Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Summary

Probleme bei der Verarbeitung biologischer Proben für die Rasterelektronenmikroskopie umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus feuchten Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Kostengünstige und relativ schnelle Protokolle, die sich für die Vorbereitung anspruchsvoller Proben wie Blütenmeristeme, Oomycetenzysten und Pilze (Agaricales) eignen, werden hier zusammengestellt und detailliert beschrieben.

Abstract

Häufige Probleme bei der Verarbeitung von biologischen Proben für Beobachtungen mit dem Rasterelektronenmikroskop (SEM) umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Mit jungen Blütengewebe, oomycete Zysten und Pilzsporen (Agaricales) als Beispiele spezielle Protokolle empfindliche Proben zu verarbeiten hier beschrieben werden, die einige der wichtigsten Herausforderungen in der Probenbehandlung für die Bilderfassung unter dem SEM überwinden.

Floral meristems mit FAA fixiert (Formalin-Acetic-Alkohol) und mit dem kritischen Punkt Dryer (CPD) verarbeitet nicht Zellwände oder verzerrt Organe kollabiert Display. Diese Ergebnisse sind von entscheidender Bedeutung für die Rekonstruktion der Blütenentwicklung. Eine ähnliche CPD-basierte Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen, wie beispielsweise die mit Glutaraldehyd fixierten Oomyceten Zysten ist optimal die differentielle Wachstum von diagnostischen Eigenschaften zu testen (beispielsweise die Zyste Stacheln) auf verschiedenen Arten von substrates. Die Zerstörung der Nährzellen an Pilzsporen wurde nach Rehydrierung vermieden, Dehydrierung und der CPD-Behandlung, ein wichtiger Schritt für die weitere funktionelle Studien dieser Zellen.

Die Protokolle detailliert hier repräsentieren preiswerte und schnelle Alternativen für den Erwerb von qualitativ gute Bilder Wachstumsprozesse zu rekonstruieren und diagnostischen Eigenschaften zu studieren.

Introduction

In der Biologie ist die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Untersuchungen von Strukturentwicklung erweitert, vergleichende Morphologie, Organentwicklung und Charakterisierung von Populationen oder ¹ - Arten. Mit seiner zweidimensionalen Ansicht von mikroskopischen Strukturen, Bereiche wie Mikromorphologie und Systematik profitierte von SEM - Technik Fortschritte seit der zweiten Hälfte des ^20. Jahrhunderts. Beispielsweise hat die Einführung der Sputter - Beschichtungsmethode in den 1970er Jahren möglich , Beobachtungen von empfindlichen Materialien wie Spross Scheiteln und Blüten der Abbildungs aus nichtleitendem Geweben verbessern ^{2, 3.} SEM verwendet von der Oberfläche der Probe emittierten Elektronen , die Topographie in einer Hochvakuumumgebung ⁴ zu reproduzieren.

Studien SEM werden, die sowohl in der Ableitung von Struktur Zeichen konzentriert und den Wiederaufbau von growth Prozesse. Neue strukturelle Zeichen relevant für die Taxonomie und Systematik von einem breiten Spektrum von Organismen wurden aus SEM Beobachtungen entdeckt. Zum Beispiel Pflanzeneigenschaften für Arten , Diagnose oder supraspecific Klassifikationen, wie die Verzierte Tüpfel aus Holz ^_5, Stigma Vielfalt ^6, nectary und floralen Morphologie ^{7, 8,} trichome Details ⁹ und Pollenkörner ¹⁰ werden richtig ^{sichtbar, 11,} kann nicht verwendet werden , ohne SEM. Erfolgreiche Beobachtungen mit konventionellen SEM wurden für Langzeit Formalin fixierten Organismen ¹² und Anlage Herbarbelege ¹³ auch erreicht.

Auf der anderen Seite, Studium der Rekonstruktion von Wachstumsprozessen REM umfassen ein breites Spektrum von Themen wie Organentwicklung ^14, infections induziert durch Bakterien ^15, Pflanzenwurzel Physiologie ^16, Parasit-Wirt - Befestigungsmechanismen ^{17, 18,} Arzneimittelwirkungen auf Parasiten ^19, Mycoparasitismus und antibiotische ^{20, 21,} Wachstum Malformation ^22, vergleichende Entwicklung von wild und mutierten Individuen ²³ und gesamten Lebenszyklus ^24. Obwohl Umwelt Rasterelektronenmikroskope (ESEM) ²⁵ wichtige Vorteile für die Beobachtung von nassen biologischen Proben in Wachstumsprozesse haben können, können empfindliche Material noch einmal in dem Niedervakuumzustand des ESEM) beeinträchtigt werden, und muss ausreichend Verlust zu vermeiden verarbeitet werden von wertvollen morphologischen Beobachtung.

In diesem Papier, eine Überprüfung der spezifischen Protokolle für die SEM-Beobachtung von drei diffErent Probentypen vorgestellt: Blumen Meristeme, Oomyceten (Saprolegnia) und Pilzmaterial. Diese Protokolle kompilieren die Erfahrung unserer bisherigen SEM-basierten Studien ^{26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,} in denen besondere Schwierigkeiten und alternative Lösungen gefunden. Im Falle von Pflanzenvergleichs Entwicklungs- und Strukturstudien begann die Verwendung von SEM in den 1970er Jahren ^{34, 35,} und seitdem entdeckten Forscher , dass bestimmte Blumen Merkmale labiler sind als bisher ³⁶ gedacht. Die Rekonstruktion der Blütenentwicklung beinhaltet die Erfassung aller Stufen zwischen jungen Blumen Meristeme und anthesis. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es Essential dass die Probentopographie und der Zellwandintegrität werden nach der Fixierung und nachfolgende Dehydratisierung nicht beeinträchtigt wird. Junge Blumen Meristeme sind besonders anfällig für Zellwand Zusammenbruch (1a, 1b). In ähnlicher Weise empfindliche Strukturen wie Nektarien, Blütenblätter, Stigmata und Sporangien erfordern effektive und undamaging Protokolle. Diese Übersicht fasst ein optimales Protokoll junge und empfindliche Gewebe intakt für SEM-Bildgebung zu halten.

Im Falle der Oomyceten (Stramenopiles) -on der vielfältigsten und weit verbreiteten Gruppen von Parasiten, die mit den Hosts von Mikroben und Pflanzen zu wirbellosen Tieren und Wirbeltieren im Bereich ³⁷ - gibt es Sporen, die in einer feuchten Umgebung wachsen und sich entwickeln. Diese Bedingung stellt eine Herausforderung für SEM-Beobachtung, da die Sporen ein ausreichendes Substrat nicht geeignet für Standard-SEM-Protokolle benötigen. Unter den Oomyceten - Arten Saprolegnia sind von besonderem Interesse , weil sie caverursachen n erheblichen Kürzung der Aquakultur, Fischerei und Amphibienpopulationen ^38. Mikromorphologische Eigenschaften, wie die Hakenstacheln von Zysten, haben sich als nützlich erwiesen Arten von Saprolegnia zu identifizieren, die von grundlegender Bedeutung ist , um Infektionskontrollen und mögliche Behandlungen ³⁹ herzustellen. Hier gibt es ein Versuchsprotokoll, um die Muster der Wirbelsäule Wachstum von Zysten auf verschiedenen Substraten zu vergleichen und die Probe für die kritischen Punkt Trockner (CPD) Herstellung und anschließende SEM Beobachtung zu manipulieren.

In einem dritten Fall gibt es interessante Erkenntnisse , die nach einer Inspektion der Sporen der Pilze Phellorinia herculanea f kam. stellata f. nova (Agaricales) ^31. Zusammen mit den Sporen, wurde eine Gruppe von unerwarteten nursery Zellen unter dem SEM identifiziert. Bei früheren traditionellen Protokollen und unbehandeltem Material, kamen die Nährzellen out vollständig zusammengebrochen (Abbildung 1c). Weitere Rückschlüsse insbesondere auf die Sporen dazugehörigen Gewebe kann mit den einfachen , aber entscheidenden Änderungen an den Standardansätze hier (Abbildung 1d) beschrieben , hergestellt werden.

In dieser Bewertung gibt es detaillierte SEM-Protokolle, die mit unterschiedlichen Problemen verwendet werden können, mit SEM-Betrachtung bei Angiospermen, Oomyceten und Agaricales, wie Zellkollaps und Meristemgewebe Schrumpfung, nicht das optimale Wachstum von Zysten Stacheln und Zerstörung fertig zu werden ephemeren Gewebe, respectively.

Abbildung 1: Vergleich von Proben behandelt , ohne (a, c) und mit (b, d) das Protokoll FAA-Ethanol-CPD. (A - b) Blumenknospen von Keulen-Bertram, Mid-Entwicklung. Bud mit Osmiumtetroxid behandelt ^{46 <}/ sup> (a) und Knospe mit der FAA-CPD - Protokoll (b) behandelt. (C - d) Krankenschwester Zellen mit Sporen von Phellorinia herculanea f. stellata. Getrocknete Proben ohne Behandlung (c) und mit dem Protokoll hier für Agaricales beschrieben (d). Spores in Orange. Waage: (ab) 100 & mgr; m (cd) 50 & mgr; m. Fotos wurden von Y. Ruiz-León genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

HINWEIS: Dieses Protokoll enthält sechs Hauptbereiche, drei gewidmet bestimmte Organismen (Abschnitte 1-3), und drei der Beschreibung der Verfahren, die für alle (4-6). Sternchen (*) zeigen Schritte, die von den Experimentatoren modifiziert.

1. Studium der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed

1. Sammlung und Fixierung
   1. Wenn das Pflanzenmaterial in einem Ort ohne Zugang zu einem Abzug gesammelt wird, einführen und das Material in 70% Ethanol in Zentrifugenröhrchen eintauchen. Idealerweise tauchen Sie das Material nach 48 h in FAA (Schritte 1.1.1-1.1.3) übermäßige Dehydratisierung in Ethanol zu vermeiden. Wenn ein Abzug auf das Pflanzenmaterial zugänglich ist, ignorieren Sie diesen Schritt und fahren Sie mit 1.1.1.
   2. Bereiten Sie die Formalin-Essigsäure-Alkohol (FAA) Fixiermittel in einem Abzug mit einem Aldehyd-Filter ausgestattet. Mit 85 Teilen 70% denaturiertem Ethanol, 10 Teile 60% ige Formaldehydlösung und 5 Teilen Eisessig. Bereiten Sie die FAAkurz bevor das Material, die als langfristige Lagerung Befestigung ist nicht mehr als ⁴⁰ empfohlen.
   3. Unter dem Abzug, gießen Sie den Bestand der FAA in einzelne Breit Mund und auslaufsicher Kunststoff-Flaschen. Verwenden Sie so viele Flaschen wie es Proben zur Verfügung, und erstellen Sie Etiketten für die Probenidentifikation.
   4. Wählen Sie die Blumen- oder vegetative meristems zu beheben, um sicherzustellen, dass sie nicht von Insekten beschädigt sind, Pilze oder extreme Wetterbedingungen. Schneiden Sie die Zweige, das Entfernen von unerwünschtem Material, und legen Sie die Probe sofort in der FAA Lösung.
   5. Nach 72-96 h, gießen Sie die FAA in einen Plastikbehälter für die chemische Verfügung. Sofort, waschen Sie die Proben dreimal mit frischem 70% Ethanol restliche FAA zu entfernen. Festmaterial kann auf unbestimmte Zeit in 70% Ethanol aufbewahrt werden.
2. Dissection und Dehydration
   1. Präparieren Sie die feste Material in 70% Ethanol unter dem Stereomikroskop ultrafeinen Pinzette, neEdles, Pinzetten, Pinsel und Mikro-Skalpelle (die maximale Größe des Gewebes sollte etwa 1 cm ³ oder 2 cm für Flachmaterial sein). Präparieren der Proben in eine Petrischale mit Ethanol bedeckt das Gewebe vor dem Austrocknen zu verhindern. Verwenden Sie eine Petrischale mit der Basis mit trockenem schwarzem Silikon bedeckt, um besser die kontrastierenden weißen Gewebe zu sehen.
   2. Setzen Sie den sezierten Material in die Probenbehälter für den kritischen Punkt Trockner (CPD, Abbildung 2a). An dieser Stelle tauchen die Behälter in die Petrischale mit 70% Ethanol, und umfassen die Probenidentifikationsetiketten (hergestellt mit Papier und Bleistift). Für eine effektivere Trocknung zur weiteren Manipulation, vermeiden Sie die junge und reife Proben in demselben Behälter mischen. *
   3. Setzen Sie den Deckel auf den Behältern und deponieren sie in Plastikzentrifugenröhrchen mit reichlich 70% Ethanol. Lagern Sie die Röhrchen über Nacht, wenn das Material nicht sofort verarbeitet wird.
   4. Übertragen Sie das sezierte Material durch die folgende Ethanol series in hermetischen Gläsern oder Zentrifugenröhrchen: 70%, 90%, 100% und 100%. Lassen Sie die Proben in jeder Lösung für 1 h mindestens. Halten Sie die Proben über Nacht in einer 100% igen Ethanollösung.
   5. Übertragen Sie die Behälter mit dem Material der BPR (Abschnitt 4).
3. Montage und Herstellung von Pflanzengeweben für SEM - Beobachtung
   1. Schreiben Sie die Probenidentifikationsnummer unter den SEM - Probenhalter (dh Aluminium - Stubs). Decken Sie die Oberseite der Stümpfe mit einem doppelseitigen Klebeband. Platzieren Sie den Stummel in einen Probenhalter (Abbildung 2b).
   2. Unter einem Stereomikroskop, öffnen Sie sorgfältig die Behälter, die jungen und empfindlichen Proben tragen bereits in der CPD getrocknet. Beachten Sie, dass nach der CPD-Behandlung, die Proben werden leichter und empfindlich gegenüber Elektrostatik. Schließen der Behälter, nachdem die Proben wurden Staub oder Verunreinigungen zu vermeiden entnommen.
   3. Legen Sie die Proben auf der klebrigen Oberfläche der Stubs, vorausschauende Planung der gewünschtePosition (sobald die Proben, die die Oberfläche berühren, ist es sehr schwierig ist, sie zu entfernen). Versuchen Sie nicht, eine große Dissektion an dieser Stelle zu tragen; nur unerwünschtes Gewebe zu entfernen, die zu holen ist einfach. Für palynologische Studien, sezieren die Antheren und öffnen sie den Pollen auf die Stümpfe zu belichten.
   4. Stellen lange Proben (beispielsweise 2 cm lang) wie inflorescences in der horizontalen Position. Wenn möglich, orient Proben der gleichen Struktur für polare, Seiten- und Unteransichten. Lassen Sie genügend Platz zwischen den Proben auf dem Stummel.
   5. Wenn die Proben nicht sofort verarbeitet werden können, halten sie über Nacht in einem hermetischen Behälter mit Kieselgel geschützt Rehydrierung (Abbildung 2c) * zu vermeiden. Bestreichen Sie die Proben unter Verwendung des Sputter-Coater und dessen Übertragung an den SEM (Abschnitte 5 und 6).

Abbildung 2: Werkzeug für die Probe manipulatiauf und Verarbeitung vor dem SEM-Beobachtung. (A) aus Stahl Probenbehälter mit Löchern versehenen Wände für die Ethanol / CO ₂ Austausch in der CPD Kammer. (B) Stahlstummel in einem Kunststoffprobenhalter. (C) Glasbehälter verwendet , um die Proben vor Feuchtigkeit und Staub geschützt zu halten. An der Basis ist ein Fach für Silicagel. (D) Kritischer Punkt Trockner. In der Front befinden sich (von links nach rechts) das Manometer, den Netzschalter, der Temperaturregelung und der Temperaturanzeige. Übliche Arbeitsdruck für CO ₂ ethanol Austausch ist 60 bar (800 psi). In der Spitze gibt es vier Ventile (Einlass, abtropfen lassen, Lüftungs- und Abgaskontrollen) die zentrale Probenkammer flankieren. Fotos wurden von Y. Ruiz-León und MA Bello genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

< p class = "jove_title"> 2. Studium der Cyst Verhalten von Saprolegnia (Oomycetes) auf verschiedenen Oberflächen

1. Wachsende und Fixieren der Zysten
   1. Bereiten Sie Pepton und Glucose (PG-l) Medien ⁴¹ unter Verwendung von D - (+) - Glucose (6 g) und mykologische Pepton (3 g) *. Fügen Sie bis zu 900 ml Leitungswasser und im Autoklaven 40 min bei 121 ° C. Pour 50 ml der zuvor autoklavierten Lösung A (NaH ₂ PO _4, 0,13 M) und 50 ml Lösung B (Na ₂ HPO _4, 0,13 M).
   2. Aus Stammkulturen von Stämmen von Saprolegnia parasitica auf Pepton gehalten, Glucose, Agar - Medien (PGA, die als PG-l hergestellt wird , jedoch unter Zugabe von 10 g der europäischen bakteriologischer Agar auf die Glucose und Pepton vor Autoklav), Myzelien Kolonien in 0,5 ml wachsen von PG-l-Tröpfchen für 24-48 h bei 20 ° C in Petrischalen. Sporulation induziert, indem die Myzelien mit autoklaviertem Leitungswasser dreimal Waschen und Inkubieren sie für 15 h bei 20 ° C= "Xref"> ^{42, 43.}
   3. Sammeln Sie die freigesetzten sekundären Zoosporen durch sanft den oberen Teil der Suspension pipettiert und bündeln sie in 1-ml-Portionen. Rühre kräftig die Zoosporen für 30 s durch Verwirbelung ⁴⁴ sekundäre Zysten zu erzeugen.
   4. Um das Differential Wachstum der Stacheln der Zysten zu testen, auf separaten Petrischalen (p60), legte 0,5 ml der sekundären Zyste Suspension auf verschiedenen Oberflächen (dh Kohlenstoff, Gold und Kupfer TEM Grids, Lachs und Seehecht Fischschuppen (früher gebleicht) und Glasplättchen) *. Inkubieren der Zysten bei 20 ° C für 70 min, das die Befestigung der Zysten an der Oberfläche begünstigt.
   5. Entfernen Sie die Flüssigkeit und mit 0,5 ml 2% igem Glutaraldehyd zu jeder Oberfläche für die Fixierung der Zysten. Halten Sie die Proben bei Raumtemperatur unter einem Abzug für 1 h.

1. 1. &

Results

Floral Entwicklung und Fixierung der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed

Mit dem FAA-CPD-Protokoll hier beschrieben, junge und reife Pflanzengewebe optimal fixiert und dehydriert für SEM-Bildgebung. Prozesse wie Blütenentwicklung kann rekonstruiert werden , weil die Topographie und die Form der Knospen nicht durch Zellschrumpfungs (Figuren 1b, 1d, 4a-f) verzerrt. Strukturen mit komplizierten Formen kön...

Discussion

In Bezug auf die Standard-SEM-Protokolle, präsentiert die Verfahren hier sind relativ schnell, einfach zu folgen, und Low-Cost-Methoden. Je nach der Menge der Proben und auf die Leichtigkeit der Verarbeitung, dauert es vier bis fünf Tage, um Bilder von guter Qualität erhalten. Einschließlich einer angemessenen Sicherheitsvorkehrungen für die CPD und SEM-Betrieb sind die Verfahren einfach zu handhaben. Besondere Vorsicht ist mit Formalin und Glutaraldehyd (siehe Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 und 2.1.5 des Protokolls) entnomme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essigsäure	Kein spezifischer Lieferant		Hautreizungen, Augenreizungen
Aluminiumstummel	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Zentrifugenröhrchen	Kein spezifischer Lieferant
Critical Point Dryer	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D-(+)-Glucose	Merck	1.083.421.000
Doppelseitiges Klebeband	Kein spezifischer Lieferant
Ethanol absolut	Kein spezifischer Lieferant		Entzündlicher
europäischer bakteriologischer Agar	Conda	1800.00	www.condalab.com
Filterpapier	Kein spezifischer Lieferant
Pinzetten	Kein spezifischer Lieferant
Formalin 4%	Kein spezifischer Lieferant		Gesundheitsschädlich, akute Toxizität, Hautsensibilisierung, Karzinogenität.
Abdeckgläser aus brennbarem Glas	Kein spezifischer Lieferant
hermetischer Glasbehälter	Kein spezifischer Lieferant
Glutaraldehyd 25% DC 253857.1611  (L)	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Mykologisches Pepton	Conda	1922.00	www.condalab.com
Nadeln	Kein spezifischer Lieferant
Petrischalen	Kein bestimmter Lieferant
Kunststoffbehälter	Kein bestimmter Lieferant
Probenhalter mit Deckel für den Trockner an der kritischen Stelle	Ted Pella, Inc.	4591	www.tedpella.com
Skalpelle	Kein spezifischer Lieferant
Rasterelektronenmikroskop	Hitachi	S3000N
Software für REM
Lösung A: NaH2PO4
Lösung B: Na2HPO4
Probenhalter	Kein spezifischer Lieferant
Sputter-Coater	Balzers	SCD 004
Stereomikroskop	Kein spezifischer Lieferant
Transmissionselektronenmikroskop (TEM) Gitter	Elektronenmikroskopie	Wissenschaften G200 (Quadratmasche)	www.emsdiassum.com
Pinzette	Kein spezifischer Lieferant