Methodenartikel

Experimentelles Protokoll zum Nachweis Cyanobakterien In flüssigen und festen Proben mit einem Antikörper Microarray-Chip

DOI:

10.3791/54994

⸱

7. Februar 2017

 ,  , 
1Department of Molecular Evolution, Centro de Astrobiología (CAB, INTA-CSIC)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Vorhandensein von cyanobakteriellen Toxinen in Süßwasserreservoirs für den menschlichen Gebrauch ist ein großes Problem für die Wasserwirtschaftsbehörden. Um das Risiko einer Wasserkontamination zu bewerten, wird in diesem Artikel ein Protokoll für den Vor-Ort-Nachweis von Cyanobakterienstämmen in flüssigen und festen Proben unter Verwendung eines Antikörper-Microarray-Chips beschrieben.

Zusammenfassung

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Die globale Erwärmung und Eutrophierung machen einige Wasserökosysteme als wahre Bioreaktoren verhalten, die eine schnelle und massive Cyanobakterien Wachstum auslösen; dies hat relevanten gesundheitlichen und wirtschaftlichen Folgen. Viele Cyanobakterien Stämme sind toxin Produzenten, und nur wenige Zellen sind notwendig, irreparable Schäden an der Umwelt zu induzieren. Daher Wasserkörper Behörden und Verwaltungen erfordern eine schnelle und effiziente Frühwarnsysteme zuverlässige Daten Bereitstellung ihrer präventiven oder kurativen Entscheidungen zu unterstützen. Dieses Manuskript berichtet ein experimentelles Protokoll für das in-Feld Nachweis von Toxin produzierenden Cyanobakterien Stämme durch einen Antikörper Microarray-Chip mit 17-Antikörpern (Abs) mit taxonomische Auflösung (CYANOCHIP) verwendet wird. Hier wird ein Multiplex-Fluoreszenz-Sandwich-Microarray-Immunoassay (FSMI) für die gleichzeitige Überwachung von 17 Cyanobakterien Stämme häufig blühen in Süßwasserökosystemen gefunden, einige von ihnen Toxin Produzenten, beschrieben. Ein Mikroarray mit mehrerenweise identisch Replikate (bis zu 24) des CYANOCHIP wurde auf einem einzigen Objektträger gedruckt, um gleichzeitig eine ähnliche Anzahl von Proben zu testen. Flüssige Proben können entweder durch direkte Inkubation mit dem Antikörper (Abs) oder nach der Zellkonzentration durch Filtration durch eine 1- bis 3-um-Filter getestet werden. Feste Proben, wie Sedimente und Boden Gesteinen, werden zuerst von einem handgehaltenen Ultraschallgerät in einem Inkubationspuffer homogenisiert und dispergiert. Sie werden dann gefiltert (5 bis 20 & mgr; m), um das Grobmaterial zu entfernen, und das Filtrat wird inkubiert mit ABS. Immunreaktionen werden durch eine abschließende Inkubation mit einer Mischung aus 17 fluoreszenzmarkierten Abs offenbart und werden von einem tragbaren Fluoreszenzdetektor gelesen. Der gesamte Vorgang dauert ca. 3 Stunden, die meisten davon auf zwei 1-h Inkubationszeiten entspricht. Der Ausgang ist ein Bild, in dem helle Flecken auf den positiven Nachweis von cyanobakteriellen Markierungen entsprechen.

Einleitung

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Der Nachweis und die Überwachung von Mikroorganismen in komplexen natürlichen mikrobiellen Gemeinschaften sind von entscheidender Bedeutung in vielen Bereichen, einschließlich der Biomedizin, die Umweltökologie und Astrobiologie. Cyanobakterien sind prokaryotische Mikroorganismen bekannt für ihre Fähigkeit , Blüten (übermäßige Proliferation) von Zellen in frischem Wasser zu bilden. Sie sind allgegenwärtig, und viele Arten sind in der Lage, Giftstoffe zu produzieren, was sich nicht nur auf ein potenzielles Risiko für die menschliche Gesundheit, sondern auch zu einer ökologischen Auswirkungen. In dieser Hinsicht ist es wichtig , eine schnelle und empfindliche Verfahren zur Früherkennung von Cyanobakterien und / oder deren Toxine in Boden und Wasser zu entwickeln. Zu diesem Zweck wird ein Multiplex-Fluoreszenz-Sandwich-Microarray-Immunoassay (FSMI) wurde als ein Werkzeug entwickelt für die Wasser Manager ihnen bei der Entscheidungsfindung zu helfen und damit in Programme richtige Wassermanagement.

Ein breites Spektrum von Methoden entwickelt worden, Cyan zu erkennen und zu identifizierenobacterial Zellen und Cyanotoxine in Boden und Wasser, einschließlich der optischen Mikroskopie, Molekularbiologie und immunologischen Techniken. Diese Verfahren können sehr unterschiedlich in den Informationen, die sie liefern. Mikroskopische Techniken basieren auf Zellmorphologie und den Nachweis von in vivo - Fluoreszenz von cyanobakteriellen Pigmente, wie Phycocyanin oder 1 Chlorophyll. Obwohl sie schnell und billig Methoden für die Echtzeit und häufige Überwachung sind , die über die Art und Anzahl der Cyanobakterien in einer Probe vorhanden informieren, geben sie keine Informationen über die mögliche Toxizität. Außerdem erfordern sie ein gewisses Maß an Know - how, wenn man bedenkt , daß es oft sehr schwierig ist , zwei zwischen eng verwandten Arten zu unterscheiden. Um diese Einschränkungen zu, Lichtmikroskopie zu überwinden muss sowohl durch die Identifizierung und Quantifizierung von Cyanotoxine biologischen und biochemischen Screening-Assays und physikalisch-chemischen Methoden begleitet werden.

Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA), Protein-phosphat Hemmtests (PPIA) und neurochemische Tests in Mäusen sind Beispiele für biochemische Screening-Assays zum Nachweis von Cyanotoxine. Während die ersten beiden schnelle und empfindliche Methoden sind, haben Fehlalarmen beschrieben worden bei Verwendung von ELISA und PPIA Tests auf drei Arten von Toxinen sind eingeschränkt. Die Maus-Bioassay ist eine qualitative Technik mit geringer Empfindlichkeit und Präzision, und spezielle Lizenzierung und Ausbildung erforderlich ist. Darüber hinaus gibt es nicht Informationen über die Art von Toxinen in einer Probe vorhanden. Cyanotoxine kann durch andere analytische Verfahren, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), Gaschromatographie (GC), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) identifiziert und quantifiziert werden, oder Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisations-Flugzeit (MALDI-TOF). Dies ist jedoch nur möglich, wenn Referenzstandards, die brauchen werdened einzelnen Toxinkonzentrationen in komplexen Proben zu bestimmen, sind 3 verfügbar, 4. Darüber hinaus sind diese Methoden zeitaufwendig; erfordern teure Ausrüstung, Verbrauchsmaterialien und Probenvorbereitung; und muss von erfahrenen und spezialisierten Personal durchgeführt werden.

Molecular-basierte Methoden seit Jahrzehnten angewendet wurden zu erfassen, zu identifizieren und zu quantifizieren Cyanobakterien und ihre entsprechenden Cyanotoxine dank der Sequenzinformation in den Genomdatenbanken veröffentlicht (zB National Center for Biotechnology Information, NCBI). Unter diesen Verfahren sind solche auf Basis der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die den Entwurf von Sätzen von Primern für die DNA-Amplifikation erfordert und hängen von Vorwissen von DNA-Sequenzen verschiedener Spezies Cyanobakterien. Während Gendetektion, wie das phycocyanin Operon, auf der Gattungsebene, um eine genaue Identifizierung führt, sind einige Arten oder Stämme unentdeckt mitdiese Methode. Jedoch Toxin-kodierenden Gene, wie diejenigen , auf die Microcystin - Operon gehören, ermöglichen die Identifizierung von Toxinen in Proben , in denen die Hersteller sind knapp 5. Nichtsdestoweniger ist der Nachweis von Toxin-Marker durch PCR nicht notwendigerweise Toxizität in die Umwelt bedeuten. Darüber hinaus entwickelt die Menge der Primer das gesamte Spektrum der Arten von Cyanobakterien und Toxinproduzenten in einer Probe zu analysieren ist noch unvollständig, und weitere Studien müssen zu identifizieren unbekannte Arten erfolgen. Andere molekulare Techniken sind nicht auf PCR-Basis, wie Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) und DNA - Mikroarrays.

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich Microarray-Technologie Bedeutung in vielen Bereichen Anwendung gewonnen, vor allem in der Umweltüberwachung. DNA - Mikroarrays ermöglichen eine Unterscheidung zwischen Arten und Analyten 4, 6, 7 sup>, 8, 9, 10, aber sie sind sehr mühsam und zeitraubenden Aufgaben betrachtet , die mehrere Stufen (zB Microarray - Leistung, DNA - Extraktion, PCR - Amplifikation und Hybridisierung) beinhalten. Aus diesem Grund weniger zeitraubend Assays basieren auf Antikörpern, wie Sandwich- und kompetitive immunologische Mikroarrays sind ein wesentlicher und zuverlässige Hochdurchsatz - Verfahren zum Nachweis von mehreren Analyten Umwelt 11, 12, 13 geworden. Die Fähigkeit von Antikörpern, spezifisch ihre Zielverbindungen erkennen und geringe Mengen an Analyten und zum Nachweis von Proteinen, zusammen mit der Möglichkeit, Antikörper gegen nahezu jede Substanz, stellen Antikörper-Mikroarrays eine leistungsstarke Technik für Umweltzwecke zu erzeugen. Darüber hinaus analysiert die Fähigkeit, mehrere erreichen in alsingle Assay, mit Nachweisgrenzen von ppb bis hin zu ppm, ist einer der wichtigsten Vorteile dieses Verfahrens 14.

Antikörper-basierte Biosensoren haben sich als empfindliche und schnelle Werkzeuge für die Detektion von einer Vielzahl von Pathogenen und Toxinen in der Umweltüberwachung zu 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Während DNA-Verfahren mehrere Schritte umfassen, die Antikörper-basierte Mikroarrays erfordern nur eine geringe Probenvorbereitung, die auf einem kurzen Lyseschritt in einem geeigneten Lösungspuffer hauptsächlich basiert. Delehanty und Ligler 15 berichtet , die den gleichzeitigen Nachweis von Proteinen und bakteriellen Analyten in komplexen Mischungen auf der Basis eines Antikörper - Sandwich - Immunoassay geeignet zum Nachweis einer Proteinkonzentration von 4 ppb eind 10 4 cfu / ml Zellen. Szkola et al. 21 weisen eine günstige und zuverlässige Multiplex- Microarray zur gleichzeitigen Detektion von proteotoxins und kleine Toxine, Verbindungen entwickelt , die in der biologischen Kriegsführung verwendet werden könnten. Sie detektiert Konzentrationen von Ricintoxin, mit einer Nachweisgrenze von 3 ppb, in weniger als 20 min. Vor kurzem hat die CYANOCHIP, ein Antikörper - Microarray-basierten Biosensor für die in - situ - Detektion von toxischen und nicht toxischen Cyanobakterien, wurde 22 beschrieben. Dieses Mikroarray ermöglicht die Identifizierung von potentiellen Cyanobakterienblüten, meist in Wasserumgebungen, die mikroskopisch identifiziert schwierig sind. Die Nachweisgrenze des Mikroarrays ist 10. Februar - 10. MÄRZ Zellen für die meisten Arten, dieses Biosensors in ein kostengünstiges Werkzeug für die Multiplex - Detektion und Identifizierung von Cyanobakterien drehen, auch auf Artenebene. Alle diese Eigenschaften machen den Antibody Microarray-Technik und insbesondere in dieser Arbeit vorgestellten Verfahren eine schnellere und einfachere Methode zu den oben genannten Techniken verglichen.

Diese Arbeit stellt zwei Beispiele von Experimenten , die einen Antikörper Biochip-basierten Biosensor , um die Anwesenheit von Cyanobakterien in Boden- und Wasserproben nachzuweisen. Es ist ein einfaches und zuverlässiges Verfahren auf einem Sandwich-Immunoassay-Format basiert, das Volumen und sehr einfache Probenvorbereitung sehr kleine Probe erfordert. Das Verfahren benötigt eine kurze Zeit, und kann leicht in dem Gebiet durchgeführt werden.

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Protokoll

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1. Herstellung der Immunogene

  1. Wachsen jedes cyanobakteriellen Stamm in dem entsprechenden Kulturmedium unter den in Tabelle 1 beschriebenen Bedingungen.
    HINWEIS: Das Wachstumsmedium und Kulturbedingungen für jede Cyanobakterien - Stamm sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Cyanobakterien-Stämme, mit Ausnahme von K17, gehören zu Antonio Quesada Gruppe von Autonoma Universität (Madrid, Spanien). Der Antikörper gegen Planktothrix rubescens wurde aus einer natürlichen Probe der monospezifischen Blüte dieser Cyanobakterium aus Vilasouto Reservoir (Nordspanien) erzeugt.
  2. Quantifizierung der Anzahl von Zellen einer Zell Zählkammer durch Lichtmikroskopie unter Verwendung von etwa 10 8 Zellen / ml von einem späten exponentiellen oder stationären Wachstumsphase Kultur erhalten.
  3. Ernte Zellen von 5 ml Kultur mittels Zentrifugation bei 2.000 × g für 5 min.
  4. Überstand verwerfen und Resuspendieren der Zellen in einem 10-ml-Wannee mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) etwa 10 8 Zellen / ml zu erhalten.
  5. Homogenisieren und die Zellen der Suspension durch Beschallung für 5 Zyklen, jeweils 30 s lysieren, mit einer 30- bis 60-s Pause auf Eis, eine tragbare, handgehaltene Ultraschallprozessor oder durch das Rohr in das Wasserbad eines Tauch Zelle Disruptor bei maximaler Amplitude (30 kHz).
  6. Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,5 für jeden Stamm von Cyanobakterien.
    HINWEIS: Die Ultraschallbehandlung erzeugt Zellaufschluss und zellulären Content-Release. Während Proteine ​​und Polysaccharide sind gute Immunogene, spezifische Moleküle, wie Lipide und Nukleinsäuren, keine humorale Immunantwort selbst induzieren. Deshalb müssen sie an Träger zu binden, wie beispielsweise Polysaccharide oder Proteine, die molekulare Komplexität zu erhöhen. Darüber hinaus löst Beschallen intrazelluläre Material, das die Antikörperproduktion auslösen können.

2. Herstellung von polyklonalen Antikörpern

  1. Bereiten Sie die erste immunogen Dosis in Schritt 1.5 mit 0,5 ml komplettem Freund'schen Adjuvans erhalten 0,5 ml der Ultraschall beanspruchten Zelllysat zu vermischen. Geben Sie es dem Betreiber einer Tieranlage für polyklonalen Kaninchen-Antikörper-Produktion.
  2. Vorbereitung drei Dosen wie zuvor für die weitere Verwendung als Speicher Boosts in der Antikörperherstellungsverfahren von 0,5 mL des gleichen Homogenat / Lysats in Schritt 1.5 mit 0,5 ml unvollständigem Freund'schen Adjuvans vermischt werden. Geben Sie sie an die Tierhaltung, die den Antikörper Produktionsprozess zu erfüllen.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 für jede neue Antikörperproduktionsprozess.
    HINWEIS: Normalerweise wird die Antikörperproduktion an spezialisierte Tiereinrichtungen oder Unternehmen betraut, weil entsprechende Lizenzierung und Ausbildung sind erforderlich, mit Tieren zu arbeiten. Die Unternehmen liefern ein relatives enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Messung der Menge an Antigen-spezifischem Antikörper in der Serumprobe.

3. Antikörper Purification

  1. Man reinige das Immunglobulin G (IgG) -Fraktion von sowohl der Immun- und dem Präimmunserum in Schritt 2 durch Protein-A-Affinitätschromatographie aufgefangen. Einige kommerzielle Reinigung Kits, basierend auf Kartuschensystemen, gut zu funktionieren; folgen Sie den Anweisungen Anbieter.
  2. Wenn der Purification Kit kein Entsalzungssystem, so dass nach der Elution der gereinigten Antikörper des Puffers verändern PBS auf 0,1X, entweder durch Dialyse oder durch Verwendung von Zentrifugal-Filtervorrichtungen mit einer 100-kDa (oder niedriger) Membranporengröße.
  3. Bestimmung der Antikörperkonzentration durch die Absorption bei 280 nm messen oder durch kolorimetrische Methoden verwendet, wie Bradford 23, Lowry 24 oder Bicinchoninsäure (BCA) 25.
    Hinweis: Es ist wichtig , einschließlich der Amingruppen in dem Elutionspuffer zu vermeiden (zB, Tris - Puffer) , weil sie für die Bindung an feste Oberflächen mit dem Antikörper konkurrieren mit Epoxidgruppen aktiviert. Nach purification, ist es wichtig, die Antikörperaktivität mit ELISA getestet.

4. Fluoreszenzantikörpermarkierung

  1. Etikettieren die gereinigten Antikörper erhalten in Abschnitt 3 mit einem Fluorochrom (beispielsweise ein weit roten Fluoreszenzfarbstoff) von einem Handels Phiole aufzulösen enthaltenden Farbstoff zur Markierung von 1 mg Protein in 100 & mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO). Fügen Sie 2 & mgr; l des gelösten Farbstoffs zu jeder Antikörperzubereitung in einer Konzentration von 2 mg / ml in einem Endvolumen von 50 ul in 50 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 8,5).
  2. Pflegen Sie die Markierungsreaktionen unter ständigem Rühren für 1 h bei Raumtemperatur und 1.200 Umdrehungen pro Minute auf einer vibrierenden Plattform.
  3. Reinige den markierten Antikörper durch Grßenausschlußchromatographie (beispielsweise unter Verwendung eines Gels mit einem Fraktionierungsbereich zwischen 1,5 und 30 kDa in eine Säule eingefangen) nach Herstellerempfehlungen.
  4. Messen Sie die Absorption bei 280 nm und bei 650 nm in Eluaten und berechnen die labeling Effizienzen folgenden Herstellerempfehlungen.
    HINWEIS: Bis zu 50 x 50-ul Antikörper-Markierungsreaktionen können mit einem einzigen Fläschchen des Fluoreszenzfarbstoffs zur Markierung von 1 mg des Proteins durchgeführt werden. Es wird empfohlen, die Rohre mit Aluminiumfolie oder alternativ zu bedecken, opaken 0,5-ml-Röhrchen zu verwenden, um Quenchvorgänge nach dem Schritt 4.3 vermeiden. Für IgG-Antikörper wird eine optimale Markierung mit 3-7 mol des Farbstoffs pro Mol des Antikörpers erreicht.

5. CYANOCHIP Produktion

  1. Antikörper und Kontrollen in Drucklösung
    1. Herstellung von 30 & mgr; l jedes gereinigten Antikörpers in Drucklösung durch jeden Antikörper bei 1 mg Mischen / mL in einem handelsüblichen 1x Protein Druckpuffer mit 0,01% (v / v) Tween 20 (ein nichtionisches Detergens), die alle als Endkonzentrationen.
      HINWEIS: Alternativ kann eine Antikörperlösung enthalten 20% Glycerin, 1% (w / v) Saccharose (oder Trehalose, als Konservierungsmittel) und 0,01% (v / v) Tween 20 in Carbonatpuffer (pH 8,5).
    2. Herstellung von 30 & mgr; l der Drucklösung als Kontrolle: (a) 1x Protein Druckpuffer mit 0,01% (v / v) Tween 20, (b) Protein-A gereinigter Präimmunserum bei 1 mg / mL in 1x Protein Druckpuffer mit 0,01% (v / v) Tween 20, und (c) Rinderserumalbumin (BSA) bei 1 mg / mL in 1x Protein Druckpuffer mit 0,01% (v / v) Tween 20.
    3. Herstellung von 30 & mgr; l eines fluoreszierend markierten, gereinigten Präimmunserum in verschiedenen Konzentrationen (beispielsweise von 50 & mgr; g / ml bis 1 ug / ml) in 1x Protein Druckpuffer mit Tween 20, wie in Schritt 5.1.1. Diese Proben werden als fluoreszierende Rahmenmarkierungen verwendet werden und für die relative Fluoreszenzquantifizierung nach Spek.
    4. In 30 & mgr; l pro Vertiefung der Drucklösungen vorbereitet in den Schritten 5.1.1, 5.1.2 und 5.1.3 mit der höchsten Qualität 384-well Mikrotiterplatten für Microarray-Herstellung, wie Polypropylen.
      HINWEIS: Protein Druckpuffer erhöht die Qualität und Stabilität der Antikörper und Tween 20 homogenisiert spot morphology und baut Protein-Kopplung bis nach oben. Es wird empfohlen, die 384-Well-Mikroplatten bei 4 ° C vor dem Gebrauch zu halten. Bewahren Sie es bei -20 ° C für längere Zeiträume. Polypropylen hat eine geringe DNA, Proteine, Zellextrakt und Kleinmolekül intrinsischen Bindungs.
  2. Antikörper Druck auf einen Objektträger
    HINWEIS: Drucken Sie die Antikörper auf aktivierte Objektträger durch verschiedene Array-Plattformen, wie Kontakt, Split-Nadel oder kontaktlose Geräte, wie piezoelektrische Drucker oder "Tintenstrahl" Technologien. In dieser Arbeit wurde die CYANOCHIP durch Kontakt mit einem Robot-System (Arrayers) in der Lage Spek nL Mengen der Antikörper auf der Skala um routinemäßig gedruckt.
    1. Stellen Sie die Umgebungsbedingungen der Druckraum auf 20 ° C und 40 - 50% relativer Luftfeuchtigkeit.
    2. Richten Sie die Dia - Substrate (zB 75- x 25-mm Epoxyaktivierten Mikroskop Objektträger aus Glas) mehrere identische Antikörper arra ausführenys auf jeder Folie.
    3. Finde jedes gereinigte Antikörper, einschließlich der Kontrollen und dem Referenzrahmen, in einem dreifachen Punktmuster; unter diesen Bedingungen sind die Punkte 180 bis 200 & mgr; m im Durchmesser.
    4. Nach dem Drucken lassen Sie die Folien für sie trocken mindestens 30 min bei Umgebungstemperatur zu lassen, und speichern sie dann bei 4 ° C; für auf dem Gebiet arbeiten, können die Objektträger bei Raumtemperatur für mehrere Monate transportiert und gelagert werden.
      HINWEIS: Die CYANOCHIP bei einer dreifachen Punktmicroarray-Format mit 3 x 8 identisch Microarrays pro Folie oder 9 gleichen Arrays in einem 1 x 9 Mikroarray-Format gedruckt. Jedes Array-Größe darf nicht höher sein als die Reaktionskammer Abmessungen für einen 24-Loch-Dichtung (in der Regel 7,5 x 6,5 mm in einem 3 x 8 Hybridisierungskammer).
    5. Bevor Sie den Microarray mit Umweltproben zu analysieren, verwenden Sie FSMI die Arbeitsverdünnung für jeden Antikörper in einer Titrationskurve zu bestimmen. Für jeden Antikörper, eine Standardkonzentration der entsprechenden imm verwendenunogen (10. März - 10. April Zellen / ml) und serielle Verdünnungen des fluoreszierenden Antikörper (zwischen 1: 500 und 1: 32.000). Die optimale Antikörperkonzentration entspricht 50% der maximalen Signalintensität in der Titrationskurve erhalten. Außerdem muss die Empfindlichkeit und Spezifität für jeden Antikörper bestimmt werden, wie in Blanco et al. 22.

6. Herstellung von Umwelt Multianalyt Extrakte für die fluoreszierende Sandwich Microarray-Immunoassays (FSMI)

  1. Multianalyt Extrakt aus einer flüssigen Probe
    1. Nehmen Sie 1 - 100 ml der flüssigen Probe mit einer sterilen Spritze (zB Wasser vom Ufer eines Wasserreservoirs); auf dem Potential Konzentration der Targets stark abhängig ist die Menge an Probe.
    2. Konzentrieren der Zellen durch die Wasserprobe durch ein 3 um Porengröße vorbei, 47 mm Durchmesser Polycarbonat-Filter; eine Zellkonzentrationzwischen 10. März - 10. AUGUST Zellen / ml ist wünschenswert , positive Erkennung, aber die tatsächliche Konzentration unbekannt ist .
    3. Wiederherstellen der Biomasse in dem Filter gesammelt und mit 1 ml einer modifizierten Tris-gepufferte Salzlösung, Tween 20 verstärkten Puffer (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl und 0,1% Tween 20) durch Abschaben mit einem Spatel in ein Rohr 15 mL.
    4. Homogenisieren und disaggregieren durch eine Handultraschallprozessor verwenden, wie es durch Auf- und Abpipettieren mehrmals in Schritt 1.5 oder gerade beschrieben; Dies bereitet die Probe für die Analyse durch den Microarray.
  2. Multianalyt Extrakt aus einer festen Probe
    1. Man wiegt 0,5 g der festen Probe bis (zB Fels, Boden oder Sedimenten) in einen 10-ml - Röhrchen und fügen Sie bis zu 2 ml TBSTRR.
    2. Beschallen durch die Beschallungsgerät Sonde in das Rohr eingetaucht wird, indem das Röhrchen in das Wasserbad eines leistungsfähigen Schalltrichter Eintauchen oder durch eine Hand Sonicator verwenden. Führen Sie mindestens 5 x 30-sZyklen bei 30 kHz, 30 s, während auf Eis zu stoppen.
    3. Filter zu entfernen Sand, Ton und andere grobe Material mit einer 10-ml-Spritze gekoppelt mit einer 10- bis 12 mm Durchmesser, 5- bis 20-um Porengröße Nylon Filterhalter. Schieben der Probe durch den Filter in ein 1,5-ml-Röhrchen. Wenn der Filter sättigt, agitieren die Suspension in der Spritze und nehmen Sie es auf einen neuen; Dies bereitet das Filtrat Material für den Immunoassay (Schritt 7).
      HINWEIS: Die Pufferkapazität des TBSTRR von der Art der Probe abhängt. Es ist wichtig, den Immunoassay unmittelbar nach der Herstellung des Umweltextrakt durchzuführen, die Wirkung des enzymatischen Abbaus auf den Analyten zu vermeiden. Alternativ Protease-Inhibitoren in den Umweltextrakt und gefrier bei -80 ° C bis zum nächsten Schritt.

7. Fluoreszierende Sandwich Microarray-Immunoassays (FSMI)

  1. Das Blockieren der CYANOCHIP
    HINWEIS: Unmittelbar vor dem Gebrauch behandeln die pEDRUCKT gleitet alle freien Epoxidgruppen auf dem Objektträger zu blockieren und den Überschuß an nicht kovalent gebundenen Antikörper zu entfernen.
    1. Eintauchen des Mikroarrays in 0,5 M Tris-HCl (pH 9) mit 5% (w / v) BSA - Lösung auf eine saubere Oberfläche (beispielsweise Petrischale oder einem 50-ml - Röhrchen) unter leichtem Rühren aus einer Schüttelplattform für 5 min. Alternativ legen Sie die Folie nach unten auf ein 100- bis 200-ul Tropfen der obigen Lösung mit den Microarray-Spots es gegenüber. Lassen Sie 3 - 5 min und dann fortzufahren.
    2. holen Sie vorsichtig die Folie mit Kunststoffspitze Zange; versuchen rührend Microarray Zonen zu vermeiden. Beseitigen Sie die überschüssige Flüssigkeit durch sanft die Folie auf einem Papiertuch klopfen. Tauchen in 0,5 M Tris-HCl (pH 8) mit 2% (w / v) BSA-Lösung für 30 min unter leichtem Rühren aus einer Schüttelplattform.
    3. Trocknen Sie die Folie durch eine kurze Zentrifugation Durchführung (200-300 g für 1 min) unter Verwendung eines kommerziellen Mikro für Objektträger angepasst. Alternativ trocknen Sie die Folie durch leise Klopfen ontoa Papiertuch.
  2. Inkubation der Multianalyt Probenextrakt mit dem Mikroarray
    1. Legen Sie die Folie in einer kommerziellen Microarray-Hybridisierungs Kassette mit 24 Vertiefungen für mehrere Mikroarrays; folgen Sie den Anweisungen Anbieter.
    2. Nach Rutsche und Kassettenanordnung, einer Pipette bis zu 50 & mgr; l der Probenlösung oder einer Verdünnung davon in TBSTRR in jede Vertiefung der Kassette.
    3. Wiederholen Sie Schritt 7.2.2 für jede Probe analysiert werden.
    4. Als Blindkontrolle, Puffer 50 Pipette ul TBSTRR in mindestens zwei getrennten Vertiefungen der Kassette.
    5. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 h unter Mischen durch Pipettieren alle 15 min oder unter leichtem Schütteln zu verlassen. Alternativ kann für 12 h bei 4 ° C inkubieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie andere Inkubation Dichtungen als Funktion des Microarray-Muster. Die Zeit und Temperatur der Inkubation in Schritt 7.2.5 sind empirische Parameter, die normalerweise auf der Affinität abhängen und Bindungs ​​kinetik jedes gepaart Antigen-Antikörper.
  3. Waschen
    1. Entfernen Sie die Proben durch die Kassette nach unten setzen und vorsichtig auf ein sauberes, saugfähiges Papier klopfen.
    2. Waschen der Wells durch Zugabe von 150 & mgr; l TBSTRR zu jedem, und der Puffer zu eliminieren, wie oben.
    3. Wiederholen Sie Schritt 7.3.2 drei weitere Male.
  4. Die Inkubation mit fluoreszierenden Antikörpern Detektor
    1. Zugabe von 50 ul einer Antikörpermischung, enthaltend den 17 anti-Cyanobakterien-Dehnungs-Antikörpern, die jeweils mit dem Fluorochrom in TBSTRR markiert mit 1% (w / v) BSA. Bestimmung der Konzentration jedes fluoreszierenden Antikörper in dem Gemisch (0,7-2 ug / ml) durch Titration jedes Antigen / Antikörper - Paar 22 durchgeführt wird .
    2. Inkubieren für 1 h bei Umgebungstemperatur, wie es in Schritt 7.2.5 oder für 12 h bei 4 ° C beschrieben.
  5. Auswaschen der fluoreszierenden Antikörpern </ Strong>
    1. Entfernen Sie die fluoreszierenden ungebundenen Antikörper, wie in Schritt 7.3.
    2. Zerlegen Sie die Kassette und tauchen Sie den Schlitten in 0.1x PBS (zB in einem 50-ml - Röhrchen) für ein schnelles Spülen.
    3. Trocknen Sie die Folie wie in Schritt 7.1.3.

8. Scannen für Fluoreszenz

  1. Scannen Sie den Schieber für die Fluoreszenz bei der maximalen Emissionsfluoreszenzmaximum für weit roten Fluoreszenzfarbstoff in einem Scanner für Fluoreszenz. Nehmen mehrerer Bilder der Mikroarrays mit unterschiedlichen Scanparameter, die allgemein durch das Laserverstärkungswert verringert wird.
    HINWEIS: Vermeiden Sie gesättigte Flecken (> 65.000 Fluorescence Counts) -Sie sind aus Skala von und kann Quantifizierung Fehler einführen.

9. Bildverarbeitung und Datenanalyse

  1. Verwenden Sie eine kommerzielle Software für die Bildanalyse und Quantifizierung; Die Software liefert Messungen der Fluoreszenzintensität (FI; Median oder Mittelwert aller Pixel von einem einzigen Punkt) für eACH Stelle des gesamten Mikroarrays. Ziehen Sie den lokalen Hintergrund rund um die Spots: FI = FI Spot - FI lokalen Hintergrund.
  2. Speichern Sie die FI-Daten und öffnen sie einem Tabellenkalkulationsprogramm.
  3. Verwenden Sie die Werte für die leeren Felder als Negativkontrolle erhalten zu identifizieren und zu verwerfen, die Fehlalarme. Tragen Sie die folgende Gleichung , um die FI für jeden Antikörper vor Ort zu berechnen: FI = (FI Probe - FI blank), wo FI Probe = FI Spot - FI lokalen Hintergrund in den Mikroarrays laufen mit Probenextrakten und FI blank = FI Spot - FI lokalen Hintergrund in den leeren Mikroarrays.
  4. Tragen Sie eine zusätzliche Abschneidegrenze von 2- bis 3-fache des Durchschnitts der FI des gesamten Mikroarray die Wahrscheinlichkeit von Fehlalarmen zu minimieren; Dies ist besonders relevant für die schlechte Qualität der Microarray-Bildern und Low-Signal-zu-Rausch-Verhältnis.
  5. Erstellen Parzellen und / oder eine weitere Analyse, wie erforderlich durchzuführen.

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Ergebnisse

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In dieser Arbeit wird ein Multiplex - Immunoassay - Test für die gleichzeitige Identifikation der wichtigsten Süßwasser Cyanobakterien - Arten (Tabelle 1) mit dem CYANOCHIP Antikörper Microarray. Der Microarray kann ein 3 x 8 Mikroarray-Format auf Mikroskop-Objektträger gedruckt werden. Jeder Mikroarray wird in einem dreifachen Punktmuster, ihre entsprechenden präimmune Antikörper und BSA als negative Kontrollen aus einem Satz von 17 Antikörpern gedruckt gemacht. Die Mik...

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Diskussion

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Hier wird ein Multiplex fluoreszierenden Sandwich - Immunoassay die CYANOCHIP, einen 17-Antikörper - Mikroarrays zum Nachweis und zur Identifizierung einer Vielzahl von cyanobakteriellen Gattungen verwendet wird , wird 22 beschrieben. Diese Cyanobakterien stellen die häufigste benthic und planktonischen Gattungen in Süßwasserhabitaten, einige von ihnen Toxin Produzenten. Vor kurzem hat die fluoreszierende Sandwich - Immunoassay - Format verwendet, Mikroorganismen und / oder Bioanalyten i...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Antonio Quesada an der Universidad Autónoma de Madrid für Cyanobakterien Stämme bieten. Diese Arbeit wurde von der Subdirección General de Proyectos de Investigación der spanischen Ministerio de Economía y Competitividad (Mineco) finanziert wurde, gewährt nicht. AYA2011-24803 und ESP2014-58494-R.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Filter mit 0,22 mm PorendurchmesserMilliporeGSWP04700Zur Herstellung von Immunogenen
Eppendorf  5424R MikrozentrifugeFisher ScientificZur Herstellung von Immunogenen
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 (10x)Thermo Fisher Scientific7001103650 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4
Ultraschallprozessor UP50HHielscherZur Herstellung von Immunogenen
Vollständiges Freund's Adjuvans Sigma-AldrichF5881Immunpotentiator
unvollständig Freuds AdjuvansSigma-Aldbsp;F5506Für Boost-Injektionen
Protein-A-Antikörper-Aufreinigungskit   Sigma-AldrichPURE1A Zur Isolierung von IgG
Zentrifugalfiltergeräte MWCO< 100 kDaMilliporeUFC510096-96KZur Isolierung von IgG-Dialyseschläuchen
, benzoyliertesSigma-AldrichD7884-10FTZur Isolierung von IgG
Illustra Microspin G-50 Säulen GE-HealthCareGE27-5330-02Zur Isolierung des
IgG-Bradford-ReagenzesSigma-AldrichB6916-500 mLZur Quantifizierung der Antikörperkonzentration
MicroBCA-Protein-Assay-Kit Thermo Scientific23235Zur Quantifizierung der Antikörperkonzentration
Protein-Arraying-Puffer 2xWhatman (Sigma Aldrich) S00537Druckpuffer; 30 - 40 % Glycerin in 1x PBS mit 0,01 % Tween
20 Tween 20 Sigma-Aldrich P9416Nichtionisches Detergens
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich A9418Steuerung  für den Druck; Blockierungsreagenz
384-Wells MikroplatteGenetixX6004Für den Antikörperdruck
Roboter-Arrayer für mehrere ObjektträgerMicroGrid II TAS Arrayer von DigilabFür den Antikörperdruck
Epoxidsubstrat GlasobjektträgerArrayit CorporationVEPO25CSolide Unterstützung für den Antikörperdruck
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester Molekulare SondenA20006Fluorochrom
DMSO Sigma-Aldrich D8418Fluorochrom-Lösungsmittel
Heidolph Titramax Schüttler für vibrierende PlattformFisher ScientificFür die Antikörpermarkierung 
Illustra Microspin G-50 Säulen Gesundheitswesen27-5330-01Für die Aufreinigung von markierten Antikörpern
Sichere Versiegelung braune 0,5-ml-RöhrchenSarstedt72.704.001Für die Lagerung von markierten Antikörpern
Nanodrop 1000 SpektralphotometerThermo ScientificZur Quantifizierung der Antikörperkonzentration und Markierungseffizienz
3 & micro; m Porengröße Polycarbonat Filter mit 47 mm DurchmesserMilliporeTMTP04700Zur Konzentration von Zellen
1 M Trizma Hydrochloridlösung pH 8Sigma-Aldbsp;T3038Zur TBSTR-Vorbereitung; zum Blockieren von Objektträgern
NatriumchloridSigma-Aldbsp;S7653Für TBSTRR Vorbereitung
20 & Mikro; M Nylon-Filter MilliporeNY2004700Für die Zubereitung von Umweltextrakten
10 - 12 mm FilterhalterMilliporeSX0001300Für die Zubereitung von Umweltextrakten
Proteasehemmer CocktailSigma-Aldbsp;P8340Für die Lagerung von Extrakten in der Umwelt
1 M Trizma-Hydrochlorid-Lösung pH 9Sigma-Aldrich T2819Zum Blockieren von Objektträgern
Heidolph Duomax 1030 Schüttler für SchaukelplattformVWRZum Blockieren von Objektträgern; für Inkubationsprozesse 
VWR Galaxy Miniarray-MikrozentrifugeVWRC1403-VWRZum Trocknen von Objektträgern
Multi-Well Microarray-HybridisierungskassetteArrayit CorporationAHC1X24Kassette für 24 Assays pro Objektträger
GenePix 4100A Microarray-ScannerMolecular DevicesScanner für Fluoreszenz
GenePix Pro SoftwareMolecular DevicesSoftware für die Bildanalyse und Quantifizierung

Referenzen

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