Methodenartikel

Kernresonanzspektroskopie zur Identifizierung von Multiple Phosphorylierungen von intrinsisch ungeordneten Proteinen

DOI:

10.3791/55001

⸱

27. Dezember 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung mehrerer Phosphorylierungen eines intrinsisch ungeordneten Proteins mittels Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), wobei das Tau-Protein als Fallstudie verwendet wird. Rekombinantes Tau wird vor der Datenerfassung und -analyse in vitro durch eine Kinase isotopenangereichert und modifiziert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aggregate des neuronalen Tau-Proteins befinden sich in Neuronen von Alzheimer-Patienten. Die Entwicklung der Krankheit geht mit einer erhöhten, abnormalen Phosphorylierung von Tau einher. Im Zuge der molekularen Untersuchung der Tau-Funktionen und -Dysfunktionen bei der Erkrankung wird die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) eingesetzt, um die mehrfachen Phosphorylierungen von Tau zu identifizieren. Wir präsentieren hier detaillierte Protokolle der rekombinanten Produktion von Tau in Bakterien, mit Isotopenanreicherung für NMR-Studien. Es werden Reinigungsschritte beschrieben, die sich die Wärmestabilität und den hohen isoelektrischen Punkt von Tau zunutze machen. Das Protokoll für die in vitro Phosphorylierung von Tau durch rekombinant aktiviertes ERK2 ermöglicht die Erzeugung mehrerer Phosphorylierungen. Die Proteinprobe ist zum Zeitpunkt dieser Schritte bereit für die Datenerfassung. Als nächstes wird die Parametereinstellung zum Starten der Aufzeichnung auf dem Spektrometer betrachtet. Abschließend wird die Strategie zur Identifizierung von Phosphorylierungsstellen von modifiziertem Tau auf der Grundlage von NMR-Daten erläutert. Der Nutzen dieser Methodik im Vergleich zu anderen Techniken zur Identifizierung von Phosphorylierungsstellen, wie z. B. Immundetektion oder Massenspektrometrie (MS), wird diskutiert.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine der wichtigsten Herausforderungen der Gesundheitsversorgung im 21. Jahrhundert sind neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer - Krankheit (AD). Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das Mikrotubuli (MT) Bildung stimuliert. Tau gleichmäßig in mehreren neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind, sogenannte Tauopathien, von denen die bekannteste AD ist. In dieser Erkrankungen, Tau Selbst Aggregate in gepaarte helikale Filamente (PHFs) und fand bei vielen Reste durch posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung 1 modifiziert ist. Die Phosphorylierung des Tau-Proteins ist in beiden Regulation seiner physiologischen Funktion von MT Stabilisierung und pathologische Verlust der Funktion impliziert, dass AD-Neuronen charakterisiert.

Weiterhin Tau - Protein, wenn in PHFs in erkrankten Neuronen integriert wird ausnahmslos 2 hyperphosphoryliert. Im Gegensatz zu normalen Tau, die 2-3 Phosphatgruppen enthält, enthält die hyperphosphorylated Tau in PHFs 5 bis 9 phosphate Gruppen 3. Hyperphosphorylierung von Tau entspricht sowohl zu einer Erhöhung der Stöchiometrie an einigen Standorten und zur Phosphorylierung von zusätzlichen Stellen, die pathologische Websites der Phosphorylierung genannt werden. Allerdings Überlappung besteht zwischen AD und normalen erwachsenen Muster der Phosphorylierung trotz quantitative Unterschiede in der Ebene 4. Wie spezifische Phosphorylierungsereignisse Einflussfunktion und Dysfunktion von Tau bleibt weitgehend unbekannt. Wir zielen darauf ab Tau Regulierung durch PTM auf molekularer Ebene zu entschlüsseln.

Um das Verständnis der molekularen Aspekte der Tau zu vertiefen, müssen wir technische Herausforderungen zu bewältigen. Erstens ist Tau ein intrinsisch ungeordneten Protein (IDP), wenn in der Lösung isoliert. Solche Proteine ​​fehlen wohldefinierte dreidimensionale Struktur unter physiologischen Bedingungen und insbesondere biophysikalischen Methoden benötigen, um ihre Funktion (en) und strukturellen Eigenschaften zu studieren. Tau ist ein Paradigma für die wachsende Klasse von IDPs, fand oft im Zusammenhang mitKrankheiten wie neurodegenerative Erkrankungen, die Erhöhung somit das Interesse der molekularen Parameter zugrunde liegenden ihre Funktionen zu verstehen. Zweitens Charakterisierung von Tau-Phosphorylierung ist ein analytisches Herausforderung mit 80 potentiellen Phosphorylierungsstellen entlang der Sequenz des längsten 441 Aminosäure-Tau-Isoform. Eine Anzahl von Antikörpern wurden gegen phosphorylierte Epitope von Tau entwickelt und werden für den Nachweis von pathologischen Tau in Neuronen oder Hirngewebe verwendet. Phosphorylierungsereignisse stattfinden kann auf mindestens 20 Seiten gezielt durch Prolin-gerichtete Kinasen, die meisten von ihnen in der Nähe in der Prolin-reiche Region. Die qualitative (welche Seiten?) Und quantitative (welche Stöchiometrie?) Charakterisierung ist schwierig , auch durch die jüngsten MS - Techniken 5.

NMR-Spektroskopie kann verwendet werden, ungeordnete Proteine ​​zu untersuchen, sind hochdynamische Systeme von Ensembles von Konformeren gebildet. Hochauflösende NMR-Spektroskopie war Anwened sowohl Struktur als auch Funktion des Tau-Proteins zu untersuchen. Darüber hinaus führte die Komplexität der Tau - Phosphorylierung des Profils auf die Entwicklung von molekularen Werkzeugen und neue Analyseverfahren unter Verwendung von NMR zur Identifizierung von Phosphorylierungsstellen 6 - 8. NMR als analytisches Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Tau Phosphorylierungsstellen in einer globalen Weise Visualisierung aller Single-Site-Modifikationen in einem einzigen Experiment, und Quantifizierung des Ausmaßes der Phosphat-Inkorporation. Dieser Punkt ist wichtig, da, obwohl die Phosphorylierung Studien über Tau in der Literatur gibt es zuhauf, die meisten von ihnen wurden mit Antikörpern durchgeführt wurde, ein hohes Maß an Unsicherheit über die gesamte Profil der Phosphorylierung verlassen und damit die tatsächlichen Auswirkungen der einzelnen Phosphorylierungsereignisse. Rekombinante Kinasen einschließlich PKA, Glykogen-Synthase-Kinase-3β (GSK3 & bgr;), Cyclin-abhängige Kinase 2 / Cyclin A (CDK2 / CycA), Cyclin-abhängige Kinase 5 (CDK5) / p25 Aktivator Protein, extrazelluläre-signal-regulated kinase 2 (ERK2) und Mikrotubuli-Affinität regulierenden Kinase (MARK), die in Richtung Tau-Phosphorylierung Aktivität zeigen, können in aktiver Form hergestellt werden. Darüber hinaus Tau-Mutanten, die zur Erzeugung von spezifischen Tau-Protein-Isoformen mit gut charakterisierten Phosphorylierungsmuster ermöglichen, werden verwendet, um die Phosphorylierung Code von Tau zu entziffern. NMR - Spektroskopie wird dann Proben zu charakterisieren enzymatisch modifizierten Tau verwendet , 6 bis 8. Obwohl in vitro Phosphorylierung von Tau schwieriger als Pseudo-Phosphorylierung wie durch Mutation von ausgewählten Ser / Thr in Glutaminsäure (Glu) Resten ist, hat dieser Ansatz seine Vorzüge. Tatsächlich sind weder die strukturellen Auswirkungen noch Wechselwirkungsparameter der Phosphorylierung kann immer durch Glutaminsäure nachgeahmt werden. Ein Beispiel ist das wiederum Motiv um Phosphoserin 202 (pSer202) beobachtet / Phosphothreonin 205 (pThr205), die mit Glu Mutationen 9 nicht wiedergegeben wird.

Hier wird die Herstellung von isotopenmarkierten Tau für NMR-Untersuchungen wird zuerst beschrieben. Tau-Protein durch ERK2 phosphoryliert wird auf zahlreichen Standorten als pathologisch Websites der Phosphorylierung beschrieben modifiziert und stellt somit ein interessantes Modell von hyperphosphorylated Tau. Ein detailliertes Protokoll von Tau in vitro - Phosphorylierung durch rekombinante ERK2 - Kinase vorgestellt. 12 - ERK2 durch Phosphorylierung von MAP-Kinase-Weg / ERK - Kinase (MEK) 10 aktiviert. Zusätzlich zur Herstellung von modifizierten, isotopenmarkierte Tau-Protein, die Strategie zur Identifizierung des PTMs verwendet NMR beschrieben.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Herstellung von 15 N, 13 C-Tau (Figur 1)

  1. Trans pET15b-Tau rekombinanten T7 Expressionsplasmid 13,14 in BL21 (DE3) kompetente Escherichia coli Bakterienzellen 15.
    HINWEIS: Die cDNA - Codierung für die längste (441 Aminosäurereste) Tau - Isoform zwischen NcoI und XhoI - Restriktionsstellen in den pET15b - Plasmid kloniert.
    1. Vorsichtig mischen 50 ul kompetente BL21 (DE3) -Zellen, Umformen 1-5 x 10 7 Kolonien pro ug Plasmid DNA mit 100 ng Plasmid - DNA in einem 1,5 ml Kunststoffröhrchen.
      HINWEIS: codonspezifische Nutzung optimierte Bakterienstämme für die eukaryotische cDNA-Expression sind nicht erforderlich, um menschliche Tau zu erzeugen.
    2. Legen Sie das Zellgemisch auf Eis für 30 min und dann Hitzeschock für 10 Sekunden bei 42 ° C. Das Röhrchen wieder auf Eis für 5 min und 1 ml Raumtemperatur LB (Luria-Bertani) -Medium. Inkubieren der Bakteriensuspension bei 37 ° C für 30 min unter leichtemAgitation.
  2. Verteilt auf einer Impföse 100 ul Zellsuspension gleichmäßig auf einer Agarplatte LB-Medium verwendet, das 100 ug / ml Ampicillin Antibiotikum.
  3. Inkubieren Sie die Selektionsplatte für 15 Stunden bei 37 ° C.
  4. Halten Sie die Selektionsplatte bei 4 ° C bis zur Kultur Schritt fortfahren, für ein Maximum von ca. 2 Wochen.
    HINWEIS: a Glycerolstammlösung Bakterienkultur (50% Glycerin) bei -80 ° C gelagert, kann hergestellt werden, um die Kultur zu einem späteren Zeitpunkt zu starten.
  5. 1 ml 1 M MgSO 4, 1 ml 100 mM CaCl 2, 10 ml 100x MEM Vitamin Komplement, 1 ml 100 mg / ml Ampicillin bis 1 L autoklaviertem M9 - Salze (6 g Na 2 HPO 4, 3 g KH 2 PO 4 0,5 g NaCl).
    HINWEIS: Ein weißer Niederschlag bei Zugabe des CaCl 2 Lösung für die M9 - Salze bilden, die sich schnell verflüchtigt.
  6. Solubilisieren 300 mg 15 N, 13 C-Komplettmedium, 1 g 15NH 4 Cl und 2 g 13 C 6 -Glukose in 10 ml M9 - Medium. Filter-Sterilisieren der Isotopenlösung mit einer 0,2 um-Filter direkt in dem M9-Medium.
  7. Suspend eine Impföse eine Kolonie von pET15b-Tau transformierten Bakterien von der Selektionsplatte in 20 ml LB Medium, ergänzt mit 100 & mgr; g / ml Ampicillin.
  8. Inkubieren des beimpften Mediums bei 37 ° C für etwa 6 Stunden.
  9. Die optische Dichte bei 600 nm (OD 600) von 1 ml einer zehnfachen Verdünnung der Bakterienkultur in einer Plastik Spektrometers Küvette.
    HINWEIS: Die Trübung der Bakterienkultur entsprechend 600 von 3,0-4,0 zu OD zeigt an, dass Sättigungswachstumsphase erreicht ist.
  10. 20 ml der gesättigten LB-Kultur auf 1 l M9-Nährmedium, ergänzt mit Ampicillin (100 ug / ml Endkonzentration) in 2 l Erlenmeyer-Kunststoff verwirrt Kulturflasche.
  11. Legen Sie die Kulturflasche in einem programmierbaren Inkubator auf 10 °C und 50 Umdrehungen pro Minute. Programmieren Sie den Inkubator auf 200 Umdrehungen pro Minute und 37 ° C am frühen Morgen des nächsten Tages zu wechseln.
  12. Maßnahme OD 600 von 1 ml der Bakterienkultur in einer Plastik Spektrometers Küvette. Werden 400 ul 1 M IPTG (Isopropyl - β-D-1-thiogalactopyranosid) Stammlösung (bei -20 ° C gehalten) , wenn OD 600 einen Wert von etwa 1,0 erreicht die Expression von rekombinanten Tau - Proteins zu induzieren.
  13. Weiterhin die Inkubation bei 37 ° C für weitere 3 Std. Sammeln der Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 20 min.
  14. Frieren Sie das Bakterienpellet bei -20 ° C. Halten eingefroren, bis der Reinigungsschritt für eine längere Zeit, wenn nötig.

2. Reinigung von 15 N, 13 C-Tau (Figur 2)

  1. Autoklav Kationenaustausch (CEX) Reinigungspuffer bei 121 ° C unter 15 psi für 20 min. Speicher-Puffer bei 4 ° C.
  2. Tauen die bakterielle Zellpellet und resuspendieren gründlich in 45 mlEin Puffer Extraktions CEX (50 mM NaPi-Puffer, pH 6,5, 1 mM EDTA) frisch mit Protease-Inhibitor-Cocktail 1x (1 Tablette) und DNAseI (2.000 Einheiten) ergänzt.
  3. Stören die Bakterienzellen bei 20.000 psi einen Hochdruck-Homogenisator verwendet wird. 3-4 Pässe sind erforderlich. Zentrifuge bei 20.000 xg für 40 Minuten von unlöslichem Material zu entfernen.
  4. Erhitzen Sie das Bakterienzellextrakt für 15 min bei 75 ° C im Wasserbad verwendet wird.
    HINWEIS: ein weißer Niederschlag nach wenigen Minuten beobachtet wird.
  5. Zentrifuge bei 15.000 × g für 20 Minuten und halten Sie den Überstand des hitzestabilen Tau-Protein enthält.
  6. Lagerung bei -20 ° C bis zum nächsten Reinigungsschritt, wenn nötig.
  7. Durchführen einer Kationenaustausch - Chromatographie auf einem starken CEX Harz gepackt als eine 5 ml Bettsäule eine schnelle Protein - Flüssigchromatographie (FPLC) -System (Figur 3 A).
    1. Durchflussrate einstellen auf 2,5 ml / min.
    2. Äquilibrieren der Säule in CEX Ein Puffer
    3. Laden Sie die 60-70 ml beheizbarAuszug mit einem Tau eine Probenpumpe, oder alternativ eine Pumpe auf dem System abhängig. Sammeln Sie die Flow-Through zur Analyse, um zu überprüfen, dass Tau-Protein effizient an das Harz bindet (siehe 2.8).
    4. Das Harz wird mit CEX Ein Puffer, bis die Absorption bei 280 nm zurück zum Ausgangswert ist.
    5. Elute Tau aus der Säule unter Verwendung eines dreistufigen NaCl-Gradienten durch allmähliche Erhöhung des CEX B Puffer erhalten (CEX A-Puffer mit 1 M NaCl). Programm die FPLC wie folgt: erster Schritt des Gradienten auf 25% CEX B-Puffer in 10 Säulenvolumina (CV) in 5 CV 250 mM NaCl, zweiten Stufe auf 50% CEX B Puffer zu erreichen, 500 mM NaCl zu erreichen, und der dritte Schritt zu 100% CEX B-Puffer NaCl zu erreichen in 2 CV 1 M. Sammeln 1,5-ml-Fraktionen in den Eluierungsschritte.
  8. Analyse 10 & mgr; l der Fraktionen während der Elutionsschritt durch SDS-PAGE (12% SDS-Acrylamid - Gel) und Coomassie - Färbung (3 A) 16 gesammelt. Überprüfen Sie den Ladeschritt auf der Säule als auch von Analy10 ul der Durchfluss zing.
  9. Wählen Sie die Fraktionen, die Tau und diese Fraktionen für den nächsten Schritt bündeln.
  10. Führen Sie einen Pufferaustausch auf Tau-enthaltenden vereinigten Fraktionen (Abbildung 3 B).
    1. Äquilibrieren eine Entsalzungssäule von 53 ml G25 Harz gepackt Bett (26 x 10 cm) in 50 mM Ammoniumbicarbonat (flüchtige Puffer) mit einem FPLC-System.
    2. Set Durchflussrate von 5 ml / min. Injizieren Sie die Tau Probe auf der Säule über eine 5 ml Injektionsschleife. Sammle Fraktionen bei 280 nm auf die Absorptionsspitze entspricht.
    3. Wiederholen der Injektions 3-4 mal, abhängig von dem Volumen der anfänglichen CEX Pool.
  11. Berechne die Menge an gereinigtem Tau-Proteins durch die Peakfläche des Chromatogramms bei 280 nm unter Verwendung von (1 mg von Tau entspricht 140 mAU * ml).
    HINWEIS: Der Extinktionskoeffizient des Tau - Proteins bei 280 nm ist 7550 M -1 cm -1. Tau enthält keine Trp-Resten.
  12. Pool alle Tau Fraktionen.
  13. aliquot die Probe in Röhrchen das Äquivalent von 1 bis 5 mg Tau enthält. Wählen, um diese Rohre so dass das Volumen der Lösung kleiner dem Volumen des Rohrs verglichen wird (beispielsweise 5 ml Lösung in einem 50 ml Röhrchen).
  14. Stanzlöcher in den Rohrkappen mit einer Nadel. Gefriert Tau-Proben bei -80 ° C.
  15. Lyophilisieren Tau-Proben. Lyophilisierte Tau-Protein kann bei -20 ° C für lange Zeiträume gehalten werden.

3. In - vitro - Phosphorylierung von 15 N-Tau

  1. Man löst 5 mg lyophilisiertes Tau in 500 ul Phosphorylierung Puffer (50 mM Hepes · KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
  2. In 2,5 mM ATP (25 & mgr; l 100 mM Stammlösung bei -20 ° C gehalten), 1 mM DTT (1 ul 1 M Stammlösung bei -20 ° C gehalten), 1 mM EGTA (2 ul einer 0,5 M Stamm Lösung), Cocktail-1x-Protease-Inhibitor (25 ul eines 40x Lager durch Auflösen von 1 Tablette in 1 ml Phosphorylierung Puffer erhalten) und 181; M aktiviert His-ERK2 (250 & mgr; l in Erhaltungspuffer 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl und 10% Glycerin bei -80 ° C gelagert) in einem Gesamtprobenvolumen von 1 ml.
    HINWEIS: Die aktivierte His-ERK2 kann in-house 5,8 durch Phosphorylierung mit dem MEK - Kinase hergestellt werden.
  3. Inkubieren 3 h bei 37 ° C.
  4. Die Probe wird bei 75 ° C für 15 min ERK-Kinase zu inaktivieren.
  5. Zentrifuge bei 20.000 xg für 15 min. Sammeln und den Überstand zu halten.
  6. Entsalzen die Proteinprobe in 50 mM Ammoniumbicarbonat eine Säule von 3,45 ml G25-Harz gepackte Bett (1,3 x 2,6 cm) verwendet, die für eine 1 ml Probe geeignet ist.
  7. Führen Sie einen 12% SDS-PAGE 16 mit 2,5 & mgr; l der Proteinprobe sowohl seine Integrität und effiziente Phosphorylierung (Abbildung 4) zu überprüfen.
  8. Lyophilisieren das phosphorylierte Tau Probe. Lagern Sie das Pulver bei -20 ° C.

4. Akquisition von NMR-Spektren (FiAbbildung 5)

  1. Solubilisieren 4 mg lyophilisiertes 15 N, 13 C ERK-phosphorylierte Tau-in 400 & mgr; l NMR - Puffer (50 mM NaPi oder 50 mM deuteriertem Tris- d11 .Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA und 1 mM DTT).
  2. Werden 5% D 2 O für Feld Verriegelung des NMR - Spektrometers und 1 mM TMSP (3- (Trimethylsilyl) propionsäure-2,2,3,3-d 4-Natriumsalz)) als interne NMR Signal Referenz. In 10 ul einer 40x Stammlösung von kompletten Protease-Inhibitor-Cocktail.
  3. Übertragung der Probe in ein 5 mm NMR-Röhrchen eine elektronische Spritze mit einer langen Nadel oder Pasteurpipette. Schließen Sie das NMR-Röhrchen den Kolben verwendet wird. Entfernen Sie alle Luftblasen gefangen zwischen Kolben und Flüssigkeit durch Kolbenbewegungen.
  4. Legen Sie das NMR-Röhrchen in einer Schleuder. Einstellen seine vertikale Position in dem Spinner mit entsprechendem Maß für die NMR-Probenkopf verwendet, so dass die meisten der Probenlösung innerhalb der NMR-Spule sein.
  5. Starten Sie den Luftstrom: Klicken Sie Lift in der Magnetsteuersystemfenster. Legen Sie das Spinner mit dem Schlauch in der Luftstrom an der Spitze der Magnetbohrung. Stoppen Sie den Luftstrom (klicken Lift) und lassen Sie das Rohr hinunter in Platz im Inneren des Sondenkopf im Magneten.
  6. Temperatur auf 25 ° C (298 K).
  7. Führen Sie halbautomatische Abstimmung und Anpassung der Sondenkopf über die Stromübertragung zu optimieren. Geben Sie ATMM auf der Kommandozeile.
  8. Sperren Sie die Spektrometerfrequenz unter Verwendung des D 2 O - Signal der Probe auf das Deuterium - Kanal aufgezeichnet. Klicken Sie Sperre in der Magnetsteuersystemfenster.
  9. Starten Sie die Shim-Verfahren an der Position, die Homogenität des magnetischen Feldes der Probe zu optimieren. Geben Sie topshim gui auf der Kommandozeile das Shim - Fenster zu öffnen. Klicken Sie in der Shim - Fenster starten. Überprüfen Sie die Rest B0 Standardabweichungswert, um zu überprüfen, dass Unterlegscheiben optimal sind (weniger als 2 Hz ist gut).
  10. Kalibrieren des p1-Parameter (Länge eines ProtonsHochfrequenzpuls in & mgr; sec), die eine Drehung um 90 ° von Protonenspins zu erhalten, notwendig ist. Ziel für den 360 ° -Impuls ein 1D - Spektrum Wasserprotonen (Abbildung 6) verwendet wird .
  11. Einstellung der Frequenzversatz durch die o1 Parametereinstellung (in Hz) an die Protonenwasserfrequenz in der 1D - Spektrum (Abbildung 6).
  12. Beginnen Erwerb eines 1D Protonenspektrum (Pulsfolge mit Watergate Sequenz zur Unterdrückung Wassersignal, beispielsweise zggpw5) zu verifizieren Signale von der Probe (7). Passen Sie die Anzahl der Scans auf die relative Proteinkonzentration. Geben Sie auf der Kommandozeile zg die Messung zu starten.
  13. Richten Sie zusätzliche Parameter für den Erwerb eines 2D [1 H, 15 N] HSQC - Spektrum (hsqcetfpf3gpsi Impulsfolge, Figuren 8-9).
    1. Für eine 15 N, 13 C - markierten Probe, entkoppeln 13 C während der 15 N indirekte Evolution.
    2. Die Anzahl der Punkte und die spektrale Breite (ppm) im 1 H (F2) und 15 N (F1) Dimensionen ein.
      HINWEIS: Passen Sie die Anzahl der Erwerb Datenpunkte in das Spektrometer Feld eine ähnliche Anzahl von Hz pro Punkt zu halten und mal Entkopplung zu begrenzen: 3.072 Punkte bei 900 MHz und 2.048 Punkte bei 600 MHz, im 1 H - Dimension verwenden.
    3. Optimieren Sie zusätzliche Parameter in den Impulsfolgen, entsprechend verzögert, Pulslängen, Offset-Frequenzen, Leistungsstufen. Geben Sie auf der Kommandozeile asierend alle relevanten Parameter für das Experiment anzuzeigen.
  14. Stellen Sie die Parameter für den Erwerb eines 3D [1 H, 15 N, 13 C] HNCACB Spektrum (Pulsfolge hncacbgpwg3d, 10A) bei 600 MHz.
  15. Stellen Sie die Parameter für einen 3D - [1 H, 15 N, 15 N] HNCANNH Experiment (Impulsfolge hncannhgpwg3d) bei 600 MHz. Stellen Sie die Anzahl der Punkte auf 2048 im 1 H und 64und 128 Punkte in den zwei 15 N Dimensionen. Definieren die spektralen Breiten 14, 25, 25 Teile pro Million (ppm) zentriert auf 4,7, 119, 119 ppm in dem 1 H, 15 N und 15 N Dimensionen. Dauer des Erwerbs mit 16 Scans beträgt 1 Tag und 22 Stunden.

5. Identifizierung von Phosphorylierungsstellen

  1. Verfahren Spektren Erfassung und Verarbeitung NMR Software.
    1. Durchführen einer Fourier - Transformation der Daten (Abbildung 7). Typ ft für ein 1D - Spektrum, xfb für ein 2D - Spektrum oder ft3d für ein 3D - Spektrum, auf der Kommandozeile.
    2. Phase und Referenz alle Spektren (Abbildung 7C) mit Hilfe der interaktiven Fenster.
  2. Identifizieren Resonanzen von Interesse in der 2D - HSQC möglicherweise entsprechend phosphoryliert Ser und Thr - Resten (Abbildung 9, roter Kasten).
  3. Extract Ebenen (dh 2D - 1 H- 13 C - Spektren) vondie 3D - 1 H- 15 N - 13 C - Spektrum der 15 N chemischen Verschiebungen von Resonanzen von Interesse in der 2D verwendet. Mit dem Cursor der Dimension 2 (w2) , um die 15 N Frequenz entsprechend der Ebene (w1-w3) zu wählen zu visualisierenden (10B).
  4. Wählen Sie die Resonanzfrequenzen von "CA" und "CB" 13 C - Kerne des "i" und "i-1" Rückstände (schwächere Satz von Signalen im Vergleich zu denen des i - Rest) für jeden [1 H, 15 N] Resonanz Interesse an der HNCACB 3D-Spektrum auf die Resonanz durch Anklicken im Modus Menü Zeiger finden / add Spitze, die chemische Verschiebungswert in einer Peak-Liste-Datei hinzuzufügen.
    1. Identifizieren Sie den i - Rest - Typ, pSer oder pThr, durch die chemischen Verschiebungen Vergleich in der Peak - Liste mit bekannten Werten von CA und CB chemischen Verschiebungen von pSer und pThr 17.
    2. Identifizieren Sie die Anwesenheit eines Pro-Rest an der i + 1-Position durch eine charakteristische zusätzliche 2 ppm Verschiebung of der CA chemische Verschiebungswert 18.
    3. Vergleichen die chemischen Verschiebungswerte der CA und CB Resonanzen entsprechend dem i-1 - Rest zu einer Tabelle der chemischen Verschiebungen für Tau Aminosäurereste 19 vorhergesagt , die Natur des Rückstands zu identifizieren an der i-1 - Position.
  5. Wählen Sie die Resonanzfrequenzen von 15 N - Kerne des "i" und "i-1 'Reste für jeden [1 H, 15 N] Resonanz von Interesse in der HNCANNH Spektrum.
  6. Vergleichen Sie die 15 N Werte der chemischen Verschiebung der chemischen Verschiebung Zuordnung des Tau - Proteins 20-23.
  7. Vergleichen Sie die identifizierten Dipeptide mit der Tau-Sequenz die sequenzspezifische Zuordnung zu definieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3A zeigt eine Hauptabsorptionspeaks bei 280 nm während des Elutionsgradienten beobachtet. Dieser Peak entspricht gereinigtes Tau-Protein über dem Chromatogramm auf dem Acrylamidgel gesehen wie. Figur 3B zeigt eine gut getrennt Absorptionsmaximum bei 280 nm und die Spitzen der Leitfähigkeit, so dass das Entsalzen des Proteins effizient ist. Figur 4 zeigt Proteingel-shift beobachtet durch SDS-PAGE - Analyse 16 charakteristisch für multiple Proteinphosphorylierung (vergleiche Spuren...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir haben NMR-Spektroskopie verwendet enzymatisch modifizierten Tau-Proben zu charakterisieren. Die rekombinante Expression und Reinigung der menschlichen Volllängen-Tau-Protein hier beschrieben sind, können in ähnlicher Weise zu erzeugen mutanten Tau oder Tau-Domänen verwendet werden. Isoto- Protein wird für die NMR-Spektroskopie benötigt, rekombinante Expression erforderlich macht. Identifizierung von Phosphorylierungsstellen erfordert Resonanzzuordnung und 15 N, 13 C doppelt markierte Protein. A...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die NMR-Einrichtungen wurden von der Region Nord, dem CNRS, dem Pasteur-Institut in Lille, der Europäischen Gemeinschaft (FEDER), dem französischen Forschungsministerium und der Universität für Wissenschaften und Technologien in Lille finanziert. Wir danken der Unterstützung durch das TGE RMN THC (FR-3050, Frankreich), FRABio (FR 3688, Frankreich) und die NMR und RPE Health and Biology Core Facility in Lille. Unsere Forschung wird durch Fördermittel des LabEx (Laboratory of Excellence), DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer's disease), EU ITN TASPPI und ANR BinAlz unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
pET15B rekombinantes T7-ExpressionsplasmidNovagen69257Bei -20 ° C
BL21(DE3) Transformation kompetent E. coli BakterienNew England BiolabsC2527IHalten bei -80 &de; C
Autoklavierte LB-Brühe, Lennox DIFCO240210Bakterielles Wachstumsmedium
MEM-Vitaminergänzung 100xSigma58970CBakterielles Wachstumsmedium Ergänzung
15N, 13C-ISOGRO komplettes Medium Pulver Sigma608297Bakterielles Wachstumsmedium Ergänzung
15NH4ClSigma299251Isotop
13C6-GlucoseSigma389374Isotopenproteasehemmer
TablettenRoche5056489001Bei 4 Grad halten; C
1 Tablette in 1 ml ist eine 40-fache Lösung, die bei -20 & Grad aufbewahrt werden kann; C
DNaseIEUROMEDEX1307Bei -20° halten;
C-Homogenisator (EmulsiFlex-C3)Die AVESTIN-Lysewird bei 4 &° C durchgeführt. C
Pierce&Handel; Ungefärbtes Protein MW MarkerPierce
, GST TaggedSigmaM8822Halten bei -80 &de; C
AKTÄ Reines Chromatographie-SystemGE HealthcareFPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml Säule)GE Healthcare17-5156-01Kationenaustausch-Chromatographie-Säulen
HiPrep 26/10 EntsalzungGE Healthcare17-5087-01Protein-Entsalzungssäule
PD MidiTrap G-25GE Healthcare28-9180-08Protein-Entsalzungssäule
Tris D11, 97% DCortecnetCD4035P5Deuterierter NMR-Puffer
5 mm Symmetrisches Mikroröhrchen SHIGEMI D2O (5er-Set Innen- und Außenrohr) Euriso-topBMS-005BNMR Shigemi Tubes
eVol Kit-Elektronische Spritze Starter KitCortecnet2910000Pipettieren
Bruker 900 MHz AvanceIII mit einem Kryo-Dreifachresonanz-SondenkopfBrukerNMR-Spektrometer für die Datenerfassung
Bruker 600 MHz Avance mit einem Kryo-Dreifachresonanz-SondenkopfBrukerNMR-Spektrometer für die Datenerfassung
TopSpin 3.1BrukerErfassungs- und Verarbeitungssoftware für NMR-Experimente
Sparky 3.114UCSF (T. D. Goddard und D. G. Kneller)Software zur Analyse von NMR-Daten
266109 aktive humane MEK1-Kinase

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482(2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34(2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679(2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521(2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Tau Protein PhosphorylierungRekombinante ProteinproduktionIsotopenanreicherungKationenaustauschchromatographieReinigung durch Hitzestabilit tIn vitro PhosphorylierungNMR DatenerfassungIdentifizierung der Phosphorylierungsstellen

Verwandte Artikel