Die Verwendung eines Monozyten einschichtiges Assay Fcy rezeptorvermittelte Phagozytose zur Bewertung

Der Monozyten-Monolayer-Assay (MMA) ist ein In-vitro-Assay, der ursprünglich entwickelt wurde, um Bluttransfusionsergebnisse bei Patienten mit Auto- oder Alloantikörpern gegen rote Blutkörperchen (RBCs)^1-5 besser vorherzusagen. Durch die Bewertung der Wirkung von Anti-Erythrozyten-Antikörpern bei der Vermittlung von Fcγ-Rezeptor (FcγR)-vermittelter Phagozytose unter Verwendung dieses In-vitro-Assays ist es möglich, das klinische Ergebnis in vivo vorherzusagen. In der Tat wurde das MMA erfolgreich eingesetzt, um eine Immunzerstörung von antikörpergebundenen Erythrozyten zu vermeiden, trotz der Transfusion von serologisch inkompatiblem Blut⁵. Das typische Verfahren vor der Transfusion für Kompatibilitätstests, auch Crossmatching genannt, umfasst serologische Methoden, die die Typisierung des Blutes des Patienten auf ABO- und Rh-Antigene und das Screening auf das Vorhandensein von Anti-Erythrozyten-Antikörpern beim Patienten^{umfassen 6}. Es wird Blut selektiert, das auf ABO/Rh abgestimmt ist, und wenn Antikörper vorhanden sind, wird versucht, diese zu identifizieren, damit das Blut für die Transfusion weiter ausgewählt werden kann, um diese Antigene zu vermeiden. Ein ideales Crossmatch-Ergebnis tritt auf, wenn das gesamte Spenderblut serologisch mit dem Blut des Patienten kompatibel ist, was das Risiko einer Hämolyse nach der Transfusion verringert⁷. Dieses System ist jedoch für die kleine Gruppe von Patientinnen, die nach wiederholter Transfusion oder Schwangerschaft alloimmunisiert wurden, unzureichend. Diese Patienten produzieren Alloantikörper gegen spezifische Erythrozytenantigene. Einige produzieren Antikörper gegen Antigene, die in der Allgemeinbevölkerung sehr häufig vorkommen, und werden daher zunehmend schwieriger zu kreuzen^8,9. Erschwerend kommt hinzu, dass nicht alle Alloantikörper klinisch signifikant sind; Mit anderen Worten, die Bindung eines Alloantikörpers an Erythrozyten, die durch einen serologischen Test nachgewiesen werden, führt nicht unbedingt zu einer Hämolyse, wenn antigenpositives, inkompatibles Blut transfundiert wird. Das MMA wurde ursprünglich entwickelt, um die potenzielle klinische Bedeutung von serologisch inverträglichem Blut in einem Transfusionssetting^1-5 zu bewerten.

Da bekannt ist, dass die extravaskuläre Hämolyse von Antikörper-gebundenen Erythrozyten durch das mononukleäre Phagozytensystem vermittelt wird, werden primäre Monozyten/Makrophagen bei der Entwicklung von diagnostischen Assays verwendet. Der erste Assay zur Untersuchung der Interaktion von Monozyten, Erythrozyten und Antikörpern wurde 1975 veröffentlicht, aber die verwendeten suboptimalen Bedingungen führten nur zur Rosettenbildung (der Bindung von Erythrozyten an die Peripherie des Monozyten), und es wurde keine Phagozytose beobachtet¹⁰. Signifikante Modifikationen am Assay wurden von mehreren Gruppen vorgenommen, was zu einem Assay führte, bei dem der Grad der Phagozytose von Alloantikörper-gebundenen Erythrozyten mit dem klinischen Ergebnis der Hämolyse^1-5 korreliert werden konnte. Kürzlich wurden die optimalen Lagerbedingungen klinischer Proben und die weitere Optimierung der Assay-Bedingungen untersucht, um den Nutzen eines klinischen MMA-Crossmatches mit autologen Patientenproben zu erhöhen¹¹.

Drei weitere diagnostische Techniken wurden neben dem MMA zur Vorhersage von Transfusionsergebnissen eingesetzt: der ⁵¹Cr Freisetzungstest, der Rosettentest und der Chemilumineszenztest (CLT). Im 51-Cr-Freisetzungstest werden ^{dem Patienten 51}Cr-markierte Spender-Erythrozyten injiziert, und die Halbwertszeit der markierten Erythrozyten wird überwacht und ist prädiktiv für das Überleben oder die Clearance nach der Transfusion^12,13. Da bei dieser Methode radioaktive Materialien verwendet werden, wird sie nur noch selten durchgeführt. Der Rosettentest umfasst das Mischen und Inkubieren von Monozyten mit Erythrozyten und die Quantifizierung des Grades der Rosettenbildung (ohne Phagozytose)¹⁴. Die klinische Bedeutung von Antikörpern in vivo beinhaltet die aktive Phagozytose durch Makrophagen, die in der Milz und/oder der Leber vorkommen; Daher liefert diese Methode keine relevante Auslesung der Phagozytose. Das CLT verwendet Luminol, um den oxidativen Ausbruch während der Monozyten-Phagozytose von Erythrozyten zu überwachen, da Luminol blau fluoresziert, wenn es im Phagosom^{oxidiert wird 15}. Diese Methode ist gut, aber eine Kontamination durch Neutrophile kann die Auslesung verwirren. Parallele Vergleiche wurden durchgeführt, um die Sensitivität, Praktikabilität und Reproduzierbarkeit der vier verfügbaren Methoden zu bewerten, und sowohl die CLT als auch die MMA wurden als überlegen^{eingestuft 16}. Das CLT wurde jedoch hauptsächlich zur Beurteilung der hämolytischen Erkrankung des Fötus und des Neugeborenen (HDFN) eingesetzt, und der optimale pH-Wert des Assays von 8,0 könnte das Niveau der Phagozytose beeinträchtigen¹¹.

Zusätzlich zu seinem diagnostischen und klinischen Nutzen wurde das MMA für andere Forschungszwecke modifiziert. In der Tat kann das MMA nicht nur als funktioneller Assay dienen, um Diskrepanzen zwischen Serologie und Biologie zu beheben, sondern wurde auch verwendet, um retrospektiv die Ursache der Hämolyse nach intravenöser Immunglobulin-Therapie (IVIG) zu untersuchen¹⁷. Es wurde auch verwendet, um die Struktur-Funktion chemischer Inhibitoren der FcγR-vermittelten Phagozytose^18-20 zu untersuchen und die nachgeschaltete Signalübertragung der FcγR-vermittelten Phagozytose^{zu untersuchen 21}. In unserem Labor entwickeln wir neben der Verwendung eines humanen MMA auch ein murines MMA unter Verwendung primärer mononukleärer Zellen (PBMCs) des peripheren Blutes (PBMCs) der Maus und autologen Erythrozyten. Der Grundgedanke besteht darin, Antikörper zu screenen, die eine FcγR-vermittelte Phagozytose als Zwischenprodukt für die Entwicklung eines in vivo Mausmodells für autoimmune hämolytische Anämie (AIHA) induzieren können (unveröffentlichte Daten). Die verschiedenen Modifikationen konzentrieren sich auf unterschiedliche Aspekte der IgG-Antikörper- und FcγR-Interaktion, die die Phagozytose induzieren.

Holen Sie die Genehmigung für die Verwendung von menschlichen Proben von der Forschungsethikkommission / Institutional Review Board, und zu erhalten unterzeichnet Zustimmung von allen menschlichen Spendern. Die MMA kann auch als menschliche Test in ähnlicher Weise mit der Maus PBMCs durchgeführt werden, nach Genehmigung durch den Tiernutzung Ethik. Die MMA nutzt aseptischen Gewebekulturtechniken.

HINWEIS: Siehe Abbildung 1.

Hinweis: Obwohl wir die Verwendung eines Level 2 biocontainment Schrank während des Tests empfehlen aseptischen Bedingungen zu erhalten, da das Verfahren nur eine "kurzfristige" Kulturverfahren ist, gibt es nicht wirklich genug Zeit für die Bakterien den Test zu verunreinigen. Daher wird, wenn ein Level-2 biocontainment Schrank nicht existieren, sondern als ein nur kaufen, für diesen Test, könnte der Test außerhalb eines biocontainment Schrank durchgeführt werden, auf einer offenen Bank. Die Verwendung eines 37 ° C - Inkubator mit 5% CO _2, jedoch ist keine Option und muß verwendet werden ,optimale Ergebnisse.

1. Pbmc Isolation

1. Erhalten menschlichem Vollblut von einem gesunden Spender oder einen Patienten über Venenpunktur mit Vacutainer haltige Säure-Citrat-Dextrose (ACD) Antikoagulans (gelb-Top-Rohre).
   HINWEIS: Vollblut kann in ACD bei Raumtemperatur (18-22 ° C) für bis zu 36 h gelagert werden , bevor ¹¹ zu dem nächsten Schritt fortgefahren wird . Normalerweise sind Oktober 1-02 ml-Vacutainer-Röhrchen Vollblut für den Test ausreichend.
2. Verdünne das Vollblut 1: 1 v / v in warmem komplettem RPMI-Medium (RPMI-1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 20 mM HEPES und 0,01 mg / ml Gentamicin).
3. Isolieren einkernigen peripheren Blutzellen (PBMCs) aus dem verdünnten Vollblut Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung, wie vom Hersteller empfohlen (siehe Materialliste). Schicht, die das verdünnte Blut sehr langsam über den Dichtegradienten (erwärmt auf Raumtemperatur 18-22 ° C).
   HINWEIS: Minimieren Sie die Menge von mixifür die optimale Trennung von Blut an der Schnittstelle ng durch sorgfältig die Blutmischung in tropfenweise Schichtung oder durch eine Pipette.
   1. Lassen Sie das Blut Mischung langsam auf die Oberseite des Dichtegradienten Schicht über durch die Pipettenspitze nahe dem Dichtegradienten platzieren und durch die Blut-Gemisch ermöglicht die Seite des Rohres sehr langsam abzulaufen.
   2. Je nach Umfang des Experiments Schicht 10 ml Blut Mischung oben auf 3 ml Dichtegradienten (in einem 15-ml-Röhrchen) oder Schicht 35 ml Blut Mischung oben auf 15 ml Dichtegradienten (in einem 50-mL Tube). Typischerweise wurden 10 ml Vollblut ergibt 10.000.000 PBMCs mit einiger Spender zu Spender Variation.
      HINWEIS: Es ist sehr wichtig, dass es keine Vermischung der mit dem Dichtegradienten Blut-Gemisch ist. Die Blutmischung sollte die Dichte Gradientenschicht über und langsam ansteigen, bis das gesamte Blut auf der Oberseite des Dichtegradienten ist.
   3. Zentrifugieren der geschichteten Mischung bei 700 × g für 30 Minuten ohne Bremsen. Die centrifuged Mischung sollte in fünf Schichten trennen (von oben nach unten): Plasma, Buffy-Coat (mit PBMCs), Dichtegradientenmaterial, Granulozyten und roten Blutkörperchen.
   4. Zu entfernen und die Mehrheit der Plasma verwerfen und Abrufen sorgfältig die buffy coat (PBMC) Inhalt in eine neue 15-ml-Röhrchen mit einer Pasteurpipette und einen Saugball verwenden.
      HINWEIS: Die Entfernung der buffy coat-Schicht wird durch Aufbringen Saugwirkung am Pasteur-Pipette effektiv durchgeführt, während eine kreisförmige Bewegung um die Außenseite der Schicht durchgeführt wird, mit der Spitze der Pipette gegen das Rohr.
4. Waschen Sie die isolierten PBMCs dreimal in pH 7,3 Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), indem bei 350 × g für 10 min (mit voller Bremsen) zwischen Wäschen Zentrifugieren. Die Rekonstitution der PBMC Pellet in komplettem RPMI-Medium. Abhängig von der Größe des Pellets, 3-7 ml Medium ausreichend.
5. Zählen Sie die PBMC mit Trypanblau und einer Zählkammer. Nur diejenigen Zellen zählen, die durch die Trypanblau nicht gefärbt sind. Reconstitute die PBMCs bis 1.750.000 Zellen / ml in komplettem RPMI-Medium.
6. Seed 400 & mgr; l (700.000 Zellen) in jede Vertiefung einer 8-Kammer-Folie. Inkubieren der Objektträger in einem 37 ° C, vollständig befeuchteten Gewebekultur - Inkubator für 1 h (mit 5% CO ₂ ergänzt) werden die Monozyten / Makrophagen anhaften zu ermöglichen.

2. Vorbehandlung von anhaftendem Monozyten

HINWEIS: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn der Suche nach Möglichkeiten Phagozytose zu hemmen oder zu verstärken.

1. Vorzubehandeln geklebt Monozyten bei jedem Medikament (en) oder Verbindung (en) von Interesse. Die Rekonstitution der Droge (n) oder andere Testmaterial zu dem RPMI-Medium mit kompletten gewünschte Konzentration.
   HINWEIS: beispielsweise 200 & mgr; g / ml IVIG wird typischerweise verwendet, um eine 95-100% ige Hemmung der Phagozytose zu erhalten, wenn die menschliche Monozyten verwendet.
2. Absaugen und den Überstand verwerfen jegliche nicht-haftenden Zellen aus der 8-Kammer Folie, nach der 1-stündigen Inkubation, die (nach dem Schritt 1.6). Ersetzen Sie es mit 400& mgr; l eines Arzneimittels oder einer anderen Behandlung und Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
   1. Beim Ansaugen und Lösungen in der 8-Kammer Schieber ersetzen, stellen Sie sicher, den Fluss der Flüssigkeiten zu kontrollieren, so dass schwach anhaftenden Zellen heben nicht ab. Auch die Arbeit mit nur 2-3 leeren Brunnen zu einer Zeit und vermeiden die Brunnen trocknen.
      HINWEIS: In der Regel jede Behandlung in technischen dreifacher Ausführung durchgeführt wird.

3. Opsonisierung von R ₂ R ₂ Rote Blutzellen

HINWEIS: Die R ₂ R ₂ hier verwendet werden , von der Blutentnahme Center (Canadian Blood Services) erhalten, aber sie sind auch im Handel erhältlich. Opsonisiertem R ₂ R ₂ RBCs werden als positive Kontrolle für FcyR-vermittelte Phagozytose verwendet. Naïve R ₂ R ₂ sollte in Alsever Lösung aufbewahrt werden (zur Verlängerung der Haltbarkeit verlängern) bei 4 ° C für bis zu 1 Monat. Alsever-Lösung im eigenen Haus hergestellt und besteht aus 0,8% W / v Trinatriumcitrat (Dihydrat), 1,9% w / v Dextrose, 0,42% w / v Natriumchlorid und 0,05% w / v Citronensäure (Monohydrat). Wenn R ₂ R ₂ Zellen nicht vorhanden sind , andere Rh-phänotypisiert Zellen, wie R ₁ R _2, R ₁ R _1, R ₁ R oder R ₂ r, können verwendet werden.

1. Wasch R ₂ R ₂ (CDE / cDE) roten Blutzellen in PBS insgesamt dreimal bei 350 xg für 5 min unter Verwendung jeder Zentrifugation.
   HINWEIS: Die Menge der roten Blutkörperchen benötigt wird, hängt von der experimentellen Größe und kann zurückgerechnet werden. Immer waschen eine überschüssige Menge an RBCs, da RBCs bei jeder Wäsche aufgrund der Lyse oder während der Entfernung des Überstandes verloren gehen. Beispielsweise in einem Experiment mit 5 Behandlungen und 2 Kontrollen, die alle in der technischen Triplikaten durchgeführt, gibt es insgesamt 21 Vertiefungen. 21 Vertiefungen mit 400 ul / Vertiefung von 1,25% RBC Gemisch zeigt an, dass 105 & mgr; l gepackte, opsonisiertes RBC benötigt. 200 & mgr; l RBC sollte zunächst gewaschen und 150 & # werden181; L sollte sicherstellen, opsonisiertes werden, dass es eine ausreichende Menge an RBCs für die Phagozytose Schritt.
2. Opsonisieren des gewaschenen R ₂ R ₂ Pellet mit 1: 1 v / v polyklonalen Anti-D - Antikörper aus menschlichem Serum und Inkubation für 1 h bei 37 ° C, mit intermittierendem Mischen.
   HINWEIS: Wenn polyclonale anti-D-Antikörper nicht vorhanden sind, ist es möglich, monoklonale Anti-D-Antikörper zu verwenden, die im Handel erhältlich sind, oder Anti-D, die normalerweise für Rh Immunprophylaxe verwendet wird, die von Blutbanken oder Transfusion erhalten werden kann, Dienstleistungen. Optimierungstests sollten am Anfang durchgeführt werden, wenn der Test einrichten, und wenn viele un-Titer bestimmt polyklonalen Antikörpern oder Umschalten auf einen monoklonalen Antikörper, umgeschaltet wird. Dies ist die optimale Konzentration oder das Volumen der anti-D für ein Antiglobulin-Test (IAT) Ergebnis zwischen 3+ und 4+ und Phagozytose Ergebnis zwischen 70-90 phagozytierten RBCs pro 100 Monozyten gezählt erforderlich zu identifizieren.
3. Waschen Sie die opsonisierend R ₂ R ₂ insgesamt dreimal in PBS unter Verwendung von Zentrifugation bei 350 xg für 5 min je.
   HINWEIS: Erfolgreiche Opsonisierung von R ₂ R ₂ kann durch die Durchführung einer indirekten IAT bestätigt werden. Kurz gesagt, sind sekundäre polyklonalen anti-human-Antikörper hinzugefügt primäre opsonierende Antikörper auf RBC Oberflächen zu binden, und das verstärkte Signal kann in Form von Hämagglutination beobachtet werden. Eine detaillierte Hersteller-Protokoll kann in der ergänzenden Materialien Datei.
4. Rekonstituieren des gewaschenen R ₂ R ₂ Pellet auf 1,25% v / v mit kompletten RPMI Medium.
   HINWEIS: Überschüssiges opsonisiertem R ₂ R ₂ kann für bis zu einer Woche in Alseversche Lösung bei 4 ° C gelagert werden.

4. Fc-Rezeptor-vermittelte Phagozytose

1. Aspirieren das Medikament oder mittlerer Überstand aus dem 8-Kammerobjektträger und füge 400 & mgr; l der 1,25% v / v R ₂ R ₂ -Gemisch. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h.
2. Achterner 2 h Inkubation, entfernen Sie die Kammern des Herstellers Adapter verwenden. Dab Überschuss R ₂ R ₂ auf einem Papiertuch ab. Stellen Sie sicher, dass der Schieber nicht austrocknet.
3. Füllen Sie einen 100-ml-Becher mit PBS. Versenken und waschen Sie die Folie langsam den Schlitten zurück zu bewegen und her (um 30-40 Schläge) ₂ die Mehrheit der un-phagocytosed R ₂ R zu entfernen.
4. Entfernen Sie die Folie aus der PBS. Abtupfen überschüssige PBS mit einem Papiertuch oder einem Gewebe und der Luft trocknen Sie die Folie.
5. Fixieren Sie die luftgetrockneten Objektträger in 100% Methanol für 45 s. Dann Luft trocknen die feste Folie.
   HINWEIS: Die Objektträger fixiert werden kann andere Methode verwendet , die mehr kompatibel für Downstream - Färbung, wie beispielsweise die Grünwald-Giemsa - Färbung ²¹ oder der Wright-Giemsa - Färbung ²² ist.
6. Montieren Sie die Folie unter Verwendung eines in-house-made Elvanol Eindeckmediums (oder einem anderen handelsüblichen Montagemedium) und fügen Sie Deckgläser.
   HINWEIS: Elvanol Befestigungsmedium von 15% w / v po bestehtlyvinyl Alkoholharz und 30% v / v Glycerin in PBS. Die Mischung wird erhitzt, bis das gesamte Harz gelöst hat, und das Glycerin homogen vermischt. Dies kann mit anderen handelsüblichen Montagemedium ersetzt werden.
7. Lassen Sie die Halterung über Nacht vor der Quantifizierung zu trocknen.

5. Quantifizierung von Phagocytose

1. Unter Verwendung eines Phasenkontrastmikroskop und einem 40X Objektiv, quantifizieren manuell die Menge an phagozytischen Ereignisse von mindestens 200 Monozyten zu zählen und die Anzahl der phagozytierten R ₂ R ₂ innerhalb dieser Monozyten. Haben einen Zähler in jeder Hand , um gleichzeitig die Anzahl der Monozyten und die Anzahl der phagozytierten R ₂ R ₂ quantifizieren.
2. Besorgen Sie sich die durchschnittliche phagozytische Index durch die Anzahl der Phagozytose von R ₂ R ₂ durch die Anzahl der Monozyten Dividieren und Multiplizieren mit 100 Express die Daten als Mittelwert (Durchschnitt phagozytische Index) ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM).

Durch Befolgen der entscheidenden Schritte in Figur 1 und dem oben beschriebenen Verfahren kann das MMA reproduzierbar durchgeführt werden. IVIG wurde als Beispiel für die Hemmung der Phagozytose in Figur 2 verwendet. IVIG ist bekannt, die Fc-Rezeptoren zu binden und blockieren, wodurch das Downstream-Ergebnis der Phagozytose hemmen. Durch Titration der Menge von IVIG verwendet, eine dosisabhängige Hemmung beobachtet wird , in welchen Konzentrationen oberhalb von 200 pg / ml in der Nähe führte zu 100% ige Hemmung und Konzentrationen von weniger als 0,5 g / ml hemmte nicht (2A). Wenn die phagozytischen Indizes werden transformiert und normiert auf die R 2 R 2 positive Kontrolle als 0% Hemmung, eine Hemmkurve mit einem IC 50 von 3 & mgr; g / mL (2B) bestimmt werden kann.

Zusätzlich zu den Assays konsequent durchführen, quantification des Assays kann manchmal schwierig sein. Figur 3 ist eine Sammlung von Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen von verschiedenen MMA Dias. Mit Mikroskopie Erfahrung kann man ein Monozyt aus einer kontaminierenden RBC (3D) oder ein von einer Vakuole phagozytierten RBC (3B) unterscheiden. Dichtes Cluster von Zellen und / oder Ablagerungen sollten während Quantifizierung (Figuren 3E und F) vermieden werden. Auch sollte man vermeiden , über opsonisierenden die R 2 R 2 RBC, die zu einem erhöhten Phagozytose führen würde, die die Monozyten Interieur und stört die genaue Quantifizierung (3C) overcrowds.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des MMA. Ein Schritt-für-Schritt-Darstellung der entscheidenden Schritte bei der MMA: PBMC aus Vollblut zu isolieren, um das anhaftende monocyt Einspeisenes mit opsonisiertem R 2 R 2, und die Kammer gleitet waschen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Die intravenöse IgG (IVIG) hemmt Phagozytose in vitro die MMA mit. IVIG ist bekannt Phagozytose zu hemmen und als Inhibitionskontrolle im menschlichen MMA verwendet. (A) Titration von IVIG führte zu einer dosisabhängigen Hemmung der Phagozytose verglichen , wenn mit dem unbehandelten R 2 R 2 Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) von n = 3 Experimenten. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des Student t - Test durchgeführt: ** p ≤ 0,01 und *** p ≤ 0,001. (B) Hemmung Kurve von IVIG mit einem IC 50 of 3 & mgr; g / ml (gepunktete Linie). Die Ergebnisse zeigen , Daten normalisiert zu unbehandelten R 2 R 2 (0% Hemmung); Mittelwert ± SEM von n = 3 Experimenten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Phasenkontrast - Mikroskopie - Aufnahmen von Musterfolien unter Vergrößerung 40X. (A) Die perfekte Folie in dem die Monozyten phagozytiert 1-2 R 2 R 2 im Durchschnitt (schwarze Pfeile mit einem unverwechselbaren Halo leuchten), mit sehr wenigen verunreinigenden, un phagozytierte R 2 R 2 in den Hintergrund (weiße Pfeile). (B) Wie in dieser Folie gezeigt, manchmal Monozyten haben vergrößert Vakuolen (weiße Pfeile), die für phagozytierten R 2 R 2 verwechselt werden können. (C </ strong>) Wenn R 2 R 2 haben over-opsonisiertes, mehr als 4-5 phagozytiert R 2 R 2 pro Monozyt (schwarze Pfeile) rendern genaues Zählen schwierig, da 2 der R 2 R innerhalb der Monozyten- und verschiedene Zell gedrängt werden Grenzen können nicht unterschieden werden. (D) Eine unzureichende Waschen des Schiebers führt zu reichlich R 2 R 2 Verunreinigung (weiße Pfeile), die eingehalten RBCs verwechselt werden könnte. (E) Manchmal, Monozyten und kontaminierenden RBCs können Cluster bilden. Cluster zeigen auch bakterielle Kontamination, die vermieden werden sollten. (F) Monocyten können größere Aggregate bilden, die während der Quantifizierung sollte vermieden werden. Mit zufällige Auswahl der Felder anzuzeigen, ist Feld A, was in der Regel, wenn der MMA beobachtet wird ordnungsgemäß durchgeführt wurde. Maßstabsbalken ist 20 & mgr; m. Klicken Sie bitte hiereine größere Version dieser Figur zu sehen.

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