Gründung der proliferativen Tetraploid Zellen aus nicht-transformierten menschlichen Fibroblasten

Zusammenfassung

Obwohl proliferative polyploide Zellen notwendig sind, um die chromosomale Instabilität polyploider Zellen zu analysieren, ist es nicht einfach, solche Zellen aus nicht transformierten menschlichen Zellen zu erzeugen. Der vorliegende Bericht beschreibt relativ einfache Verfahren zur Etablierung proliferativer tetraploider Zellen, die frei von einer diploiden Population aus normalen humanen Fibroblasten sind.

Zusammenfassung

Polyploide (meist tetraploide) Zellen werden häufig in präneoplastischen Läsionen menschlicher Gewebe beobachtet und ihre chromosomale Instabilität wurde als verantwortlich für die Karzinogenese in solchen Geweben angesehen. Obwohl proliferative polyploide Zellen für die Analyse der chromosomalen Instabilität polyploider Zellen erforderlich sind, ist die Erzeugung solcher Zellen aus nicht transformierten menschlichen Zellen eine ziemliche Herausforderung. Die Induktion der Tetraploidie durch chemische Wirkstoffe führt in der Regel zu einer Mischung aus diploiden und tetraploiden Populationen, und die meisten Studien verwendeten fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder Klonierung durch Begrenzung der Verdünnung, um tetraploide von diploiden Zellen zu trennen. Diese Verfahren sind jedoch zeitaufwendig und mühsam. Der vorliegende Bericht beschreibt ein relativ einfaches Protokoll zur Induktion proliferativer tetraploider Zellen aus normalen humanen Fibroblasten mit minimaler Kontamination durch diploide Zellen. Kurz gesagt, das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: Stillstand der Zellen in der Mitose durch Demecolcin (DC), Sammeln von mitotischen Zellen nach dem Abschütteln, Inkubieren der gesammelten Zellen mit DC für weitere 3 Tage und Inkubieren von Zellen in medikamentenfreiem Medium (Sie nehmen die Proliferation als tetraploide Zellen innerhalb weniger Tage wieder auf). Je nach Zelltyp kann die Entnahme von mitotischen Zellen durch Abschütteln entfallen. Dieses Protokoll bietet eine einfache und praktikable Methode zur Etablierung proliferativer tetraploider Zellen aus normalen menschlichen Fibroblasten. Tetraploide Zellen, die mit dieser Methode hergestellt werden, könnten ein nützliches Modell für die Untersuchung der Chromosomeninstabilität und des onkogenen Potenzials polyploider menschlicher Zellen sein.

Einleitung

Polyploidie wurde in spezialisierten Geweben von Säugetieren nicht nur beobachtet, sondern auch in einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, wie Krebs und degenerativen Erkrankungen. Polyploiden (meist tetraploid) Zellen werden oft in präneoplastischen Läsionen des menschlichen Geweben beobachtet, wie Barrett-Ösophagus ^1,2 oder Plattenepithelkarzinom intraepitheliale Läsionen des Gebärmutterhalses ^3,4, und wurden als die Quelle für maligne aneuploid Zellen in diesen Geweben auf ^{5 , 6.} Obwohl vorgeschlagen wird, dass zur Aneuploidzellen Umwandlung von tetraploiden ein entscheidendes Ereignis in den frühen Stadien der Tumorgenese sei....

Protokoll

1. Zellkultur

1. Besorgen Sie sich die Zellen Tetraploidie zu induzieren. Bis heute bestätigt worden, daß diese Technik auf die menschliche Fibroblasten-Zelllinien-TIG 1 angewendet werden kann, BJ, IMR-90 und Telomerase immortalisiert TIG-1 (TIG-HT).
2. Wachsen Zellen in minimalem essentiellem Medium mit α Änderung oder jede andere Zellkulturmedium für den Zelltyp geeignet, um mit 10% (v / v) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, untersucht werden, indem in einem 5% (v Inkubieren / v) CO ₂ -Atmosphäre bei 37 ° C. Passage-Zellen alle 3 oder 4 Tage nicht subkonfluenten Dichte zu überschreiten.
   HINWEIS: Verdopplung der Po....

Ergebnisse

In unserer Erfahrung können TIG-1 - Zellen für 4 Tage (2A) fast vollständig tetraploid durch einfache kontinuierliche Behandlung mit 0,1 & mgr; g / mL DC erfolgen. Im Gegensatz dazu sind andere Fibroblasten-Stämme, wie BJ oder IMR-90 und TIG-HT-Zellen, wurde ein Gemisch aus diploid und tetraploid Populationen nach der gleichen Behandlung, und zur Isolierung von mitotischen Zellen von der shake-off-Verfahren ist notwendig, während des Verlaufs Gleichbehandlung ( in de.......

Diskussion

Ein Hauptproblem bei der Induktion von Tetraploidie von diploiden Zellen, die durch chemische Mittel, entweder durch Zytokinese Inhibitoren oder durch Spindelinhibitoren, ist, dass die Zellen häufig eine Mischung aus diploide und tetraploide Populationen werden und tetraploiden Zellen müssen von diploiden Zellen getrennt werden. Die häufigsten Ansätze zur Isolierung einer tetraploiden Bevölkerung verwenden frei von diploiden Zellen FACS oder Klonierung durch limitierende Verdünnung. Jedoch sind diese Verfahren mühsam un.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MEM-α	Sigma-Aldrich	M8042-500ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
FBS	Sigma-Aldrich	172012-500ML
Demecolcin-Lösung (10 μ g/mL in HBSS)	Sigma-Aldrich	D1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA-Reagenzien-Kits	BD Biosciences	#340242	Zur Untersuchung der DNA-Ploidie mittels Durchflusszytometrie
Mehrfarbige FISH-Sonde des menschlichen Chromosoms 24XCyte	MetaSystems	#D-0125-060-DI	Spezielles Filterset und Software für die mFISH-Analyse sind erforderlich
Isis-Bildgebungssystem mit mFISH  Software	MetaSystems		Specialized Sondenkit ist erforderlich