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Gründung der proliferativen Tetraploid Zellen aus nicht-transformierten menschlichen Fibroblasten

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DOI:

10.3791/55028

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8. Januar 2017

 , 
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Obwohl proliferative polyploide Zellen notwendig sind, um die chromosomale Instabilität polyploider Zellen zu analysieren, ist es nicht einfach, solche Zellen aus nicht transformierten menschlichen Zellen zu erzeugen. Der vorliegende Bericht beschreibt relativ einfache Verfahren zur Etablierung proliferativer tetraploider Zellen, die frei von einer diploiden Population aus normalen humanen Fibroblasten sind.

Zusammenfassung

Polyploide (meist tetraploide) Zellen werden häufig in präneoplastischen Läsionen menschlicher Gewebe beobachtet und ihre chromosomale Instabilität wurde als verantwortlich für die Karzinogenese in solchen Geweben angesehen. Obwohl proliferative polyploide Zellen für die Analyse der chromosomalen Instabilität polyploider Zellen erforderlich sind, ist die Erzeugung solcher Zellen aus nicht transformierten menschlichen Zellen eine ziemliche Herausforderung. Die Induktion der Tetraploidie durch chemische Wirkstoffe führt in der Regel zu einer Mischung aus diploiden und tetraploiden Populationen, und die meisten Studien verwendeten fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder Klonierung durch Begrenzung der Verdünnung, um tetraploide von diploiden Zellen zu trennen. Diese Verfahren sind jedoch zeitaufwendig und mühsam. Der vorliegende Bericht beschreibt ein relativ einfaches Protokoll zur Induktion proliferativer tetraploider Zellen aus normalen humanen Fibroblasten mit minimaler Kontamination durch diploide Zellen. Kurz gesagt, das Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: Stillstand der Zellen in der Mitose durch Demecolcin (DC), Sammeln von mitotischen Zellen nach dem Abschütteln, Inkubieren der gesammelten Zellen mit DC für weitere 3 Tage und Inkubieren von Zellen in medikamentenfreiem Medium (Sie nehmen die Proliferation als tetraploide Zellen innerhalb weniger Tage wieder auf). Je nach Zelltyp kann die Entnahme von mitotischen Zellen durch Abschütteln entfallen. Dieses Protokoll bietet eine einfache und praktikable Methode zur Etablierung proliferativer tetraploider Zellen aus normalen menschlichen Fibroblasten. Tetraploide Zellen, die mit dieser Methode hergestellt werden, könnten ein nützliches Modell für die Untersuchung der Chromosomeninstabilität und des onkogenen Potenzials polyploider menschlicher Zellen sein.

Einleitung

Polyploidie wurde in spezialisierten Geweben von Säugetieren nicht nur beobachtet, sondern auch in einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, wie Krebs und degenerativen Erkrankungen. Polyploiden (meist tetraploid) Zellen werden oft in präneoplastischen Läsionen des menschlichen Geweben beobachtet, wie Barrett-Ösophagus 1,2 oder Plattenepithelkarzinom intraepitheliale Läsionen des Gebärmutterhalses 3,4, und wurden als die Quelle für maligne aneuploid Zellen in diesen Geweben auf 5 , 6. Obwohl vorgeschlagen wird, dass zur Aneuploidzellen Umwandlung von tetraploiden ein entscheidendes Ereignis in den frühen Stadien der Tumorgenese sein könnte, die an diesem Prozess beteiligten Mechanismen sind nicht vollständig verstanden. Dies ist zum Teil , weil keine in - vitro - Modell verfügbar ist , wo nicht - transformierten polyploid menschlichen Zellen ausbreiten kann.

Einige Forscher haben induzierte Tetraploidie in nicht-transformierten menschlichen Epithelzellen durch Erzeugung von zweikerniger Zellen durch Einwibiting cytokinesis 7-9. In diesem Verfahren muß jedoch unnötige diploiden Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) eliminiert werden 7,8 oder Klonierung durch limitierende Verdünnung 9. Da diese Verfahren mühsam und nicht leicht durchzuführen sind, einfacherer Methoden nicht transformierten tetraploiden Zellen zu etablieren sind für die Forschung auf diesem Gebiet erwünscht.

Im vorliegenden Bericht beschreiben wir ein Protokoll proliferative tetraploiden Zellen von normalen humanen Fibroblasten oder Telomerase-immortalisierten humanen Fibroblasten durch relativ einfache Verfahren zu etablieren. Die Verfahren verwenden Spindelgift Demecolcin (DC) diploiden Zellen in der Mitose und mitotischen Zellen durch Abschütteln gesammelt zu verhaften werden weiter mit DC behandelt. Diploide mitotischen mit DC behandelten Zellen für eine längere Zeit zu tetraploiden G1 Zellen umwandeln, und diese Zellen vermehren als tetraploiden Zellen nach Wachstumsstopp für mehrere Tage nach der Arzneimittelentfernung. Dieses Protokoll siehtein effizientes Verfahren ein nützliches Modell für die Erstellung der Beziehung zwischen Chromosom Instabilität und dem onkogenen Potential der polyploiden menschlichen Zellen zu untersuchen.

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Protokoll

1. Zellkultur

  1. Besorgen Sie sich die Zellen Tetraploidie zu induzieren. Bis heute bestätigt worden, daß diese Technik auf die menschliche Fibroblasten-Zelllinien-TIG 1 angewendet werden kann, BJ, IMR-90 und Telomerase immortalisiert TIG-1 (TIG-HT).
  2. Wachsen Zellen in minimalem essentiellem Medium mit α Änderung oder jede andere Zellkulturmedium für den Zelltyp geeignet, um mit 10% (v / v) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, untersucht werden, indem in einem 5% (v Inkubieren / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C. Passage-Zellen alle 3 oder 4 Tage nicht subkonfluenten Dichte zu überschreiten.
    HINWEIS: Verdopplung der Population Ebene (PDL) sollte jedes Mal bei Passagierung berechnet werden, um Zellwachstum und die Zell Alter zu bewerten. PDL kann bei der nächsten Passagierung (N2) mit der folgenden Formel (X ist die anfängliche PDL) geerntet aus der Zellzahl ausgesät in eine Schale (N1) und der Zellzahl berechnet werden. PDL = X + (N1 log - log N2) / log 2

2. Induktion und Estaaufbau von Tetraploid Zellen aus diploiden Fibroblasten

  1. Induce Tetraploidie ohne shake-off.
    ANMERKUNG: Manche Zellstämme (zB TIG-1) nahezu vollständig tetraploid durch kontinuierliche Behandlung wird mit Demecolcin (DC) folgendermaßen.
    1. Passage-Zellen in eine oder zwei 100 mm-Schalen am Tag vor der Behandlung Tetraploidie zu induzieren. Normalerweise bereiten 5 x 10 5 bis 1 x 10 6 Zellen pro Schale für die Induktion von tetraploiden Zellen.
    2. Behandeln Sie exponentiell wachsenden Zellen mit Medium, das 0,1 ug / ml DC für 4 Tage.
    3. Ersetzen DC-haltigem Medium mit arzneimittelfreiem Medium und Inkubation Zellen in einem 5% (v / v) CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C. Die Zellen wieder aufnehmen in der Regel Proliferation innerhalb 1 Woche.
  2. Induce Tetraploidie mit Shake-off.
    HINWEIS: Die meisten Zellen werden eine Mischung aus diploid und tetraploid Populationen als Ergebnis der einfachen Behandlung mit DC oben beschrieben (2.1). Daher einige Modifikationen des pERFAHREN zu eliminieren eine diploide Population notwendig sind wie folgt (1).
    1. Passage-Zellen in mehrere T75-Flaschen am Tag vor der Behandlung Tetraploidie zu induzieren. Üblicherweise Vorbereitung mindestens 5 x 10 6 Zellen (1 x 10 6 Zellen pro Kolben) für die Induktion von tetraploiden Zellen.
    2. Behandeln Sie exponentiell wachsenden Zellen mit Medium, das 0,1 ug / ml DC 16 - 18 Uhr Zellen in der Mitose zu verhaften. Die Zeit, die Zellen in der Mitose zu verhaften können auf Zielzellen abhängen und sollte durch Vorversuche ermittelt werden, wie viele mitotische Zellen wie möglich zu erhalten. Zum Beispiel langsamer sollte wachsende Zellen mit DC werden für längere Zeit behandelt als schneller wachsende Zellen.
      HINWEIS: Wenn Zellen in diesem Schritt zu lange behandelt werden, könnten sie mitotischen Schlupf zu unterziehen und mit der Geschirroberfläche anhaften, wodurch es unmöglich mitotischen Zellen durch shake-off in der nächsten Stufe zu sammeln.
    3. Sammeln Sie DC-verhaftete mitotischen Zellen durch die shake-off-Verfahren, in which lose anhaftenden mitotischen Zellen werden durch vorsichtiges Schütteln der Flaschen und Waschen mit Medium durch Zentrifugation (300 xg, 5 min) gesammelt, gefolgt. Zählen der Zellzahl durch ein geeignetes Verfahren in diesem Schritt.
    4. Reseed gesammelt mitotischen Zellen in 60 mm Kulturschalen und Behandlung von Zellen mit 0,1 ug / ml DC für weitere 3 Tage. Samen mehr als 1 x 10 6 mitotischen Zellen pro Schale, da weniger als 10% der Zellen können diese Behandlung überleben.
    5. Ersetzen Sie DC-haltiges Medium mit drogenfreien Medium und warten Zellen-Proliferation fortzusetzen, die in der Regel innerhalb von 1 Woche auftritt.
  3. Passage-Zellen ähnlich ursprünglichen diploiden Zellen.

3. Prüfung der DNA-Ploidie

Hinweis: Dies ist ein gut etabliertes Verfahren und ein technisches Handbuch sollte für detaillierte Verfahren und technische Tipps bezeichnet werden.

  1. Ernte Zellen (5 x 5 bis 01 Oktober x 10 6) durch Inkubieren von Zellen mit einer Lösung conenthaltenden 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA bei 37 ° C für 10 min, und zu neutralisieren Trypsin durch Medium mit 10% FBS.
  2. Zentrifugen Zellen in Medium und sie zu waschen, indem in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), gefolgt von Zentrifugation (300 xg, 5 min) Resuspendieren.
  3. Bereiten Zellen für die DNA-Analyse durch eine der folgenden beiden Methoden
    1. Verfahren zum Analysieren von unfixierten Zellen 10
      Hinweis: Dieses Verfahren kann unter Verwendung eines handelsüblichen Kits für die Zellzyklus-Analyse durchgeführt werden. Die Proben mit diesem Verfahren hergestellten sollten sofort untersucht werden, da die Zellen in dem Verfahren nicht fixiert sind und gefärbten Kerne werden im Laufe der Zeit beschädigt werden.
      1. Wasche die Zellen mit 40 mM Citrat-Puffer, enthaltend 250 mM Saccharose. Anschließend behandeln Zellen mit 250 & mgr; l von 0,1% (v / v) Nonidet P40 und 30 ug / ml Trypsin in 200 & mgr; l von 40 mM Citrat-Puffer, enthaltend 250 mM Sucrose für 10 min bei Raumtemperatur.
      2. In 200 ul 0,5 ug / ml Trypsin Einwibitor und 0,1 ug / ml RNase A in 40 mM Citrat-Puffer, enthaltend 250 mM Saccharose, und Inkubieren Zellen für 10 min bei Raumtemperatur.
      3. Mit 200 & mgr; l von 0,4 mg / ml Propidiumiodid (PI) in 40 mM Citrat-Puffer, enthaltend 250 mM Saccharose, und Inkubieren Zellen für 10 min bei Raumtemperatur Zellkerne anzufärben.
    2. Verfahren zur Analyse von fixierten Zellen
      1. Fix-Zellen mit 80% Ethanol durch Zellen in 1 ml PBS, Zugabe von 4 ml 100% EtOH tropfenweise unter Mischen der Zellsuspension und lassen es bei Raumtemperatur für 30 min suspendiert. Zellen in dieser Fixiermittel kann bei -20 ° C für mehrere Wochen gelagert werden.
      2. Wash-Zellen, indem sie in 5 ml PBS resuspendiert, gefolgt von Zentrifugation (300 · g, 5 min). Behandlung von Zellen, die mit 0,5 mg / ml RNase A und färben sie mit 50 ug / ml Propidiumjodid (PI) (475 & mgr; l von 0,5 mg / ml RNase A und 25 ul 1 mg / ml PI) für 30 min bei Raumtemperatur.
  4. Analyse des DNA-Gehalts von ter Zellen, die ein Durchflusszytometer mit einem 488-nm-Laser und roten Kanal Emissionsfilter (long pass> 610 nm). Analysieren einer Referenzprobe, die aus echten diploiden Zellen zugleich Ploidie der Zielzellen abzuschätzen.
    1. Alternativ Fluoreszenzstandard Perlen fügen Sie die Fluoreszenzintensität Verhältnis von diploiden Zellen im Vergleich zu den Perlen zu bewerten. Verwenden Sie die "Impulshöhe vs. Impulsbreite 'Option des Durchflusszytometer zwischen einzelnen tetraploiden Zellen und Klumpen von diploiden Zellen 11 zu unterscheiden.

4. Prüfung der Chromosome Grafen und Karyotypanalyse

HINWEIS: Diese sind alle gut etablierte Verfahren und ein technisches Handbuch oder den Protokollen des Herstellers sollten für detaillierte Verfahren und technische Tipps bezeichnet werden.

  1. Behandeln Sie exponentiell wachsenden Zellen mit 0,1 ug / ml DC 4 h Zellen in Metaphase zu halten.
  2. Bereiten Sie Chromosom Dias.
    1. Ernte Zellen (mindestens 5 x 10 5 Zellen) durch Trypsinisierung und suspendieren in Medium FBS enthält.
    2. Zentrifugenzellen in Medium (300 × g, 5 min) und behandle mit hypotonischer Lösung (5 ml 0,075 M KCl) bei 37 ° C für 10 min.
    3. Fix und suspendieren Zellen in Carnoy-Fixiermittel (Methanol: Essigsäure = 3: 1).
    4. Breiteten Zellen auf einen Glasträger durch ein kleines Volumen Tropft (25 - 35 & mgr; l) der Zellsuspension. Zusätzliche Schritte, wie beispielsweise Einwirkung von heißem Dampf erforderlich sein Chromosom zu verbessern verbreiten.
  3. Stain - Zellen für die Chromosomenzahl oder Karyotypanalyse oder mehrfarbige Fluoreszenz - in - situ - Hybridisierung (MFISH).
    1. Chromosome zählt.
      1. Stain Zellen mit 5% Giemsa-Lösung (oder 5 & mgr; g / ml PI, enthaltend 0,5 mg / ml RNase A für Fluoreszenzmikroskopie) für 15 - 20 min.
      2. Digital fotografieren mindestens 50 Metaphase-Zellen.
      3. Graf Chromosomenzahl pro Zelle, die eine Bildanalyse softwa mitre nach einer manuellen Trennung von berühren und überlappende Chromosomen mit einer Bildbearbeitungssoftware. Obwohl kann Chromosomenzahl manuell bewertet werden, ist EDV-Scoring empfohlen.
    2. Karyotypanalyse
      HINWEIS: Diese Analyse sollte von einem Fachmann oder einer professionellen Firma durchgeführt werden.
      1. Stain Zellen nach einem Standard G-Banding - Technik 12.
      2. Analysieren Chromosomen Standard Karyogramme 12 machen.
    3. MFISH
      Hinweis: Dieser Schritt ist optional und sollte bei Bedarf durchgeführt werden.
      1. Stain Zellen unter Verwendung von Mehrfarben - FISH - Sonden für menschliche Chromosomen gemäß dem Herstellerprotokoll 13.
      2. Analysieren Chromosomen eines Fluoreszenzmikroskops mit geeigneten Filtern und eine Software zur MFISH Analyse 13.

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Ergebnisse

In unserer Erfahrung können TIG-1 - Zellen für 4 Tage (2A) fast vollständig tetraploid durch einfache kontinuierliche Behandlung mit 0,1 & mgr; g / mL DC erfolgen. Im Gegensatz dazu sind andere Fibroblasten-Stämme, wie BJ oder IMR-90 und TIG-HT-Zellen, wurde ein Gemisch aus diploid und tetraploid Populationen nach der gleichen Behandlung, und zur Isolierung von mitotischen Zellen von der shake-off-Verfahren ist notwendig, während des Verlaufs Gleichbehandlung ( in de...

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Diskussion

Ein Hauptproblem bei der Induktion von Tetraploidie von diploiden Zellen, die durch chemische Mittel, entweder durch Zytokinese Inhibitoren oder durch Spindelinhibitoren, ist, dass die Zellen häufig eine Mischung aus diploide und tetraploide Populationen werden und tetraploiden Zellen müssen von diploiden Zellen getrennt werden. Die häufigsten Ansätze zur Isolierung einer tetraploiden Bevölkerung verwenden frei von diploiden Zellen FACS oder Klonierung durch limitierende Verdünnung. Jedoch sind diese Verfahren mühsam un...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interesse haben.

Danksagungen

Wir danken Frau Matsumoto für die technische Unterstützung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MEM-αSigma-AldrichM8042-500ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4174
FBSSigma-Aldrich172012-500ML
Demecolcin-Lösung (10 μ g/mL in HBSS)Sigma-AldrichD1925-10ML
BD CycleTES Plus DNA-Reagenzien-KitsBD Biosciences#340242Zur Untersuchung der DNA-Ploidie mittels Durchflusszytometrie
Mehrfarbige FISH-Sonde des menschlichen Chromosoms 24XCyteMetaSystems#D-0125-060-DISpezielles Filterset und Software für die mFISH-Analyse sind erforderlich
Isis-Bildgebungssystem mit mFISH  Software MetaSystemsSpecialized Sondenkit ist erforderlich

Referenzen

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Demecolcin BehandlungShake off Methodemitotischer Arrestdurchflusszytometrische AnalyseChromosomenz hlungDNA PloidieanalyseZellkulturprotokollKarzinogenit tsforschung

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