Experimentelles Protokoll zum Nachweis Cyanobakterien In flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper Microarray-Chip

Summary

Das Vorhandensein von cyanobakteriellen Toxinen in Süßwasserreservoirs für den menschlichen Gebrauch ist ein großes Problem für die Wasserwirtschaftsbehörden. Um das Risiko einer Wasserkontamination zu bewerten, wird in diesem Artikel ein Protokoll für den Vor-Ort-Nachweis von Cyanobakterienstämmen in flüssigen und festen Proben unter Verwendung eines Antikörper-Microarray-Chips beschrieben.

Abstract

Die globale Erwärmung und Eutrophierung machen einige Wasserökosysteme als wahre Bioreaktoren verhalten, die eine schnelle und massive Cyanobakterien Wachstum auslösen; dies hat relevanten gesundheitlichen und wirtschaftlichen Folgen. Viele Cyanobakterien Stämme sind toxin Produzenten, und nur wenige Zellen sind notwendig, irreparable Schäden an der Umwelt zu induzieren. Daher Wasserkörper Behörden und Verwaltungen erfordern eine schnelle und effiziente Frühwarnsysteme zuverlässige Daten Bereitstellung ihrer präventiven oder kurativen Entscheidungen zu unterstützen. Dieses Manuskript berichtet ein experimentelles Protokoll für das in-Feld Nachweis von Toxin produzierenden Cyanobakterien Stämme durch einen Antikörper Microarray-Chip mit 17-Antikörpern (Abs) mit taxonomische Auflösung (CYANOCHIP) verwendet wird. Hier wird ein Multiplex-Fluoreszenz-Sandwich-Microarray-Immunoassay (FSMI) für die gleichzeitige Überwachung von 17 Cyanobakterien Stämme häufig blühen in Süßwasserökosystemen gefunden, einige von ihnen Toxin Produzenten, beschrieben. Ein Mikroarray mit mehrerenweise identisch Replikate (bis zu 24) des CYANOCHIP wurde auf einem einzigen Objektträger gedruckt, um gleichzeitig eine ähnliche Anzahl von Proben zu testen. Flüssige Proben können entweder durch direkte Inkubation mit dem Antikörper (Abs) oder nach der Zellkonzentration durch Filtration durch eine 1- bis 3-um-Filter getestet werden. Feste Proben, wie Sedimente und Boden Gesteinen, werden zuerst von einem handgehaltenen Ultraschallgerät in einem Inkubationspuffer homogenisiert und dispergiert. Sie werden dann gefiltert (5 bis 20 & mgr; m), um das Grobmaterial zu entfernen, und das Filtrat wird inkubiert mit ABS. Immunreaktionen werden durch eine abschließende Inkubation mit einer Mischung aus 17 fluoreszenzmarkierten Abs offenbart und werden von einem tragbaren Fluoreszenzdetektor gelesen. Der gesamte Vorgang dauert ca. 3 Stunden, die meisten davon auf zwei 1-h Inkubationszeiten entspricht. Der Ausgang ist ein Bild, in dem helle Flecken auf den positiven Nachweis von cyanobakteriellen Markierungen entsprechen.

Introduction

Der Nachweis und die Überwachung von Mikroorganismen in komplexen natürlichen mikrobiellen Gemeinschaften sind von entscheidender Bedeutung in vielen Bereichen, einschließlich der Biomedizin, die Umweltökologie und Astrobiologie. Cyanobakterien sind prokaryotische Mikroorganismen bekannt für ihre Fähigkeit , Blüten (übermäßige Proliferation) von Zellen in frischem Wasser zu bilden. Sie sind allgegenwärtig, und viele Arten sind in der Lage, Giftstoffe zu produzieren, was sich nicht nur auf ein potenzielles Risiko für die menschliche Gesundheit, sondern auch zu einer ökologischen Auswirkungen. In dieser Hinsicht ist es wichtig , eine schnelle und empfindliche ....

Protocol

1. Herstellung der Immunogene

1. Wachsen jedes cyanobakteriellen Stamm in dem entsprechenden Kulturmedium unter den in Tabelle 1 beschriebenen Bedingungen.
   HINWEIS: Das Wachstumsmedium und Kulturbedingungen für jede Cyanobakterien - Stamm sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Cyanobakterien-Stämme, mit Ausnahme von K17, gehören zu Antonio Quesada Gruppe von Autonoma Universität (Madrid, Spanien). Der Antikörper gegen Planktothrix rubescens wurde aus einer natürlichen Probe der monospezifischen Blüte dieser Cyanobakterium aus Vilasouto Reservoir (Nordspanien) erzeugt.
2. Quantifizierung der Anzahl ....

Results

In dieser Arbeit wird ein Multiplex - Immunoassay - Test für die gleichzeitige Identifikation der wichtigsten Süßwasser Cyanobakterien - Arten (Tabelle 1) mit dem CYANOCHIP Antikörper Microarray. Der Microarray kann ein 3 x 8 Mikroarray-Format auf Mikroskop-Objektträger gedruckt werden. Jeder Mikroarray wird in einem dreifachen Punktmuster, ihre entsprechenden präimmune Antikörper und BSA als negative Kontrollen aus einem Satz von 17 Antikörpern gedruckt gemacht. Die Mik.......

Discussion

Hier wird ein Multiplex fluoreszierenden Sandwich - Immunoassay die CYANOCHIP, einen 17-Antikörper - Mikroarrays zum Nachweis und zur Identifizierung einer Vielzahl von cyanobakteriellen Gattungen verwendet wird , wird ²² beschrieben. Diese Cyanobakterien stellen die häufigste benthic und planktonischen Gattungen in Süßwasserhabitaten, einige von ihnen Toxin Produzenten. Vor kurzem hat die fluoreszierende Sandwich - Immunoassay - Format verwendet, Mikroorganismen und / oder Bioanalyten i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter mit 0,22 mm Porendurchmesser	Millipore	GSWP04700	Zur Herstellung von Immunogenen
Eppendorf  5424R Mikrozentrifuge	Fisher Scientific		Zur Herstellung von Immunogenen
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011036	50 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4
Ultraschallprozessor UP50H	Hielscher		Zur Herstellung von Immunogenen
Vollständiges Freund's Adjuvans	Sigma-Aldrich	F5881	Immunpotentiator
unvollständig Freuds Adjuvans	Sigma-Aldbsp;	F5506	Für Boost-Injektionen
Protein-A-Antikörper-Aufreinigungskit	Sigma-Aldrich	PURE1A	Zur Isolierung von IgG
Zentrifugalfiltergeräte MWCO< 100 kDa	Millipore	UFC510096-96K	Zur Isolierung von IgG-Dialyseschläuchen
, benzoyliertes	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	Zur Isolierung von IgG
Illustra Microspin G-50 Säulen	GE-HealthCare	GE27-5330-02	Zur Isolierung des
IgG-Bradford-Reagenzes	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	Zur Quantifizierung der Antikörperkonzentration
MicroBCA-Protein-Assay-Kit	Thermo Scientific	23235	Zur Quantifizierung der Antikörperkonzentration
Protein-Arraying-Puffer 2x	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	Druckpuffer; 30 - 40 % Glycerin in 1x PBS mit 0,01 % Tween
20 Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Nichtionisches Detergens
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Steuerung  für den Druck; Blockierungsreagenz
384-Wells Mikroplatte	Genetix	X6004	Für den Antikörperdruck
Roboter-Arrayer für mehrere Objektträger	MicroGrid II TAS Arrayer von Digilab		Für den Antikörperdruck
Epoxidsubstrat Glasobjektträger	Arrayit Corporation	VEPO25C	Solide Unterstützung für den Antikörperdruck
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester	Molekulare Sonden	A20006	Fluorochrom
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Fluorochrom-Lösungsmittel
Heidolph Titramax Schüttler für vibrierende Plattform	Fisher Scientific		Für die Antikörpermarkierung
Illustra Microspin G-50 Säulen	Gesundheitswesen	27-5330-01	Für die Aufreinigung von markierten Antikörpern
Sichere Versiegelung braune 0,5-ml-Röhrchen	Sarstedt	72.704.001	Für die Lagerung von markierten Antikörpern
Nanodrop 1000 Spektralphotometer	Thermo Scientific		Zur Quantifizierung der Antikörperkonzentration und Markierungseffizienz
3 & micro; m Porengröße Polycarbonat Filter mit 47 mm Durchmesser	Millipore	TMTP04700	Zur Konzentration von Zellen
1 M Trizma Hydrochloridlösung pH 8	Sigma-Aldbsp;	T3038	Zur TBSTR-Vorbereitung; zum Blockieren von Objektträgern
Natriumchlorid	Sigma-Aldbsp;	S7653	Für TBSTRR Vorbereitung
20 & Mikro; M Nylon-Filter	Millipore	NY2004700	Für die Zubereitung von Umweltextrakten
10 - 12 mm Filterhalter	Millipore	SX0001300	Für die Zubereitung von Umweltextrakten
Proteasehemmer Cocktail	Sigma-Aldbsp;	P8340	Für die Lagerung von Extrakten in der Umwelt
1 M Trizma-Hydrochlorid-Lösung pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	Zum Blockieren von Objektträgern
Heidolph Duomax 1030 Schüttler für Schaukelplattform	VWR		Zum Blockieren von Objektträgern; für Inkubationsprozesse
VWR Galaxy Miniarray-Mikrozentrifuge	VWR	C1403-VWR	Zum Trocknen von Objektträgern
Multi-Well Microarray-Hybridisierungskassette	Arrayit Corporation	AHC1X24	Kassette für 24 Assays pro Objektträger
GenePix 4100A Microarray-Scanner	Molecular Devices		Scanner für Fluoreszenz
GenePix Pro Software	Molecular Devices		Software für die Bildanalyse und Quantifizierung