Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung C. difficile PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

Summary

Prolin-Prolin-Endopeptidase-1 (PPEP-1) ist eine sezernierte Metalloprotease und ein vielversprechendes Wirkstoffziel aus dem humanpathogenen Clostridium difficile. Hier beschreiben wir alle Methoden, die für die Herstellung und Strukturbestimmung dieses Proteins notwendig sind.

Abstract

Neue Therapien werden benötigt, um Clostridium difficile-Infektionen zu behandeln, die eine große Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellen. Die C. difficile Metalloprotease PPEP-1 ist ein Ziel für die zukünftige Entwicklung von Inhibitoren, um die Virulenz des Erregers zu verringern. Für die biophysikalische und strukturelle Charakterisierung sowie das Inhibitor-Screening werden große Mengen an reinem und aktivem Protein benötigt. Wir haben ein Protokoll für die effiziente Produktion und Reinigung von PPEP-1 unter Verwendung von E. coli als Expressionswirt entwickelt, das ausreichende Mengen und Reinheit des Proteins für die Kristallisation und Strukturbestimmung liefert. Darüber hinaus können durch Microseeding stark verwachsene Kristalle von PPEP-1 zu wohlgeordneten Kristallen gezüchtet werden, die für die Röntgenbeugungsanalyse geeignet sind. Die Methoden könnten auch zur Herstellung anderer rekombinanter Proteine und zur Untersuchung der Strukturen anderer Proteine verwendet werden, die verwachsene Kristalle erzeugen.

Introduction

Clostridium difficile ist eine der Hauptursachen für nosokomiale Antibiotika-assoziierter Diarrhoe Infektionen ^1. Diese grampositive anaerobe Bakterium wird durch seine Sporenform über die fäkal-oral übertragen. In den letzten zehn Jahren neue '' Epidemie '' oder '' hyper '' Stämme (zB BI / NAP1 / 027) führte zu einer drastischen Zunahme der Neuinfektionen und Todesraten in Nordamerika und Europa ^2. C. difficile - assoziierten Erkrankungen (CDAD) ist eine lebensbedrohliche Kolon Entzündung mit einer hohen Sterblichkeitsrate ^3. Die Symptome reichen von Durchfall ⁴ bi....

Protocol

1. Klonierung und Konstruieren Entwurf

1. Klonen Sie die Codon-optimierte Sequenz (für E. coli) von C. difficile PPEP-1 ohne das Signalpeptid [Aminosäuren 27-220, nachstehend genannten rekombinanten PPEP-1 (rPPEP-1) ^11] in den pET28a Vektor mit NdeI und Xho I - Restriktionsstellen (Figur 1) mit einem Stopp - Codon am 3'-Ende (resultierende Vektor pET28a-NHis-rPPEP-1). Dies erzeugt eine N-terminal 6xHis-markierte Protein (NHis-rPPEP-1) mit einer Website Thrombinschnittstelle so dass der Tag während der Reinigung zu entfernen (Abbildung 1). Das Plasmid enthält ein Kanamycin-Resiste....

Results

rPPEP-1 wird in verschiedene E. coli - Stämmen überexprimiert, mit der höchsten Ausbeute in E. coli BL21 (DE3) Star (Abbildung 1C). Nach dem ersten Chromatographieschritt NiNTA Affinität der 6xHis-Tag erfolgreich von den meisten werden können des Proteins und in dem zweiten Schritt NiNTA unverdaute Protein vollständig von Thrombin-verdautem Protein (1D) abgespalten getrennt werden können. Auf einer S200 - Säule 16/600 unmarkierte rPPEP-.......

Discussion

Röntgenkristallographie ist immer noch die schnellste und genaueste Methode zur Bestimmung dreidimensionaler nahe Strukturen mit atomarer Auflösung von Proteinen ^28. Es erfordert jedoch das Wachstum von gut geordneten Einkristallen. Diese sind oft schwer zu bekommen und der kristalline Zustand ist künstlich. Ein Vergleich der Proteinstrukturen durch Röntgenkristallographie mit den durch andere Verfahren bestimmt jedoch, insbesondere NMR, zeigt im Allgemeinen eine sehr gute Übereinstimmung. Im Falle von PPEP-1.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene / Vektoren / Zellstämme
pET28a-Vektor	Merck-Millipore	69864	Thrombin spaltbarer N-terminaler His-Tag
E. coli Stamm BL21 (DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003	RNase H-defizientes
Codon-optimiertes Gen (für E. coli) von PPEP-1 (CD630_28300)	Geneart (Thermo Fisher Scientific)	benutzerdefinierte	Aminosäuren 27-220
Name	Company	Katalognummer	Comments
<>Chemicals
Hefeextrakt	beliebig
Trypton
Antifoam B	Sigma-Aldrich	A5757	wässrige Silikonemulsion
Agar	jedes
Kanamycin	jedes
IPTG	AppliChem	A1008
Tris-HCl	AppliChem	A1087	Puffer
Qualität NaCl	jedes		Puffer
Grade DNaseI	AppliChem	A3778
Imidazol	AppliChem	A1073
Thrombin	Sigma-Aldrich	T4648
Ammoniumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	215996
Glycerin 100%	jede		reinste Qualität
Saccharose	Sigma-Aldrich	84097
Flüssigkeit Stickstoff	alle		zur Lagerung und Kryokühlung von Kristallen
Name	<>Unternehmen	Katalognummer<	strong>Kommentare
<>Ausrüstung (allgemein)
Schüttel-Inkubator	beliebig		mit Temperaturen von 20 ° C - 37 &Grad; C
Glaswaren	alle		Erlenmeyerkolben mit Prallwänden (50 ml - 2,8 L)
Zentrifuge für große Kulturvolumina	jede		Zentrifuge für Verarbeitungsvolumina bis zu 12 L
Ultraschallgerät Vibra-Cell VCX500	Sonics	SO-VCX500	oder jedes andere Ultraschallgerät / Zelldisruptor
Ultrazentrifuge	jede		Zentrifuge mit Geschwindigkeiten bis zu 150.000 x g
NiNTA Superflow-Harz	Qiagen
Empty Glass Econo-Column	Bio-Rad	7371007	oder jede andere leere Glas- oder Kunststoffsäule
Größenausschluss Chromatographiesäule HiLoad Superdex 200 16/600	GE Healthcare	28989335
Chromatographiesystem & Auml; kta Purifier,	GE Healthcare	28406264	oder jedes andere Chromatographiesystem
Dialyseschläuche, Spectra/Por, 3	Spectrum Labs	132724
Dialyseschlauchverschlüsse,	Spectrum Labs	132738
Ultrafiltrationseinheiten (Konzentratoren), 10.000 NWCO,	jedes
UV-Vis-Spektralphotometer	beliebige
< strong>Name	<>Unternehmen	>Katalognummer<	>Kommentare
Ausrüstung (Kristallographie)
Pipette mit geringem Volumen 0,1-10 & Mikro; l	beliebige
Verdrängerpipette Microman M10	Gilson	F148501
Kristallisationsroboter	beliebige
96-Well-Kristallisationsplatten TTP IQ mit drei Protein-Wells	TTP	4150-05810	oder jede andere 96-Well-Kristallisationsplatte
24-Well-CombiClover Junior Plate	Jena Bioscience	EB-CJR
Crystal Clear Sealing Tape	Hampton Research	HR3-511
Abdeckfolien aus silikonisiertem Glas	Hampton Research	HR3-225
Kommerzielle Kristallisationssiebe: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal	Hampton Research	diverse
Kommerzielle Kristallisationssiebe: Wizard, PACT++, JCSG++Jena	Bioscience	diverse
JBS Beads-for-Seeds	Jena Bioscience	CO-501
CrystalCap SPINE HT (Nylonschlaufen)	Hampton Research	diverse	Schlaufengrößen 0,025 mm - 0,5 mm
CrystalCap Vial	Hampton Research	HR4-904
Kryo-Schaum Dewar 800 ml	Hampton Research	HR4-673
Cryogenic Foam Dewar 2 L	Hampton Research	HR4-675
Fläschchenklemme, gerade	Hampton Research	HR4-670
CrystalWand Magnetisch, gerade	Hampton Research	HR4-729
CryoCane 6 Fläschchenhalter	Hampton Research	HR4-711
CryoSleeve	Hampton Research	HR4-708
CryoCane Farbcodierer - Weiß	Hampton Research	HR4-713
Skalpell	beliebig
Gerade Mikrozange	beliebig		zur Manipulation von Dichtungsband. etc.
Akupunkturnadel	beliebig		z.B. aus der Apotheke
Stereomikroskop	beliebig		zur Inspektion von Kristallisationsplatten und Kristalleinfassung, Vergrößerung bis zu 160X