Dissection und Beobachtung von Honey Bee Dorsal Schiff für Untersuchungen der Herzfunktion

Zusammenfassung

Das Bauchgefäß der Honigbiene und anderer Insekten dient als funktionelles Äquivalent zum Säugetierherz und spielt eine wichtige Rolle beim Nährstofftransport, der Abfallbeseitigung, der Immunfunktion und mehr. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung und pharmakologischen Manipulation der Bienenherzfrequenz

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Zusammenfassung

Die europäische Honigbiene, Apis mellifera L., ist eine wertvolle landwirtschaftliche und kommerzielle Ressource, die für die Produktion von Honig und die Bereitstellung von Bestäubungsdiensten für Nutzpflanzen bekannt ist, sowie ein wichtiges soziales Modellinsekt zur Erforschung von Gedächtnis und Lernen, Altern und mehr. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Dissektion der dorsalen Bauchdecke einer Biene, um ihr dorsales Gefäß sichtbar zu machen, das beim Insekt die Rolle des Herzens erfüllt. Eine erfolgreiche Dissektion legt ein funktionsfähiges Herz frei, das unter den richtigen Bedingungen über einen längeren Zeitraum einen gleichmäßigen Herzschlag aufrechterhalten kann. Dies ermöglicht es dem Untersucher, die Herzfrequenz durch die Anwendung von kardiomodulatorischen Verbindungen auf das dorsale Gefäß zu manipulieren. Durch die Verwendung eines Digitalmikroskops oder eines Mikroskops, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, kann der Untersucher vor und nach der Behandlung mit Testsubstanzen Videoaufnahmen des dorsalen Gefäßes machen. Die Videos können dann zu einem für den Benutzer günstigen Zeitpunkt bewertet werden, um Änderungen der Herzfrequenz sowie Änderungen des Herzschlagmusters nach der Behandlung zu bestimmen. Die Vorteile dieses Protokolls bestehen darin, dass es relativ kostengünstig einzurichten ist, leicht zu erlernen ist, wenig Platz oder Ausrüstung benötigt und nur sehr wenig Zeit in Anspruch nimmt.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist der Prüfer zu ermöglichen, schnell und einfach zu beobachten und die Wirkung zu quantifizieren, dass ein pharmakologisches Mittel auf die Herzfrequenz von Honigbienen hat. Bees, wie andere Insekten, haben ein offenes Kreislaufsystem, die Hämolymphe der Insekten Äquivalent von Blut während der gesamten Körperhöhle, bekannt als Hämocoel verbreitet. Die Zirkulation von Hämolymphe ist essentiell für den Transport von Nährstoffen, Immunfaktoren, Abfallprodukte sowie Neurohormone und andere Signalmoleküle ^1. Kreislauf wird durch die Rückengefäß erleichtert, die entlang der dorsalen Mittellinie des Insekts erstreckt, sowie Zubehör pulsatile Organe. Das Rückengefäß gliedert sich in zwei funktionell unterschiedliche Abschnitte, die das Herz in den Bauch und die Aorta im Thorax und Kopf bezeichnet. Propagated Kontraktionen in der Herzpumpe Hämolymphe in Richtung des Thorax und Kopf, während Zubehör pulsierender Organe gewährleisten Hämolymphe Fluss zu den Extremitäten.

Insect Herzfunktion kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren beobachtet werden, abhängig von der Größe, der Physiologie oder Lebensstadium des Insekts. Ein gemeinsamer Ansatz zur Beobachtung der Herzfrequenz in Larven oder kleineren Insekten ist die Verwendung von intravital Bildgebung ^2. Diese Methode ist weniger nützlich bei erwachsenen Bienen jedoch, da es schwierig sein kann, um das Rückengefäß durch die Bauchdecke deutlich anzuzeigen. Ein etablierter Ansatz zur Erfassung der Herzfrequenz in einer Vielzahl von Insekten, einschließlich Bienen, ist die Verwendung von Kontaktthermographie, die an der Außenseite des Insekten angewendet Thermistoren verwendet , um Herz Pulsationen ^3,4 detektieren. Die Herzfrequenz bei erwachsenen Bienen hat auch eine elektrophysiologische Technik aufgezeichnet wurden mit Hilfe eines elektrischen Impedanzsignals ^4,5 zu messen. Diese Technik erfordert das Einsetzen von Elektroden in das Tier neben dem Herzen und die Verwendung eines Impedanzwandlers aufzuzeichnen Herzschläge ^4. In ähnlicher Weise wurden Elektrokardiogramme verwendet, um DETECt elektrische Signale durch das Herz erzeugt und mit Videoaufzeichnung der bee ⁶ kombiniert Veränderungen in der Herzaktivität zu beobachten. Ein klarer Vorteil dieser Ansätze ist, dass die Herzfrequenz in einer intakten, lebenden Bienen bewertet wird, anstatt in einem seziert Probe, die die Verfügbarkeit des gesamten Spektrums von physiologischen Reaktionen im Fach hilft sicherzustellen. Die Herausforderungen dieser Ansätze umfassen Buchhaltung zur Immobilisierung oder anesthetization des Subjekts, die Notwendigkeit, außerhalb Variablen und Reize zu begrenzen, die die Herzfrequenz beeinflussen könnten, sowie eine entsprechende Liefermethode bestimmen, wann pharmakologische Wirkstoffe zu testen.

Ein weiterer Ansatz, der zur Untersuchung von bee Herzaktivität verwendet wurde , ist , um teilweise das Insekt um sezieren das Herz freizulegen, dann messen dorsal Kontraktionen Gefäß eine Kraftverschiebungswandler ⁷ verwendet wird . In diesem Protokoll wird das Herz ständig mit dem Laufen physiologischer Kochsalzlösung und Test co gebadetmpounds ⁷ kann in dieser Lösung für die Anwendung auf dem Gegenstand gelöst werden. Ein signifikanter Unterschied zwischen diesem Verfahren und den zuvor beschriebenen ist , dass der Bauchmark entfernt wird, um die Rolle zu beseitigen , dass das zentrale Nervensystem in Modulieren Herzfrequenz ⁵ spielen gezeigt ist. Das Ergebnis ist , dass die Basisherzschlag, die in der Regel ziemlich erratisch ist, stabilisiert sich bei einer viel niedrigeren Frequenz und Amplitude als üblicherweise in einem lebenden Insekts ^5,7 beobachtet. Was alle diese Methoden gemeinsam haben, ist, dass sie hoch spezialisierte und oft teure Ausrüstung erfordern, zusätzlich zu einem gewissen Maß an Know-how, um durchgeführt werden. Vielleicht ist der größte Nachteil ist, dass keiner dieser Ansätze sind besonders gut geeignet, um Versuche, die eine große Anzahl von Themen beinhalten testen, beispielsweise eine Bibliothek von potentiell cardiomodulatory Screening von Verbindungen.

Die größte Stärke des hier beschriebenen Ansatzist seine Einfachheit. Das Protokoll ist relativ einfach zu meistern, das Setup benötigt wenig Platz, und nur ein minimaler finanzieller Aufwand notwendig ist. Das Verfahren erfordert wenig mehr als einige Bienen, einige chirurgische Instrumente, einer isotonischen Lösung und entweder ein digitales Mikroskop oder ein traditionelles Mikroskop mit einer Digitalkamera. Bienen werden seziert die dorsale Gefäß und digitalen Videos verwendet werden, zu visualisieren die Herzfrequenz vor und nach der Behandlung mit pharmakologischen Mitteln zu erfassen. Obwohl Videoaufzeichnung tatsächlich nicht notwendig ist , Änderungen der Herzfrequenz zu beobachten, wird es den Durchsatz stark erhöhen (dh die Anzahl der Probanden , die in einer bestimmten Zeitspanne verarbeitet werden können). Der Prüfer kann die Effizienz zu maximieren, indem sie eine große Anzahl von Videos auf einmal aufzunehmen und dann später erzielte diese Videos zu einem günstigeren Zeitpunkt. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass Videos erlauben die Ermittler über zu starten, sollte der Scoring-Prozess unterbrochen werden, und machen es einfacher für die viewer bis auf die Behandlung, um Bias zu reduzieren geblendet werden.

Protokoll

1. Erhebung und Erstellung von Testpersonen

1. Sammeln Sie die entsprechende Anzahl von Bienen aus der Kolonie.
   Hinweis: Die Anzahl benötigt, hängt nicht nur von der Größe und der Umfang des Experiments, sondern auch die Fähigkeit des Forschers. wenn es zwei Behandlungsgruppen mit einer gewünschten Probengröße von 10 Bienen pro Gruppe sind, zum Beispiel ein einigermaßen erfahrener Ermittler könnte mindestens 30 Bienen zu machen erfolglos Dissektionen sammeln und mit 20 nützlichen Videos am Ende punkten.
2. Minimieren Sie die Zeitspanne, die zwischen Sammlung und Präparation passiert.
   Hinweis: Obwohl Bienen kann im Labor für Tage vor der Dissektion untergebracht werden, wobei die Erfolgsrate von Dissektionen (dh die Wahrscheinlichkeit einer stabilen Herzfrequenz in einem seziert Rückengefäß aufrechtzuerhalten) wurde beobachtet , bezogen auf die Menge der Zeit zu verringern , dass Bienen sind weg von der Kolonie untergebracht.
   1. Geben Sie Bienen mit einer Quelle für Wasser und Nahrung, während im Labor untergebracht. Für EXAmple, auf ein Minimum, den Zugang zu einer 50% (w / v) Saccharoselösung in Wasser (dies ist ausreichend für Zeitdauern von weniger als 6 h). Für längere Zeiträume bieten Bienen den Honig gelangen.
   2. Haus Bienen im Labor über Nacht bei einer Temperatur von etwa 32 ° C und 60-80% relativer Luftfeuchtigkeit Stress zu reduzieren und Austrocknung zu vermeiden.
3. Vor der Präparation, betäuben die Bienen kurz in der Handhabung zu erleichtern.
   HINWEIS: Dies kann die Erfolgsrate von Dissektionen verringern und den Durchsatz zu verringern.
   1. Kühlen Sie die Bienen entweder, indem sie auf Eis gestellt oder in einen Kühlschrank für gerade lange genug, um zu reduzieren Bewegung, um bei der Handhabung zu erleichtern.
   2. Alternativ kurz Bienen zu CO ₂ , um bei der Handhabung zu erleichtern aussetzen.
      HINWEIS: Längere Einwirkung von Kälte kann die Erfolgsrate von Dissektionen reduzieren. Erweiterte oder wiederholter Exposition gegenüber CO ₂ kann auch die Erfolgsrate von Dissektionen reduzieren.

2. Dissectionvon dorsale Bauchwand

HINWEIS: Die Bienen sollten zum Zeitpunkt der Dissektion am Leben.

1. Mit einer Pinzette und / oder Mikrodissektion Schere, entfernen Sie die Beine und Flügel Dissektion des Bauches zu erleichtern. Halten Sie einen kleinen Becher oder einem ähnlichen Behälter mit destilliertem Wasser gefüllt in der Nähe zum Zwecke der Instrumente zwischen Dissektionen Spülen.
2. Während die Biene mit einer Pinzette zurückzuhalten, die Mikrodissektion Schere verwenden seitlich zwischen dem ersten und dem zweiten tergites (siehe Abbildung 1) entlang der dorsalen Bauchwand zu schneiden.

Abbildung 1: Dorsale Ansicht der Bienen Bauch. Der anfängliche Einschnitt sollte zwischen den ersten und zweiten tergites hergestellt werden, wie durch die rote Linie bezeichnet. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken siee eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Während die leichte Schulter der hinteren Kante des zweiten Tergit mit der Greifzange, die entlang jeder Seite der Biene von der anfänglichen Einschnitt in die Stinger längs geschnitten (siehe Abbildung 2). Seien Sie vorsichtig beim Durchstoßen des Magen-Darm-Trakt zu vermeiden Schneiden.

Abbildung 2: Seitenansicht der Bienen Bauch. Die zweite und dritte Einschnitte sollten entlang jeder Seite des Abdomens durchgeführt werden, wie durch die rote Linie bezeichnet. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Tauschen Sie die Schere für einen zweiten Satz von feinen Pinzette und verwenden sie sorgfältig auf die dorsale Bauchwand vom Rest trennen of den Bauch. Entfernen Sie vorsichtig die Stinger und einen Teil des Magen-Darm-Trakt, die an der dorsalen Bauchwand befestigt bleibt. Vermeiden Sie den Darm Bersten, als der Inhalt kann Mantel der Bauchdecke und Visualisierung des Rückengefäß behindern.

Abbildung 3: Ansicht des Rückengefäß. Sobald der Darm und Stinger entfernt worden sind, ist der Rückengefäß sichtbar entlang der Mittellinie der dorsalen Bauchwand seziert. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Ordnen Sie die dorsalen Bauchwand in der gewünschten Ausrichtung unterhalb der Kamera , so dass das Rückengefäß sichtbar ist (siehe Abbildung 3). Nutzen Sie die Mikrodissektion Schere überschüssige ab wegzutrimmendominal Wand, die Visualisierung des dorsalen Fahrzeugs behindert wird. Die Form der dorsalen Bauchwand sollte eine flache Schale oder Schüssel ähneln, wenn sie richtig gelegen.
   1. Da das Rückengefäß nicht in die hinterste Abdominalsegment der Biene erweitern, entfernen Sie das letzte Tergit, um die Visualisierung des Rückengefäß zu verbessern.
6. Mit Hilfe eines einstellbaren Volumen-Mikropipette, decken Sie die Rückengefäß mit 10 ul einer isotonischen Lösung physiologischen Bedingungen zu erhalten und einen stetigen Herzschlag erleichtern.
   HINWEIS: Die empfohlene Lösung Viertel Stärke Ringer-Lösung (0,120 g / L Calciumchlorid, 0,105 g / l Kaliumchlorid, 0,050 g / L Natriumbicarbonat und 2,250 g / l Natriumchlorid), das eine stabile zu erleichtern gefunden wurde, kontinuierliche Herzschlag.

3. Beobachtung und Modulation der Herzfrequenz

1. Lassen Sie das Rückengefäß ungestört sitzen, bis eine stabile, kontinuierliche Herzschlag erreicht wird(In der Regel innerhalb von 300 sec).
   HINWEIS: Herzschlag als rhythmische Kontraktionen des dorsalen Gefäß sichtbar gemacht wird. Anfänglich kann es scheinen kein Herzschlag zu sein, besonders wenn die Biene anästhesiert wurde, aber das Herz wird in der Regel schlag fortgesetzt, nachdem mehrere Minuten in isotonischer Lösung ruhen und kann stundenlang weiter zu schlagen, vorausgesetzt, es bleibt in Lösung getaucht.
2. Messen Sie die Herzfrequenz in Bezug auf die Anzahl der Schläge pro Minute (BPM).
   1. Notieren Sie die Anzahl der Kontraktionen während eines 60 Sekunden Zeit beobachtet. Verwenden Sie einen Handtallykostenzähler und einen Timer, diesen Prozess zu erleichtern.
3. Messen Sie die Veränderung der Herzfrequenz durch die beobachtete BPM Aufzeichnung vor und nach der Behandlung mit einer cardiomodulatory Verbindung.
   HINWEIS: Obwohl die Zeit eine Wirkung auf die Herzfrequenz variieren von der Verbindung kann in Abhängigkeit zu beobachten erforderlich getestet werden, können Veränderungen der Herzfrequenz der Regel innerhalb weniger Minuten beobachtet werden.
   1. Bestimmen Sie die Basisherzfrequenz unmittelbar vor derdie Zugabe einer Testverbindung.
      HINWEIS: Die Nachbehandlung Herzfrequenz kann in der Regel nach 90 bis 120 Sekunden bestimmt werden.
   2. Bereiten Potential cardiomodulators (zB Octopamin) , indem die Verbindung in der gleichen isotonischen Lösung Auflösen verwendet , um die Rückengefäß baden.
   3. Fügen Sie die Testverbindungen zur Lösung des Rückengefäß umgeben von einer micropipetter verwendet.
4. Für eine höhere Genauigkeit und einen höheren Durchsatz, eine Videoaufzeichnung eines jeden Probanden machen und dann die Videos verwenden, um die Herzfrequenz zu einem späteren Zeitpunkt punkten.
   HINWEIS: Dies ermöglicht einen einzelnen Ermittler Dissektionen, um zu staffeln fast kontinuierliche Produktion von Videos zu erleichtern. Wenn die Aufnahme von Videos ist die empfohlene Mindestlänge ca. 240 sec bei jeder Testverbindung, bei der Markierung 60 Sekunden hinzugefügt. Dadurch wird sichergestellt, dass der Prüfer für Scoring-Basisherzfrequenz mit 60 sec Fenster hat und dann eine weitere 60 sec Fenster für Scoring Nachbehandlung Herzfrequenz 120 Sekundennach der Behandlung.

Ergebnisse

Da viele der pharmakologisch wirksamen Verbindungen, die nicht löslich sind, getestet werden kann in Wasser unter Verwendung dieses Protokolls ist es erforderlich, ein zuverlässiges Lösungsmittel zu haben, die Testverbindungen über die isotonische Lösung ermöglicht geliefert werden verwendet, um die Rückengefäß baden. Dimethylsulfoxid (DMSO) ist ein Lösungsmittel , das üblicherweise als Vehikel zur Abgabe von experimentellen Arzneimitteln und anderen Verbindungen in Tieren verwendet wird...

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll bietet einen einfachen und effektiven Ansatz zum Testen pharmakologischer Verbindungen auf ihre Auswirkungen auf die Herzfrequenz von Honigbienen. Wie in früheren Experimenten beobachtet, bei denen entweder der ventrale Nervenstrang eines lebenden Insekts⁵ durchtrennt oder der ventrale Nervenstrang bei Freilegung des dorsalen Gefäßes⁷ präpariert wird, führt der Verlust der Regulation des Zentralnervensystems zu einem stabilen, niederfrequenten Herzschlag. Die niedrige...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dino-Lite Edge digitales USB-Mikroskop	Dino-Lite	AM4815ZT	Jedes digitale Mikroskop oder eine ähnliche Einrichtung reicht
Mikroskopstativ	Dino-Lite	RK-10	Jedes Stativ, das für das Digitalmikroskop geeignet
ist Laptop oder PC			Notwendig für das digitale Mikroskop
Mikrodissektionschere (Vannas, 8 cm, gerade, 5 mm Klingen)	World Precision Instruments	14003	Jede ähnliche Schere, die für die Mikrodissektion geeignet ist, reicht
Mikrodissektion, 10,2 cm, abgewinkelt (2 Paar)	World Precision Instruments	504482	Jede ähnliche Pinzette, die für die Mikrodissektion geeignet ist, reicht aus
Ringers Lösung 1/4 Stärke Tabletten	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Präparierlöffel			Jede für die Mikrodissektion geeignete Oberfläche
Einkanal 10 & Mikro; l Pipette			Jedes Gerät, das in der Lage ist, 10 & Mikro; l Volumen
Pipettenspitzen
Kleiner Becher oder Behälter mit Wasser			Zum Spülen von Instrumenten zwischen den Probanden
Handstrichzähler	Office Depot	295033	Jedes ähnliche Produkt reicht
Timer	Office Depot	644219	Jedes ähnliche Produkt reicht aus
Deionisiertes Wasser			Vorbereitung der Ringers-Lösung und Spülinstrumente

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