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Live-Imaging zur Untersuchung Mikrotubuli dynamische Instabilität in Taxan-resistenten Mammakarzinome

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DOI:

10.3791/55027

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20. Februar 2017

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, Signal Transduction Research Group, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Artikel berichten wir über ein Protokoll, das eine in vivo-Methode zur Messung der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli in Docetaxel-resistenten Brustkrebszellen (MCF-7TXT) beschreibt. Bei dieser Methode wird ein Dekonvolutionsmikroskopie-Bildgebungssystem verwendet, um die Expression von GFP-Tubulin in Zielzellen nachzuweisen.

Zusammenfassung

Taxane wie Docetaxel gehören zu einer Gruppe von Mikrotubuli-Targeting-Wirkstoffen (MTAs), die häufig zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden. Die Taxanresistenz in Krebszellen reduziert jedoch die Wirksamkeit der Langzeitanwendung der Medikamente drastisch. Häufende Beweise deuten darauf hin, dass die Mechanismen, die der Taxanresistenz zugrunde liegen, sowohl allgemeine Mechanismen, wie die Entwicklung von Multidrug-Resistenz aufgrund der Überexpression von Wirkstoff-Efflux-Proteinen, als auch Taxan-spezifische Mechanismen, wie z. B. solche, die die Mikrotubuli-Dynamik betreffen, umfassen.

Da Taxane auf Zellmikrotubuli abzielen, ist die Messung der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli ein wichtiger Schritt zur Bestimmung der Mechanismen der Taxanresistenz und gibt Aufschluss darüber, wie diese Resistenz überwunden werden kann. Im Experiment wurde eine in vivo-Methode verwendet, um die dynamische Instabilität von Mikrotubuli zu messen. GFP-markiertes α-Tubulin wurde exprimiert und in Mikrotubuli in MCF-7-Zellen eingebaut, was die Aufzeichnung der Mikrotubuli-Dynamik im Zeitraffer mit einer empfindlichen Kamera ermöglichte. Die Ergebnisse zeigten, dass im Gegensatz zu den nicht-resistenten elterlichen MCF-7CC-Zellen die Mikrotubuli-Dynamik von Docetaxel-resistenten MCF-7TXT-Zellen unempfindlich gegenüber Docetaxel-Behandlung ist, was die Resistenz gegen Docetaxel-induzierten Mitosestillstand und Apoptose verursacht. In diesem Artikel wird diese in vivo-Methode zur Messung der dynamischen Instabilität von Mikrotubuli vorgestellt.

Einleitung

Die Haupttodesursache Brustkrebs ist durch Metastase 1, 2. Taxane wie Docetaxel und Paclitaxel, werden derzeit als First-Line - Therapien bei der Behandlung von metastasierendem Brustkrebs 2, 3, 4, 5, 6 verwendet. Sie sind Teil einer Gruppe von Mikrotubuli-Targeting-Mittel (MTAs), die die Dynamik der Mikrotubuli stören. Allerdings ist eine der größten Herausforderungen für die Taxane in kurativen Therapie ist die Entwicklung von Taxan - Resistenz von Krebszellen unter Verwendung, die 7 bis Wiederauftreten der Krankheit führt. Arzneimittelresistenz ist für mehr als 90% aller Todesfälle bei Patienten mit metastasiertem Brustkrebs , 7.

Mikrotubuli sind durch die Polymerisation von α- und β-Tubulin-Heterodimeren gebildetclass = "xref"> 8, 9. Die genaue Regelung der Dynamik der Mikrotubuli ist wichtig für viele zelluläre Funktionen, einschließlich der Zellpolarisation, Zellzyklus, den intrazellulären Transport und Zellsignalisierung. Dysregulation von Mikrotubuli und deren Dynamik werden die Zellfunktion stören und führen in den Zelltod 10, 11. Je nachdem , wie sie diese Dysregulation verursachen kann MTA Medikamente entweder als Mikrotubuli stabilisierende Mittel eingestuft werden (dh Taxane) oder Mikrotubuli-destabalizing Mittel (dh, Vinca - Alkaloiden oder Colchicin-Bindungsstelle Mittel) 20. Trotz ihrer gegenläufigen Effekte auf Mikrotubuli Masse, bei einer ausreichenden Dosierung, beide Klassen können 21 Krebszellen durch ihre Auswirkungen auf die Dynamik der Mikrotubuli töten.

Taxane funktionieren in erster Linie durch die Mikrotubuli Spindel 12 zu stabilisieren, was zuchromosomale Fehlausrichtung. Die anschließende unaufhörlichen Aktivierung der Spindelanordnung checkpoint (SAC) hemmt die Zelle in die Mitose. Längerer mitotischen Arrest bewirkt dann , dass die Apoptose 13, 14. Taxan interagiert mit Mikrotubuli durch die Taxan - Bindungsstelle auf β-Tubulin - 8, 15, die im zusammengebauten Tubulin 16 nur vorhanden ist.

Mehrere Mechanismen für Taxan Widerstand haben 9 vorgeschlagen, 17. Diese Mechanismen umfassen sowohl allgemeine Multidrug - Resistenz durch die Überexpression von arzneimittel Efflux Proteine und Taxan-spezifischen Widerstand 5, 9, 18, 19. Beispielsweise Taxan-resistenten Krebszellen Expression und Funktion bestimmter β-Tub möglicherweise verändertulin Isotypen 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Durch die Verwendung eines in vivo - Verfahren Mikrotubuli dynamische Instabilität zu messen, zeigen wir , dass, wenn im Vergleich zu nicht-resistenten, elterliche MCF-7 - Zellen CC 17 die Mikrotubuli - Dynamik von Docetaxel-resistenten MCF-7 - Zellen zu TXT Docetaxel Behandlung unempfindlich sind.

Zum besseren Verständnis der Funktion von MTAs und der genaue Mechanismus der Taxan-Resistenz in Krebszellen zu verstehen, ist es wichtig, die Dynamik der Mikrotubuli zu messen. Hier berichten wir über eine in vivo - Methode, dies zu tun. Durch die Verwendung von Echtzeit- Bildgebung in Kombination mit der Expression von GFP-markierten Tubulin in Zellen, können wir die Dynamik der Mikrotubuli von MCF-7 TXT und MCF-7 CC - Zellen mit und wi messenthout Behandlung mit Docetaxel. Die Ergebnisse können uns wirksamer Medikamente helfen entwerfen, die Taxan Widerstand überwinden kann.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen für Live-Imaging

  1. Zellkultur und Seeding
    1. Verwenden MCF-7 Brustkrebszellen , ausgewählt für die Resistenz gegen Docetaxel (MCF-7 TXT) und deren nicht-resistenten parentalen Zelllinie (MCF-7 CC). Die detaillierten Auswahlprozess und die Charakterisierung dieser ausgewählten Zelllinien wurden zuvor 24 beschrieben.
    2. Wachsen alle Zellen in 10 cm-Kulturschalen bei 37 ° C in einem Medium, 90% Dulbecco besteht modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und 10% fötales Rinderserum (FBS) und supplementiert mit nicht-essentiellen Aminosäuren. Pflegen Sie das Medium in einer 5% igen CO 2 -Atmosphäre. Pflegen MCF-7 TXT Zellen bei 5 nM Docetaxel.
    3. Seed-Zellen auf Deckgläser für die Live-Darstellung. Sterilisieren 24 mm poly-L-Lysin beschichteten Glasplättchen, indem sie mit 70% -igem Alkohol gespült und dann über Nacht sie UV ausgesetzt wird. Legen Sie die Deckgläser in einer 6-Well-Kulturplatte von 35 mm. Place ein Deckglas in jeder Vertiefung.
    4. Entfernen Sie das Medium aus dem 10-cm-Kulturschale und waschen Sie die Zellen mit PBS. Mit 0,5 ml Trypsin-EDTA in die Schale um die Zellen von der Schale zu lösen. 5 ml Kulturmedium in die Schale um das Trypsin nach der Ablösung der Zellen zu neutralisieren.
    5. Zähle die Zellen mit einem Hämozytometer die Anzahl der Zellen pro Volumeneinheit zu ermitteln.
    6. In etwa 10 5 Zellen in jede Vertiefung auf der Basis der Zellzahl pro Volumeneinheit. sanft, legte die Platte wieder in den Inkubator Nach Schütteln, damit die Zellen an den Deckgläsern zu befestigen.
  2. Expression von GFP-markierten α-Tubulin
    1. Zu testen Dynamik der Mikrotubuli, Transduktion der Zellen mit GFP-markierten α-Tubulin mit dem handelsüblichen GFP Transduktion Steuerung (zB BacMam) nach dem Protokoll des Herstellers.
    2. Kultur der Zellen in der Vertiefung für 36 h in einem 37 ° C Zellkulturinkubator com zu ermöglichenplete Adhäsion und 60% Konfluenz.
    3. Berechne den geeigneten Volumen GFP-markierten α-Tubulin zu jeder Vertiefung hinzugefügt, entsprechend der folgenden Gleichung:
      figure-protocol-1
      Die Anzahl der Zellen ist, die geschätzte Gesamtzahl der Zellen in der Vertiefung zum Zeitpunkt der Markierung und der gewünschten PPC ist die Anzahl der Partikel pro Zelle.
      HINWEIS: Die MCF-7 - Zellen Seeding sollte die Zellzahl 10 5 bis 2 x 10 5 mit einem gewünschten PPC 20 verdoppelt haben, das Volumen für jede Deck benötigt daher 40 & mgr; l. Für verschiedene Zellen, berechnet das Volumen auf der obigen Formel basiert möglicherweise nicht die beste sein. Das genaue Volumen sollte entsprechend der tatsächlichen Expression von GFP-Tubulin eingestellt werden.
    4. Mische die GFP-markierten α-Tubulin mehrfach durch Umdrehen um eine homogene Lösung zu gewährleisten. Nicht mit dem Vortex.
      HINWEIS: Für die Steuerung, die Null (Kontrolle) Reagens fehlt jede Säugetier genetischeElemente und können potentielle Baculovirus-vermittelte Effekte und Hintergrundfluoreszenz verwendet werden, bestimmen zu helfen. Eine nicht gezielt GFP Transduktion Kontrolle kann auch verwendet werden, die die gesamte Zelle leuchtet.
    5. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit frischem Medium. 2 mL des neuen Mediums und 40 ul GFP-markierten α-Tubulin zu jeder Vertiefung.
    6. Schütteln Sie die Platte vorsichtig vollständige Durchmischung von GFP-markierten α-Tubulin mit dem Kulturmedium zu ermöglichen. Bringen Sie die Platte mit dem Kultur-Inkubator und Inkubation für 24 h, um die Expression von GFP-Tubulin zu ermöglichen.
  3. Treat Zellen mit Docetaxel
    Hinweis: Dieses Experiment wird die Wirkung von Docetaxel auf Mikrotubuli dynamische Instabilität zu testen. Somit werden die Zellen mit der gewünschten Konzentration von Docetaxel behandelt.
    1. Bereiten Sie ein Medium, 90% DMEM und zu 10% der FBS und ergänzt mit nicht-essentiellen Aminosäuren. Verwenden Sie DMEM ohne Phenol rot, weil Phenolrot mit dem fluorescen störence von GFP-Tubulin. Fügen Sie die gewünschte Konzentration von Docetaxel (im Bereich von 10 nm bis 10 & mgr; M). Die Stammlösung von Docetaxel ist 10 mM in Dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. Vorwärmen der Docetaxel enthaltende Medium auf 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator.
    3. Ersetzen Sie die normalen Kulturmedium mit der Docetaxel-haltigen Medium und Inkubation für 30 min in der Gewebekultur-Inkubator. Es sollte für jeden Docetaxel-Konzentration mindestens 3 Deck pro Vertiefung sein.

2. Live-Imaging zu untersuchen Mikrotubuli dynamische Instabilität

  1. Einrichten des Systems
    1. Führen Experimente in einer Kammer bei 37 ° C und 5% CO 2 gehalten. Erwerben Fluoreszenzbilder von Zeitablauf mit einem mikroskopischen System mit einem 60X versehen, 1,42 NA Öl Objektivlinse auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop und mit einer CCD-Kamera.
    2. Legen Sie die Zellen für Livebild. Vorwärmen sowohl der Probenhalter unddas Medium auf 37 ° C. Wählen Sie ein Deckglas zu untersuchen. Montieren Sie das Deckglas von Interesse auf einem Probenhalter und Inkubation mit 1 ml der Docetaxel-haltigen Medium hergestellt in Schritt 1.3.1.
  2. Live - Bildgebung von Mikrotubuli dynamische Instabilität
    1. Identifizieren Sie die Zellen, die für die Bildgebung verwendet wird. Sie sollten flach sein, haben eine hohe Fluoreszenzintensität ausgedrückt GFP-Tubulin und haben klare Mikrotubuli-Strukturen.
    2. Wählen einer Zelle aus der Gruppe der identifizierten Zellen aus Schritt 2.2.1 zunächst zu untersuchen. Konzentrieren sich auf den Randbereich der identifizierten Zelle. Stellen Sie das Programm für die Belichtungszeit und die Häufigkeit der Bildaufnahme auf. Als Belichtungszeit gewöhnlich 0,5 s ist, werden die Bilder alle zwei s erfasst werden.
    3. Lassen Sie eine zusätzliche 20 Minuten für die Schritte von 1,33 bis 2.2.3. Somit genau 50 min nach der Zugabe von Docetaxel, wie in Schritt 1.3.3 beschrieben, beginnen imaging (dies für Normung).
    4. Notieren Sie sich die Mikrotubuli-dynamics für 2 Minuten, die ein Foto alle 2 s. Insgesamt erwerben 60 Bilder für die identifizierte Zelle.
    5. Gehen Sie zum nächsten identifizierten Zelle und wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 bis 2.2.4. Wiederholen Sie den Vorgang, bis 5 Zellen abgebildet wurden. Es ist zwingend notwendig, dies zu tun, bevor die Zeit 70 min nach der Zugabe von Docetaxel erreicht, wie es in Schritt 1.3.3 beschrieben.
    6. Für jede Behandlungsbedingung, wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 für 3 verschiedene Deck bis 2.2.5. Insgesamt Bild 15 Zellen, die genug Daten Mikrotubuli dynamische Instabilität zu messen.

3. Bildverarbeitung und Datenanalyse

  1. Deconvolution der Bilder
    1. Entfalten die aufgenommenen Bilder eine hohe Qualität zu erreichen. Öffnen Sie das Entfaltungsprogramm mit dem Mikroskopsystem ausgestattet.
    2. Klicken Sie auf "Bearbeiten" und wählen Sie "entfalten." Ziehen Sie die Datei in den "Input" Fenster und klicken Sie auf "Do" Die Bilddatei wird entfalteten und dieentfalteten Datei wird automatisch als neue Datei gespeichert werden.
  2. Die Erzeugung von Videos
    1. Klicken Sie auf die entfalteten Bilddatei mit ausgestatteter Software zu öffnen.
    2. Klicken Sie auf "Datei" und wählen Sie "als Film speichern". Wählen Sie den "Filmformat" als "AV" und "Animation-Stil" als "Forward". Stellen Sie die "Komprimierungsqualität" auf "100%" und der "Frame Rate" bis "5 / Sekunde."
    3. Überprüfen Sie die Schachtel "Animieren durch die Zeit" und klicken Sie auf "Do it." Das Video wird erzeugt werden.
  3. Die Messung der Mikrotubuli - Verkürzung und Wachstumsrate
    1. Identifizieren Sie die Mikrotubuli, die für die Messung verwendet wird. Für jede Zelle wird nur wenige Mikrotubuli Lage sein, ihre Verkürzung oder Wachstum haben klar und vollständig folgt.
    2. Untersuchen jeden Frame des Videos den Rahmen zu identifizieren, die die Ausgangslänge des Mikrotubuli a zeigtnd der Rahmen mit den meisten verlängert oder verkürzt Mikrotubuli. Messen der Änderung in der Länge zwischen den beiden Mikrotubuli und dem zwischen den beiden Rahmen verstrichene Zeit.
    3. Berechnen Sie die Geschwindigkeit des Wachstums oder der Verkürzung durch die Längenänderung durch Zeitteilung (die Einheit & mgr; m / s). Für jede Behandlungsbedingung, folgen mindestens 10 Zellen und mindestens 20 Mikrotubuli messen.
    4. Berechnen Sie den Mittelwert und der Standardfehler für jede Behandlungsbedingung. Analysieren Sie den statistischen Unterschied zwischen den Bedingungen des Student-Test. Melden Sie die Daten in einer Tabelle und / oder in einem Diagramm.

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Ergebnisse

Mit dem Protokoll hier vorgestellten, untersuchten wir die Wirkung von Docetaxel auf die Mikrotubuli - Dynamik der normalen (MCF-7 CC) und Docetaxel-resistenten (MCF-7 TXT) Brustkrebszellen. Zwei Sätze von Aufnahmen zeigen die Wirkung von Docetaxel (0,5 uM) auf Mikrotubuli Wachstum und Verkürzung in MCF-7 CC und MCF-7 - TXT - Zellen (1A).

Wir auch die Geschwindigkeit...

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Diskussion

Es gibt zwei Hauptmethoden Mikrotubuli dynamische Instabilität zu messen: in vitro und in vivo. In dem in vitro - Verfahren wird gereinigtes Tubulin verwendet Mikrotubuli dynamische Instabilität mit Computer-enhanced Zeitrafferdifferentialinterferenzkontrastmikroskopie zu messen. In dem in vivo - Verfahren, mikroinjiziert Fluoreszenz Tubulin oder Tubulin-GFP exprimiert, in Mikrotubuli eingebaut. Die Dynamik (Wachstum und Verkürzung) der Mikrotubuli wird dann durch Zeitraffer unter Ver...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Forschung wird mit Mitteln von CBCF (an ZW) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Nicht-essentielle AminosäurenLife Technologies, Invitrogen11140-050
FBSGibco, Invitrogen12483
Anti-Anti (100x)Life Technologies, Invitrogen15240-062
DocetaxelSigma-Aldrich01885-5mg-F
DMEM phenolrotfreiGibco, Invitrogen21063
CellLight Reagenz *BacMam 2.0* GFP-TubulinThermoFisher ScientificC10613Schlüsselreagenz für die Expression von GFP-Tubulin in Zellen
CellLight Reagenz *BacMam 2.0* GFPThermoFisher ScientificB10383Kontrolle
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-Aldrich+B9:AA9472301zum Auflösen von Decetaxel
22-mm-Glas coveslipFisher Scientifics12-545-101
6-Well-KulturplatteGreiner Bio-One International6-Well-Celi-Kulturplatte
DeltaVision Mikroskopie BildgebungssystemeGE HealthDieses System ist mit einer Wetterstation zur Kontrolle von Temperatur und CO2 ausgestattet. Es ist auch mit Worx Software für die Entfaltungs- und Zeitraffersteuerung ausgestattet.
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotThermoFisher Scientific25200056
Bright-Line Hämazytometer-Set, Hausser ScientificHausser Scientific, vertrieben von VWRLieferanten-Nr.: 1492 VWR Nr.: 15170-172

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