d.
9. Aufreinigung von amplifizierten DNA-Fragmente
   1. Bringen Sie die Perlen auf RT. Bereiten Sie frische 85% Ethanol. Nehmen Sie Proben von PCR-Maschine und Spin-down kurz.
   2. Zugabe von 30 & mgr; l der Kügelchen mit dem Rohr. Gently Pipette 10x nach oben und unten mischen. Lassen Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur für 5 min sitzen. Platz back auf den Magneten für 5 min. Mit dem Rohr auf den Magneten eine Pipette verwenden den Überstand zu verwerfen.
   3. Mit 200 & mgr; l 85% Ethanol zu jedem Röhrchen. Ethanol Pipette nach 30 s aus. Wiederholen Sie die 85% Ethanol waschen. Ethanol Pipette nach 30 s aus.
   4. Mit den Rohren noch auf den Magneten und die Kappen offen, erlauben die Perlen an der Luft trocknen für 15 min. Entfernen Sie die Schläuche vom Magneten.
   5. In 32,5 ul Elutionspuffer. Pipette vorsichtig nach oben und unten 10x. Inkubieren der Magnet für 10 aus - 15 min.
   6. Rück die Rohre an den Magneten für 2 min, oder bis der Überstand gelöscht hat. Sorgfältig Übertragung 30 & mgr; l des Überstands in ein neues Röhrchen.
10. Die Messung der DNA-Konzentration und Fragment Size
    1. Durchführung einer Qualitätskontrolle durch die DNA-Konzentration von 1 & mgr; l der cDNA auf einem Fluorometer quantifiziert. Bestimmen Sie die Fragmentgröße der DNA durch Elektrophorese. Beurteilen Sie 1 ul (3 ng) von ds-cDNA.
11. Die Sequenzierung
    1. Bringen Sie die einzelnen Zelle RNA-Seq-Bibliotheken zu einer Sequenzierungsmöglichkeiten. Generieren 100 bp - Sequenzierung auf einem Sequenzer liest nach einem zuvor veröffentlichten Protokoll ^4.
       HINWEIS: Jede Sequenzierung Bibliothek erzeugt> 20 Millionen eindeutigen Zuordnung liest.

Hier berichten wir ein Protokoll zur Kultivierung ventralen Mesencephalon - Neuronen von einem Maus - eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase - Promotor - Sequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen und Messung ihrer RNA Transkriptom unter Verwendung von RNA-seq (Abbildung 1). Die Daten zeigten, dass 100% der TH-eGFP-positive Zellen, die geerntet wurden und dopaminergen Neuronen wurden sequenziert, basierend auf der Anwesenheit der folgenden drei DA-verwandtes Gen-Transkripte, TH, Dopa-Decarboxylase (DDC) und der Dopamintransporter-DAT (SLC6A3). Alle der TH-eGFP positiven Zellen, die diese drei Gene exprimiert durch RNA-Seq beurteilt wie. In jedem Einzelzell RNA-Seq - Bibliothek 6,000 - 8,000 Protein kodierenden Gene wurden nachgewiesen (Abbildung 2). Die dopaminergen Neuronen robust Dopamin-verwandten Transkripten zusätzlich zu mehreren nikotinischen Acetylcholinrezeptor (nAChR) -Untereinheiten (Tabelle 1) exprimieren. Wir beobachteten, dass keint alle Zellen, die für TH waren GABAergen negativ waren; daher definiert wir Zellen als GABAerge basierend auf der Anwesenheit des Transkripts GAD1 wie durch RNA-seq beurteilt. Die Zellen, die wir als GABA-erge Neuronen definiert keine Dopamin-bezogenen Transkripte exprimieren, sondern als eine wichtige Gen für die GABA-Synthese, GAD1 exprimieren erwähnt. Die Einzelzellbibliotheken zeigte auch, lange RNA nicht-codierende sowie Transkripte kodierend Kanäle, Rezeptoren, nukleäre Proteine, Histone, organellären Proteine ​​und Transkriptionsfaktoren.

Abbildung 1. RNA-Seq in einzelnen Neuronen, wie sie in unseren Experimenten zur primären TH-eGFP Maus Mittelhirns Kulturen durchgeführt werden . (1) Kultur TH-eGFP Maus ventralen Neuronen für 3 Wochen. (2) Identifizieren fluoreszierenden einzelnen Neuronen durch Anregen GFP unter Verwendung einer Hg - Lichtquelle und FITC / GFP - Filter. (3) With die gleiche 40X-Objektiv unter Phasen Optik, einzelne Neuronen zu visualisieren und richtig die Pipette positionieren. (4 - 5) aspirieren die einzelne Zelle in die Glasmikropipette. Bilder zeigen eine Zelle nach der Ernte: (4) Phase 40X; (5) EGFP - Fluoreszenz. (6) Lyse Zellen mit Lysepuffer mit Oligo-dT - Primer bei 72 ° C. (7) cDNA - Synthese; 26 Zyklen Amplifikation. (8) Transposon-vermittelte "tagmentation" von cDNA. (9) cDNA Qualitätskontrolle und Multiplex - Sequenzierung. (10) Im Anschluss Computeranalyse mit Tophat, Manschettenknöpfe und Cuffdiff 7. Relative Häufigkeit von exprimierten Genen wurde in Einheiten von Fragmenten pro Kilobasen- von Transkript gemessen pro Million abgebildet liest (FPKM). Das Ziel der RNA-seq ist, eine Liste von Genen in einer Zelle und ihrer relativen Abundanz exprimiert bereitzustellen. Bilder (2 bis 4) sind von der aktuellen work, (6 bis 10) aus einem früheren Bericht 1 geändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Die Anzahl der Protein - kodierenden Gene Erkannte in den Einzel dopaminerge RNA-Seq Bibliotheken , die von TH-eGFP-positiven Zellen. 6000 - 8000 Protein-Gene wurden in den einzelnen Zellbibliotheken erfasst. FPKM: Fragmente pro Kilobasen- von Transkript pro Million abgebildet liest (FPKM). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Tabelle 1 : Dopamine bezogenen und nAChR Gene Transkripte in dopaminergen und GABA - erge Neurone an Tag 21 in VentrMidbrain Kulturen. RNA-Seq Daten für TH eGFP-positiven und negativen Neuronen gezeigt. Einzelne Zellen auf Kultur Tag 21. RNA-Seq Daten geerntet wurden zeigen, dass TH-eGFP positiven Neuronen ein hohes Maß an DA-verwandtes Gen-Transkripte, einschließlich Tyrosin-Hydroxylase (TH), (DDC), die Dopamin-Transporter DAT (SLC6A3) hatte und Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptor (nAChR) Untereinheiten einschließlich α6, α4, β2 und β3. Allerdings hatten diese Zellen geringe Mengen des GABA-erge Markergen Glutaminsäure-Decarboxylase 1 (GAD1) ​​und den Serotonin 5-HT3-Rezeptor-A und B-Untereinheiten (Htr3A und HTR3B). GABA-erge Neuronen haben eine geringe bis gar keine Ebenenvon DA-verwandtes Gen-Transkripte, chrna6, chrnb3 und Htr3A / B, haben aber ein hohes Maß an GAD1. RNA-Seq (Cuffdiff) Daten für die Dopamin-bezogenen, GABAergic, Nikotinsäure-Rezeptor und Serotonin-Transkripte gezeigt. FPKM: Fragmente pro Kilobasen- von Transkript pro Million abgebildet liest (FPKM).

Die Autoren haben nichts offenzulegen.