Methodenartikel

Sammlung von Serum- und Feeder-freie Maus embryonale Zellen konditionierten Medium für eine zellfreie Ansatz Stem

DOI:

10.3791/55035

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8. Januar 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Smart-aging Convergence Research Center, College of Medicine, Yeungnam University, 2Physiology and Experimental Medicine Program, The Hospital for Sick Children Research Institute, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll liefert ein Verfahren für die Gewinnung von embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM), abgeleitet von Serum (fötales Rinderserum, FBS) - und Feeder (Maus embryonale Fibroblasten, MEFs) -freien Bedingungen für eine Zelle -freie Ansatz. Es kann für die Behandlung von Hautalterung und Alterungs-assoziierten Erkrankungen Anwendung finden.

Zusammenfassung

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Die Fähigkeit von embryonalen Stammzellen (ESCs) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), verschiedene Zelltypen zu erzeugen, hat neue Wege im Bereich der regenerativen Medizin eröffnet. Trotz ihrer Vorteile war das tumorigene Potenzial von ES-Zellen und iPS-Zellen jedoch lange Zeit ein Hindernis für klinische Anwendungen. Interessanterweise wurde gezeigt, dass ESCs mehrere lösliche Faktoren produzieren, die die Geweberegeneration fördern und die Zellalterung verzögern können, was darauf hindeutet, dass ESCs und iPSCs auch als zellfreie Interventionsmethode eingesetzt werden können. Daher war die Methode zur Gewinnung von embryonalen Stammzellen (mESC)-konditioniertem Medium (mESC-CM) der Maus mit minimaler Kontamination von Serumbestandteilen (fetales Rinderserum, FBS) und Feederzellen (embryonale Fibroblasten der Maus, MEFs) sehr gefragt. Hier demonstriert die vorliegende Studie eine optimierte Methode zur Entnahme von mESC-CM unter serum- und feederfreien Bedingungen und zur Charakterisierung von mESC-CM mittels Seneszenz-assoziierter Mehrfachauslesungen. Dieses Protokoll wird eine Methode zur Erfassung reiner mESC-spezifischer sekretorischer Faktoren ohne Kontamination von Serum und Feeder bieten.

Einleitung

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Das Ziel dieses Protokolls ist embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) -conditioned Medium (MESC-CM) von serum- und Feeder-freien Kulturbedingungen zu sammeln und ihre biologischen Funktionen zu charakterisieren.

Im Allgemeinen haben embryonale Stammzellen ( ES- Zellen) ein großes Potential für die regenerative Medizin und Zelltherapie aufgrund ihrer Pluripotenz und Fähigkeit zur Selbsterneuerung 1-3. Jedoch hat die direkte Transplantation von Stammzellen mehrere Einschränkungen, wie Immunabstoßung und Tumorbildung 4,5. Daher kann ein zellfreier Ansatz eine alternative therapeutische Strategie für die regenerative Medizin zur Verfügung stellen und Alterungs Interventionen 6,7.

Seneszenz wird als ein zelluläres Pendant zur Alterung von Geweben und Organen betrachtet, von einem permanenten Zustand der Wachstumsarrest, veränderte Zellphysiologie und Verhalten charakterisiert. Altern ist der Hauptrisikofaktor für weit verbreitete Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf- Erkrankungen, typ - 2 - Diabetes und neurodegenerative Krankheit 8. Einer der offensichtlichen Merkmale des Alterns ist der Rückgang der regenerative Potenzial von Geweben, die durch Stammzellalterung und Erschöpfung 9 verursacht wird. Viele Studien haben signifikante pharmakologische Moleküle gezeigt, wie Rapamycin 9, Resveratrol 10 und Metformin 11 und hämatogenen systemische Faktoren, nämlich GDF11 12, die die Fähigkeit haben konsequent Alterung verzögern und die Lebensdauer verlängern.

In der vorliegenden Studie wurde MESC-CM wurde ohne Serum (fötales Rinderserum, FBS) und feeder (Maus embryonale Fibroblasten, MEFs) -Schichten geerntet, um die Kontamination von Serumfaktoren und sekretorischen Faktoren von MEFs auszuschließen. Diese Bedingungen erlaubt eine serum-und Feeder-freie CM, die folglich die genaue Identifizierung von MESC spezifischen sekretorischen Faktoren aktiviert.

Diese vorgeschlagene Protokoll ist sehr leistungsfähig, relativ kostengünstig und einfachzu bedienen. Diese Technik liefert einen Einblick in die Charakterisierung von MESC abgeleiteten löslichen Faktoren, die eine anti-Seneszenz Wirkung vermitteln kann, die für die Entwicklung eines sicheren und potenziell vorteilhaft zellfreien therapeutischen Ansatz zur Interventionen für alterungs assoziierten Krankheiten und andere regenerative verwendet werden kann, Behandlungen.

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Protokoll

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HINWEIS: Ein Schema des serum- und feeder freien CM Sammelprotokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Materialien (Herstellung von MEF, Medium, Platten, und Lösungen)

  1. Bereiten Sie 500 ml Medium zur Kultur der MEFs. Ergänzung nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS (ESC-Qualität), 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 mg / ml Streptomycin.
  2. Isolieren MEFs von Embryonen nach einer etablierten Routine - Protokoll 13 und halten sie in MEF Medium.
  3. Bereiten 500 ml Medium der mESCs zur Kultur. DMEM mit 15% FBS und 2 mM L-Glutamin, 100 & mgr; M nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 100 & mgr; M β-Mercaptoethanol, 100 Einheiten / ml Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 mg / ml Streptomycin.
  4. Bereiten Sie die verkleisterte Platten (5 verkleisterte Platten / 1 MESC Platte) durch die Beschichtung 10 cm Zellkulturschalen mit 5 ml 0,1% Gelatine-Lösung. Inkubieren für mindestens 10 min bei Raumtemperatur.
  5. Bereiten 500 ml des reduzierten Serum Medium für einen serumfreien Zustand mESCs. Supplement Reduzierte Serum Medien mit 1,2 g Natriumhydrogencarbonat (pH 7,0). Man filtriert durch ein 0,2 um Flaschenaufsatz-Filter.
  6. Bereiten Sie die Seneszenz assoziierten β-Galactosidase (SA β-gal) Färbelösung für den Nachweis von seneszenten Zellen: 1 mg / ml X-gal (gelöst in Dimethylformamid, DMF), 40 mM Citronensäure / Natriumphosphat-Puffer (pH 6,0) mM, 5 Kaliumferricyanid, 5 mM Kaliumferrocyanid, 150 mM NaCl und 2 mM MgCl 2 14.
    ACHTUNG: (Gefährliche) DMF ist eine giftige und ätzende Lösung. Tragen Sie persönliche Schutzkleidung (zB Nitril oder Latex - Handschuhe, einen Laborkittel und Schutzbrille) , wenn Lösung Handhabung. Verwenden Sie einen Abzug durchführen.
  7. Bereiten Sie 500 ml Medium zur Kultur humanen dermalen Fibroblasten (HDF, NHDF-Ad-Der-Fibroblast). Ergänzung DMEM mit 10% FBS und 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin.
jove_title "> 2. Kultur von embryonalen Stammzellen der Maus (1A und 2A)

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Zellkultur biologischen Schutzhaube.

  1. Behandeln die MEFs mit 20 ml MEF-Medium, enthaltend 10 ug / ml Mitomycin C in einer 15 cm Zellkulturschale. Inkubieren für 2 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
  2. Saugen Sie das Medium aus MEFs. Waschen der Zellen mit PBS dreimal. 3 ml Trypsin-EDTA (TE, 1x) und Inkubation für 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Nach 3 min, neutralisieren die TE mit 6 ml MEF Medium und zentrifugieren für 3 min bei 300 x g.
  3. Resuspendieren in 5 ml MEF Medium. Bestimmung der Zellzahl in der resultierenden Zellsuspension unter Verwendung von Trypan-Blau-Färbung und einer Zählkammer. Platte inaktivierten MEFs (feeder) bei einer Dichte von 2 x 10 6 Zellen pro 10-cm Zellkulturschale in MEF Medium. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
  4. Tauschen Sie das MEF Medium mit MESC Medium 24 Stunden nach der Zubringer Plattierung (auf derfolgender Tag).
  5. Platte die mESCs (G4 F1 - Hybrid - ES - Zelle) in einer Dichte von 2 × 10 6 Zellen auf dem Zubringer mit MESC Medium. Inkubieren für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
    HINWEIS: Die Anti-Aging - Wirkung von MESC-CM ist wahrscheinlich stärker , wenn unteren Kanalnummer mESCs 15-17 verwendet werden. Wir erwarben eine G4 MESC Leitung von Dr. Andras Nagy in Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Kanada.
  6. Halten der Zellen bei einer relativ hohen Dichte und der Durchgang bei einer 70-80% subkonfluenten Zustand. Ersetzen Sie das Medium mit frischem MESC Medium täglich.

3. Sammlung von Serum- und Feeder freie konditionierte Medium (1B und 2B)

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einer Zellkultur biologischen Schutzhaube.

  1. Spülen Sie die MESC Platte mit 5 ml PBS. 1 ml TE (2.5x) und Inkubation für 3 min bei 37 ° C und 5% CO 2. Nach 3 min neutralisieren die TE mit 2 ml MESC medium und zentrifugieren für 3 min bei 300 x g.
  2. Resuspendieren in 5 ml Medium MESC und Platte 1 ml in jede Gelatine beschichteten Kulturschale (5 verkleisterte Platten / 1 MESC Platte) in MESC Medium. Kultur bei 37 ° C und 5% CO 2 , bis 80-85% Konfluenz erreicht ist .
  3. Waschen Sie mESCs mit ausreichend PBS, die Zellen (8 ml pro 10 cm Platte) zur Deckung für 10 min pro Wasch, für insgesamt drei Wäschen. Inkubieren in Reduziertes Serum Medium für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
    HINWEIS: Der Waschschritt wichtig ist FBS Kontamination zu verhindern. Es ist wichtig , die Inkubationszeit 18,19 folgen.
  4. Sammeln MESC-CM in ein 50 ml konisches Röhrchen und zentrifugieren für 20 min bei 2.500 x g. Die überstehende Flüssigkeit Lösung (CM) nach der Zentrifugation. Man filtriert durch ein 0,2 um Flaschenaufsatz-Filter.

4. Auswirkungen von embryonalen Maus-Stammzellen-konditionierte Medium (MESC-CM)

HINWEIS: Die Wirkungen von MESC-CM wurden durch mehrere Verfahren validiert, wieSA β-gal-Assay, Zellzyklus-Analyse und qRT-PCR.

  1. SA β-gal Assay (3A)
    1. Seed HDFs bei einer Dichte von 2 x 10 4 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen in HDF Medium. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
    2. Nach einer Inkubation über Nacht Verwerfungs Hälfte des HDF Medium und fügen Sie MESC-CM und Kontrollmedium. Inkubieren für 72 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Steuermittel aus einem serumfreien Medium (Reduced Serum Medien) in einer Gelatine-beschichtete Schale in Abwesenheit von mESCs abgeleitet.
    3. Waschen Sie die Zellen mit ausreichend PBS, die Zellen (2 ml pro 6-Well-Platte) zur Abdeckung für 30 Sekunden pro Wäsche, für insgesamt zwei Wäschen. In 3,7% Paraformaldehyd (PFA) zur Fixierung. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
      ACHTUNG: (Gefährliche) Paraformaldehyd ist eine giftige und ätzende Lösung. Tragen Sie persönliche Schutzkleidung (zB Nitril oder Latex - Handschuhe, einen Laborkittel und Schutzbrille) , wenn die Lösung der Handhabung.Verwenden Sie einen Abzug durchführen.
    4. Saugen Sie das Fixierungslösung. Waschen der fixierten Zellen mit PBS zweimal, wie in Schritt 4.1.3 beschrieben.
    5. Fügen Sie die SA β-gal-Färbung Lösung (1-2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). bei 37 ° C für 17,5 Stunden inkubiert.
      HINWEIS: Es wird nicht in einem CO 2 -Inkubator inkubiert werden.
    6. Absaugen SA β-gal Färbelösung und wasche die Zellen zweimal mit PBS wie in Schritt 4.1.3 beschrieben.
    7. Fügen Sie die Eosin-Lösung für die Gegenfärbung. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen der Zellen mit PBS zweimal, wie in Schritt 4.1.3 beschrieben.
    8. Bildzellen bei 100-facher Vergrößerung eines Lichtmikroskops und die Aufnahmen eine angeschlossene Digitalkamera für die nachfolgende Analyse unter Verwendung verwendet wird.
      HINWEIS: Die Gesamtzahl der Zellen in einer Blind Weise und der Prozentsatz der SA β-gal positiven blauen Zellen gezählt werden, berechnet werden.
  2. Zellzyklus - Analyse (3B)
    1. Seed HDFs bei einer Dichte von8 x 10 4 Zellen pro Well in einer 6 cm Zellkulturschale in HDF Medium. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2.
    2. Nach einer Inkubation über Nacht Verwerfungs Hälfte des HDF Medium und fügen Sie MESC-CM und Kontrollmedium. Inkubieren für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
    3. Trypsinize die Zellen, wie beschrieben in Schritt 3.1 und Zentrifuge für 5 min bei 300 x g. Waschen der Zellen mit kalter PBS - Lösung (PBS mit 0,5 mM CaCl 2 und 2% FBS, 1 ml pro 1,5 ml Röhrchen) zweimal und Zentrifuge 3 min bei 2.500 x g. Resuspendieren in 100 & mgr; l kaltem PBS-Lösung.
    4. Fixieren Sie die Zellen von 200 ul kaltem Ethanol fallen während Verwirbelung. Lagerung bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde.
    5. Waschen der Zellen mit kalter PBS-Lösung zweimal, wie in Schritt 4.2.3 beschrieben.
    6. Resuspendieren der Zellen in 250 & mgr; l Natriumcitrat-Puffer (1,12%, pH 8,5) 50 ug / ml RNase enthielt. bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
    7. In 250 ul NatriumcitratPuffer, enthaltend 50 ug / ml Propidiumiodid. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur.
    8. Messen Sie die 10.000 Zellen in jeder Probe mit Hilfe der Durchflusszytometrie 20.
  3. qRT-PCR (3C)
    1. Seed HDFs und fügen Sie MESC-CM, wie in den Schritten 4.1.1 und 4.1.2 beschrieben.
    2. Isolieren der Gesamt-RNA aus den HDFs eines RNA-Extraktions-Kits unter Verwendung von gemäß dem Protokoll des Herstellers. Quantifizieren der extrahierten Gesamt - RNA mit einem Spektralphotometer 21.
    3. Synthetisieren cDNA durch Zugabe von 1 & mgr; g der Gesamt - RNA auf einem 20 & mgr; l Reaktionsmischung , die Oligo (dT) Primern und M-MLV reverse Transkriptase, entsprechend dem Protokoll des Herstellers 20.
    4. Messung der Amplifikation der cDNA mit einer Echtzeit - PCR - Maschine, unter Verwendung von Grün PCR Master Mix und spezifische Gen - Primer (Supplement Tabelle 1). Normalisieren der Daten mit GAPDH Ausdruck. Verwenden Sie das folgende PCR-Protokoll: initial deNaturierung für 10 min bei 95 ° C; 45 Zyklen für 15 Sekunden bei 95 ° C, 20 sec bei 55 ° C und 35 sec bei 72 ° C; und der Schmelzkurve Stufe für 15 sec bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C, 30 sec bei 95 ° C und 5 sec bei 60 ° C 15.

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Ergebnisse

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Ursprünglich mESCs sind auf einem MEF Feeder in MESC Medium mit FBS und andere Ergänzungen (1A und 2A) gehalten. CM wurde von mESCs in der verkleinerten Serum Medien ohne Feeder - Schicht, FBS oder andere Ergänzungen (1B und 2B) gesammelt. Diese Kulturbedingungen ermöglicht es uns, MESC spezifische konditionierte Medium ohne eine mögliche Kontamination durch die Faktoren aus dem Einzug, FBS oder andere Ergänzungen zu sam...

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Diskussion

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Für die erfolgreiche Sammlung von Serum- und Feederfreien MESC-CM, sollten die folgenden Vorschläge in Betracht gezogen werden. Der wichtigste Faktor ist für die Sammlung von MESC-CM frühen Passage mESCs verwenden. Bisher hat es sich gezeigt, dass eine frühe Passage MESC-CM bessere Anti-Aging-Effekte im Vergleich zu späten Passage mESCs hat. Die Passage Anzahl von mESCs wurde berichtet, ihr Entwicklungspotenzial 16 und Pluripotenz 17 zu beeinflussen.

Während weitere For...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Forschung wurde von der Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) und dem Medical Research Center-Programm (2015R1A5A2009124) durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung. Diese Forschung wird auch von einem Start-up Betriebskostenzuschuss der Hospital for Sick Children (HK Sung) unterstützt. Wir möchten, dass Laura Barwell und Sarah JS Kim für ihre hervorragende Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts und Dr. Andras Nagy für die Bereitstellung der G4 MESC Linie zu danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMInvitrogen#11960-044
FBSInvitrogen#3004433320%, ES-Zellqualität
Penicillin und StreptomycinInvitrogen#1514050 Einheiten/ml Penicillin und 50  mg/ml Streptomycin
L-GlutaminInvitrogen#250302  mM
Nichtessentielle Aminosäuren (NEAA)Invitrogen#11140100  &Mikro; M
β-mercaptoethanol Sigma#M3148100  &Mikro; M
Leukämie-Hemmfaktor Millipore#ESG1107100 Einheiten/ml
OPTI-MEMInvitrogen#22600
X-gal Sigma#B42521 mg/ml
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP61483,70%
Dimethylformamid (DMF)Sigma#D4551
KaliumferricyanidAldrich#4559465 mM
KaliumferrocyanidAldrich#4559895 mM
NaClSigma#S7653150 mM
MgCl2Sigma#M23932 mM
Mitomycin CSigma#M428710  &Mikro; g/ml
Propidiumiodid Sigma#P417050  &Mikro; g/ml
TRIzolAmbion#15596018
M-MLV reverse Transkript-TasePromega#M170B
Power SYBR Green PCR Mastermix Angewandte Biosysteme#4367659
HDFs, NHDF-Ad-der-Fibroblasten LONZA#CC-2511
FlaschenaufsatzfilterCorning#4305130.2 μ m

Referenzen

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Maus embryonale Stammzellenserumfreie Kulturfeederfreies konditioniertes MediumSeneszenz assoziierter Beta Galaktosidase Assaydurchflusszytometrische Analysequantitative Reverse Transkriptase PCRhumane dermale FibroblastenZellzyklusanalyseRNA ExtraktionskitReal Time PCR Ger t

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