In Situ Erkennung und Quantifizierung der einzelnen Zelle von Metall-Oxid-Nanopartikel mit nuklearen Mikrosonde Analyse

Zusammenfassung

Wir beschreiben Sie ein Verfahren zur Detektion von chemischen Elementen vorhanden in Situ in menschlichen Zellen sowie deren Quantifizierung in Vitro . Die Methode eignet sich gut für jeden Zelltyp und eignet sich besonders zur quantitativen chemischen Analyse in einzelnen Zellen nach in-vitro- Metall-Oxid-Nanopartikel-Exposition.

Zusammenfassung

Mikro-analytischen Techniken, basierend auf chemischen Elements Bildgebung ermöglichen die Lokalisierung und Quantifizierung der chemischen Zusammensetzung auf zellulärer Ebene. Sie bieten neue Möglichkeiten zur Charakterisierung von lebenden Systemen und eignen sich besonders für die Erkennung, Lokalisierung und das Vorhandensein von Metall-Nanopartikeln in biologischen Proben und die Umwelt zu quantifizieren. In der Tat erfüllen diese Techniken alle relevante Anforderungen im Hinblick auf (i) Empfindlichkeit (von 1 bis 10 µg.g^-1 Trockenmasse), (Ii) Mikrometer Bereich Ortsauflösung und (Iii) Multi-Element-Erkennung. Angesichts dieser Merkmale, Microbeam Chemisches Element Bildgebung kann kraftvoll ergänzen routinemäßige bildgebende Verfahren wie z. B. optische und Fluoreszenz-Mikroskopie. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine nukleare Mikrosonde Analysen auf kultivierten Zellen (U2OS), Titandioxid-Nanopartikeln ausgesetzt. Zellen müssen wachsen auf und direkt in eine speziell entwickelte Probenhalter auf das optische Mikroskop verwendet und in der nuklearen Mikrosonde Analyse ausgesetzt werden. Sprung-Freeze kryogenen Fixierung der Proben bewahrt die zelluläre Organisation und den chemischen Elementeverteilung. Gleichzeitige nuklearen Mikrosonde (Scan Transmissions-Ion-Mikroskopie, Rutherford backscattering Spectrometry und Partikel induzierte Röntgenemission) durchgeführte Analyse auf die Probe enthält Informationen über die zelluläre Dichte, die räumliche Verteilung von die chemischen Elemente, als auch die zelluläre Inhalt von Nanopartikeln. Es gibt ein wachsender Bedarf für solche analytischen Werkzeuge innerhalb der Biologie, insbesondere der aufstrebenden Nanotoxikologie und Nanomedizin, wofür unser Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln und biologischen Proben vertieft werden muss. Insbesondere, wie nukleare Mikrosonde Analysen keine Nanopartikel gekennzeichnet zu werden erfordert, sind Nanopartikel Häufigkeiten quantifizierbare bis auf die einzelne Zellenebene in einer Zellpopulation, unabhängig von ihrer Oberflächenzustand.

Einleitung

Zelluläre Homöostase richtet sich nach der Aufnahme kontrollieren, Assimilation und intrazelluläre Lokalisation der verschiedenen Spurenelementen (Ionen, Metalle, exogene anorganischen Verbindungen). Diese Komponenten sind häufig in Form von Spuren, aber dennoch möglicherweise erhebliche Auswirkungen in der System-Physiologie. Somit ist die Studie der Zellbiochemie in normalen und pathologischen/betonte Situationen ein Schlüssel-Schritt, ein allgemeines Verständnis der zellulären metabolischen Mechanismen. Daher wird die Entwicklung der Bildgebung und analytische Techniken ermöglichen die Untersuchung der intrazellulären chemischen Häufigkeiten, Aufbauorganisation und ihre damit verbundenen Stoffwechselfunktionen erforderlich. Sehr wenige Methoden sind in der Lage, eine in Situ quantitative Stück von Informationen über die insgesamt chemische Natur von einer Probe. Neben Methoden analysieren Proben in loser Form, in Situ Analysen betrachten biologische Proben in ihrer Vollständigkeit ohne Masse und strukturellen Informationen und bewahrt somit ihre konstituierenden Chemikalien (Spurenelemente und Ionen) und Proteine. Darüber hinaus wie die Nanowissenschaften ständig weiterentwickeln, werden verbesserte Bildgebung und analytischen Methoden zur Überwachung der Umwelt auf der zellulären Ebene notwendig sein, zu beobachten und zu quantifizieren, Nano-Objekt Verhalten und Interaktionen. ¹

Nanopartikeln (NPs) wurden als Objekte ausstellen mindestens eine Gesichts Dimension im Bereich 1 und 100 nm definiert. ² aufgrund ihrer besonderen physikalisch-chemischen Eigenschaften NPs ausgiebig in der Industrie verwendet werden. NPs sind in Bio-Anwendungen und Nanomedizin beschäftigt. ^{3 , 4} trotz der zahlreichen physikalisch-chemischen Eigenschaften von NPs, können sie einige Risiken von Nebenwirkungen auf die menschliche Gesundheit und Umwelt erzeugen. Diese Risiken können durch längere und wiederholte Exposition mit verschiedenen Konzentrationen induziert werden, und dies ist noch nicht eindeutig geklärt. ^{5 , 6 , 7 , 8} vor allem das Schicksal des NPs im Inneren der Zellen und der damit verbundenen zellulären Antworten sind bis heute nicht vollständig beschrieben. Dies ist zum Teil aufgrund der Knappheit der Methoden, mit denen die Erkennung und Quantifizierung von verinnerlichten NPs in einer einzelnen Zelle. ⁹

Die klassischen analytischen Werkzeuge zur Schätzung die zelluläre Dosis von Nanopartikeln sind Microscopies, Massenspektrometrie (MS), gekoppelt induktiv Plasma MS (ICP-MS)^10,11 und Flüssigchromatographie bieten MS (LC-MS), sondern sie nur nützliche Informationen auf der makroskopischen Skala. Keiner von ihnen kann eine genaue Auswertung der subzellulären NPs-Inhalt noch die NPs-Verteilung ohne den Einsatz der Fraktionierung Methoden bereitstellen. Eine systematische Bewertung der Dosis-Wirkungs-ist somit unmöglich mit diesen Methoden, im Gegensatz zu Methoden der Atomspektroskopie wie nukleare Mikrosonde Analyse^12,13, Synchrotron-Röntgen-Fluoreszenz-Mikroskopie¹⁴ , und sekundären Ionen-Massenspektrometrie (SIMS). ^{15 , 16} diese Methoden sind besonders interessant, da sie Beobachtungen mit Fluoreszenz-Mikroskopie ergänzen, insbesondere wenn NPs können nicht mit fluoreszierenden Molekülen gekennzeichnet werden und sind somit in ihrem nativen Zustand untersucht. Zu einem gewissen Grad auch bei NPs mit Fluorophore, gepfropft sind bleibt (i) Quantifizierung schwierig weil das tagging Niveau pro NP unbekannt ist und (Ii) die chemische Modifizierung der Oberfläche NP kann die zelluläre Verteilung ändern.

In diesem Artikel wir konzentrieren uns auf eine Methode basiert auf einer Kombination von nuklearen Mikrosonde Techniken mit dem Ziel die Morphologie und die elementare Zusammensetzung von biologischen Proben in Dur, Moll, imaging und Konzentrationen zu verfolgen.

Nukleare Mikrosonde Analyse erweist sich als besonders geeignet für die Messung von chemischen Spurenelementen in biologischen Geweben. Der Strahl laterale Auflösung (0,3 bis 1 µm) und die Empfindlichkeit in Chemisches Element Erkennung (von 1 bis 10 µg.g^-1 Trockenmasse) eignen sich gut für Studien auf zellulärer Ebene. Nukleare Mikrosonde Techniken basieren auf Partikel Detektion (Photonen, Elektronen, Ionen) ausgegeben, nachdem der Ionenstrahl (in der Regel läuft bei MeV Energien) Atome in der Probe vorhanden interagiert. Interaktionen, die in Zellen sind vor allem: 1) Anregung/Ionisation von Atomen, gefolgt von einer Emission von Photonen nach Rückkehr Atome in ihren grundlegenden Zustand; und 2) Diffusion von eingehenden Teilchen führt, um in ihrer Energie und Richtung zu ändern. Die Messung der emittierten Teilchen Energie Allowsthe Identifikation von Atomen an der Interaktion beteiligten. Um die Zuordnung der Elemente ausführen, wird die Ionen-Microbeam wiederholt über die Probenoberfläche oft auf einer Fläche von ca. 100 x 100 µm² mit mehreren Zellen gescannt. Emittierten Partikel werden erkannt und ihre Energie für jede Strahllage aufgezeichnet. Sortierung der Partikel nach der Strahllage, ist identifiziert die Struktur verantwortlich für die Emission solcher Partikel das Ziel der Datenverarbeitung. Hier beschreiben wir präzise Umsetzung beruht auf Fluoreszenz-Mikroskopie und nukleare Mikrosonde Analysen zu erkennen sowie exogene NPs bei der zellulären und subzellulären Maßstäben zu quantifizieren, um die Folgen der NP Interaktionen mit lebendigen untersuchen Systeme. Wir sind besonders auf die Möglichkeiten dieser Methode in Bezug auf in Situ Quantifizierung von Titandioxid-Nanopartikeln (TiO₂ NPs) Aggregaten auf der subzellulären Ebene konzentrieren.

Protokoll

(1) Inhaber der Probenvorbereitung

1. Sample-Halter-Design und Vorbereitung
   1. Fertigen Sie einen Probenhalter durch ein 5 x 5 mm Quadrat in einem 1 mm dicken PEEK Rahmen bohren.
   2. Reinigen durch Spülen mit Ethanol 70 % (V/V) und halten in sterilen Platten bis zum Gebrauch.
      Roman Ein Probenhalter für Zellkultur und Zelle Handhabung geeignet ist erforderlich. Es muss für Zelle Kultivierung, in-vitro- Beobachtungen mit optischen Mikroskopie und nukleare Mikrosonde Analysen und Bildgebung entwickelt werden. Dieser Halter ist ein PEEK Frame¹³gemacht.
2. Probenvorbereitung-Halter
   1. Bereiten Sie die Formvar-Lösung von 1 mg Formvar Pulver in 100 mL Chloroform auflöst.
   2. Stretchfolie das Polycarbonat auf einem Metallrahmen, dass es keine Falte präsentiert.
   3. Verwenden Sie eine sterile Spitze Formvar Lösung um das Probe-Halter-Loch zu verbreiten.
   4. Legen Sie zart der Probenhalter mit Leim auf die gestreckte Polycarbonat-Folie (ein Quadrat von 5 x 5 mm).
   5. Wiederholen Sie die vorherige Sequenz um einen Probenhalter für jedes Replicate vorzubereiten.
      Roman Polycarbonat (PC) Film ist biokompatibel, dick genug und resistent gegen verschiedene Protokolle und analytische Einschränkungen.
      Vorsicht- Chloroform ist giftig. Nicht einatmen, verschlucken oder Hautkontakt. Verwenden Sie immer eine gut funktionierende chemische Dampfhaube und entsprechenden Filtern.
3. Probe-Halter-Sterilisation
   1. Legen Sie die montierten Probenhalter in eine konische Flasche mit 50 mL Ethanol 70 % (V/V) unter Unruhe bei 180 u/min und + 37 ° C über Nacht mit einem Inkubator/Rührwerk.
   2. Spülen Sie den Inhaber in sterilem destilliertem Wasser mehrmals.
   3. Luft trocknen unter sterilen Bedingungen und setzen sie mit UV-Licht (keimtötende Lampe von Biosafety Bank, Klasse II) für 30 min auf jeder Seite.
   4. Halten Sie die Proben in sterilen 12-Well-Platten (eine Probenaufnahme pro Well) erst unmittelbar vor Gebrauch.
      Hinweis: Mehreren Probenhalter können in sterilen und trocken 12-Well-Platten mit Parafilm versiegelt für mehrere Tage bei Zimmertemperatur gespeichert werden.

2. Wachstum von Zellen in der geeigneten Probenhalter.

Vorsicht: Protokoll muss in einer Biosafety Laminar-Flow Bank (Klasse II) auszuschließende kontaminierende Mikroorganismen durchgeführt werden. Antibiotika (z.B. Penicillin, Streptomycin) mit Handschuhen zu behandeln. Respektieren Sie bewährte Methoden beim Umgang mit biologischer Materials (Zell-Linien, genetisch veränderte abgeleitete menschliche Zellen).

Kritisch: die Zelllinien verwendet sollte überprüft werden, um sicherzustellen, dass sie nicht mit Mykoplasmeninfiziert sind.

1. Transfizieren Sie U2OS-Zell-Linie mit Plasmid mit Matrix-RoGFP ^17,18,19 mit einer Transfektion Methode gemäß Protokoll vom Hersteller festgelegten.
2. Zur Transfektion mit dem Plasmid-Bestätigung der Biosensor und um Plasmid Verlust zu verhindern, wählen Sie und pflegen die transfizierten Zellen auf die geeigneten Nährmedium.
3. Visualisieren Sie transfizierte Zellen durch Fluoreszenz-Mikroskopie, um sicherzustellen, dass die Transfektion aufgetreten ist und der Ausdruck der Fluoreszenz und die Anzeige von einem retikuläre und röhrenförmigen mitochondriale Netzwerk¹⁹zu bestätigen.
   Pause Punkt: Seit mehreren Jahren können Zellen in flüssigem Stickstoff eingefroren werden.
4. Verwenden Sie die transfizierten Zellpopulation durch Kultivierung der Zellen in einem geeigneten Medium um Sub konfluierende Zellpopulationen zu erhalten. Wachsen Sie Zellen bei 37 ° C, 5 % (V/V) CO₂ in einer gesättigten Wasser Atmosphäre.
5. Samen Zellen in einer Konzentration, wie sie am Zusammenfluss von 80 % am Tag der Fixierung. In der Regel kann eine Konzentration von 500 Zellen pro Mikroliter verwendet werden. Ernten von Zellen mit 400 µL Trypsin-EDTA 0,25 % (V/V) und halten Sie für 3 min bei 37 ° C. Beenden Sie Trypsin-Aktion mit 1 mL Kulturmedium. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 230 x g und + 4 ° C, überstand zu entfernen, und fügen Sie die gewünschte Lautstärke von frischem Nährmedium.
   Hinweis. Das Protokoll gilt für alle zellulären Arten und die Anzahl der Zellen ausgesät ist abhängig von der Zellengröße und Zelle Verdopplungszeit.
   Vorsicht: Vermeidung von Trypsin, Antibiotika und Serum wiederholte Frost-Tau-Wechseln zu unterwerfen. Halten sie steril. Vorratslösung in Aliquote aufteilen und Einfrieren bei −20 ° C. Speichern Sie die Aliquote bis zum Ablaufdatum. Spülen Sie sorgfältig die Zelle Pellet um die Trypsin vollständig zu entfernen. Spuren der verbleibenden Trypsin werden verzögert und die Beschichtung Effizienz zu verringern.
6. Zählen der Zellen und führen eine Verdünnung mit frischen komplette Nährmedium bei 37 ° C gehalten, um eine Zellsuspension mit 500 Zellen pro Mikroliter zu erhalten.
   Hinweis: Die Konzentration der Zellsuspension muss als eine Funktion des Zelltyps, angepasst werden, um einen Tropfen 40 µL Platte.
7. Einen 40 µL Tropfen auf die Mitte der Folie Polycarbonat-Platte. Legen Sie die Probe für 2 h bei + 37 ° C, 5 % (V/V) CO₂ sorgfältig in einer gesättigten Wasser Atmosphäre.
   Kritische: Sobald die Probe in den Inkubator platziert wird, begrenzen Sie so weit wie möglich jede mechanische Bewegung um schnelle Zellhaftung zu begünstigen. Je nach Zelltyp könnte es Zellen länger als 2 h für optimale Effizienz Plattierung inkubieren erforderlich. Überprüfen Sie, dass die Inkubator Atmosphäre gut gesättigt um zu verhindern, dass Tropfen verdampfen.
8. Überprüfen Sie, dass Zellen auf dem Polycarbonat-Folie mit einem optischen Mikroskop gut verbunden sind. Sanft fügen Sie 2 mL frisches komplette Medium und halten Sie für 24 h.

(3) Nanopartikel Vorbereitung und Exposition

Hinweis: Fluoreszierenden Farbstoff modifiziert TiO₂ NPs wurden entworfen, synthetisiert und chemisch modifiziert mit Tetramethyl Rhodamin erfolgt (TRITC). ^{20 , 21} diese Oberflächenmodifizierung kann Nanopartikel-Erkennung, Überwachung und Lokalisierung in Situ und in Cellulo in Wohn- und festen Zellen oder in mehrzelligen Organismen. ^{12 , 13 , 18}

Vorsicht: Nanomaterialien und Nanopartikel müssen pfleglich behandelt werden. Nicht einatmen, verschlucken oder Hautkontakt. Um die Verbreitung in der Luft zu verhindern, sind Nanopartikel in Lösung (Reinstwasser) gepflegt.

1. Bereiten Sie eine Aussetzung der 1 mg.mL^{−1 TiO}₂ NPs Reinstwasser. Verteilen der TiO₂ NPs mit intensiven 1-min-Beschallung Impulse bei RT (750 W, 20 kHz Amplitude: 30 %) mit Ultraschall-Generator und eine spezielle konische Mikrosonde.
2. Verdünnen Sie TiO₂ NPs in der gewünschten Konzentration in das Kulturmedium, um eine Exposition Aussetzung der 4 µg.cm⁻² (Endkonzentration) zu erhalten. Medium durch das entsprechende Volumen der mittlere mit NPs auf Zellen ersetzen und für die homogene Verteilung des TiO₂ NPs. Prepare Kontrollzellen ebenso ohne Zusatz von TiO₂ NPs vorsichtig mischen.
3. Inkubieren Sie die Zell-Populationen für 24 h bei 37 ° C, 5 % (V/V) CO₂ und Wasser gesättigte Atmosphäre.

(4) Paraformaldehyd Fixierung und Fluoreszenz-Mikroskopie.

1. Bereiten Sie eine frische Lösung von Paraformaldehyd Lösung (PFA, 4 % w/V) im Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gepuffert.
   1. 4 g PFA-Pulver in 100 mL PBS auflösen. Erhitzen Sie die Lösung auf 65 ° C unter Rühren mit einem Magneten und einem Magnetrührer unter einem Abzug. Erhöhen Sie den pH-Wert durch Zugabe von 1 M NaOH einen Tropfen nacheinander, bis die Lösung löscht. Kühlen Sie die Lösung auf Raumtemperatur ab und stellen Sie den pH-Wert auf 7,4. Die frisch zubereitete Lösung sofort einsetzen oder bei + 4 ° C zu halten und vor Licht schützen.
      Hinweis: Vorgefertigte PFA Lösungen könnten verwendet werden, jedoch eine Magistralrezeptur PFA bessere Fixierung Qualität und langfristige Erhaltung der feste Proben garantiert.
      Vorsicht: PFA ist giftig; nicht einatmen, verschlucken oder Hautkontakt. Verwenden Sie immer eine gut funktionierende chemische Dampfhaube und entsprechenden Filtern.
2. Einmal die Inkubationszeit abgelaufen, entfernen Sie das Zellkulturmedium, TiO₂ NPs. Spülen Zellpopulationen einmal mit frischem Nährmedium und einmal mit PBS (2 mL) enthält. Entfernen Sie PBS zu, spülen Sie schnell mit einem aliquoten frisch und kalt PFA (4 % w/V, + 4 ° C).
   1. Fügen Sie PFA (2 mL, 4 % w/V, + 4 ° C). Inkubieren Sie 15 min bei Raumtemperatur.
   2. Entfernen Sie der PFA zu, spülen Sie die Zellen mit PBS (2 mL, 3 Mal, 5 min) unter Rühren.
      Pause Punkt: Diese chemisch festen Proben für den "Sprung-Freeze" Verfahren nach Fluoreszenz imaging (gehen Sie zu Schritt 5) verwendet werden können oder nur für Fluoreszenz-imaging (gehen Sie zu Schritt 4.3) verwendet.
3. Färben Sie den Kern mit Hoechst³³³⁴² Inkubation der Zellen für 10 min in PBS. Hoechst³³³⁴² wird verwendet, um eine Endkonzentration von 500 nM. Nach der Inkubation die Lösung entfernen und Spülen mit PBS.
   Vorsicht: Hoechst³³³⁴² ist Zelle permeationsfähigen und kann giftig sein. Vermeiden Sie direkten Kontakt, und benutzen Sie Handschuhe während der Vorbereitung und Verwendung von Hoechst³³³⁴².
   Kritisch: sorgen dafür, dass die Hoechst³³³⁴² Färbelösung ist frisch zubereitet und in sterilen Bedingungen beibehalten.
4. Prozess feste Proben für in Situ und einzelne Zelle Imaging mit Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 1).

5. "Sprung-Einfrieren" Fixierung und Austrocknung

1. Bereiten Sie eine Aluminiumplatte Übertragung durch Abkühlung in flüssigem Stickstoff. Store die Platte in einen Kasten mit flüssigem Stickstoff gefüllt und die Plattenoberfläche oberhalb der Flüssigkeit im kalten Stickstoff Dampf zu erhalten.
   Hinweis: Die Transferplatte kann jede metallische Platte gemacht werden (hier, wir haben Aluminium verwendet), die Temperatur von flüssigem Stickstoff abgekühlt werden könnte, und das können die Freeze-Trockner Probenkammer eingeben.
   Kritische: Die Box sollte geschlossen so weit wie möglich gehalten werden um zu verhindern, dass Wasser Aufdampfen auf die kalte Plattenoberfläche. Die Probe während der Vorbereitung auf die Platte gespeichert sollten nicht von Flüssigstickstoff erfasst werden.
2. Spülen Sie Zellen einmal im Kulturmedium und dann zweimal mehr, kurz, in sterilen und hochreines Wasser zu bekommen loszuwerden Sie jede Spur von restlichen extrazellulären Salze.
   Kritische: Sicherstellen Sie, dass die Medien sind frisch zubereitet und in sterilen Bedingungen beibehalten. Erhitzen Sie die Medien bei 37 ° C, vor der Verwendung. Die Spülung muss sehr kurz (wenige Sekunden) und die überschüssige Flüssigkeit auf die Proben so schnell wie möglich entfernt.
3. Sprung-Einfrieren der Zellen bei-150 ° C in flüssigem Stickstoff gekühlt 2-Methylbutane während 30 s und Ort übertragen sie auf das Aluminium Platte. Speichern Sie hier Proben während der Vorbereitung aller anderen Proben. Wenn Proben sind alle Cryofixed, All at Once, indem man die Transferplatte in einem Freeze-Trockner zu übertragen.
   Kritische: Der Gesamtprozess Hochdruckgefrierfixierung sollte nicht mehr als 20 Minuten dauern, um zu verhindern, dass strukturelle Änderungen erscheinen in Proben in das Verteilergetriebe zwischengelagert.
4. Die Proben unter Verwendung der folgenden Sequenzen Gefriertrocknen: (1) führen Sie eine primäre Austrocknung für 12 bis 24 h (-99 ° C, 10^-3 Mbar) bei niedrigem Druck und niedriger Temperatur, dann 2) führen Sie eine sekundäre Austrocknung Phase für mindestens 24 h, Erhöhung der Temperatur der Platte zu + 40 ° C unter Beibehaltung des niedrigen Drucks (+ 40 ° C, 10^-3 Mbar).
   Vorsicht: Flüssiger Stickstoff ist extrem kalt und kann dazu führen, dass schwere Erfrierungen oder Auge Schäden bei Berührung. Verwenden Sie angepasste Sitzbank Top Container für den Transport und tragen Sie Sicherheitsausrüstung (Kryo-Handschuhe, Augen-und Gesichtsschutz).
   Vorsicht: 2-Methylbutane ist hochentzündlich. Eine schädliche Verunreinigungen der Luft erreichen Sie ziemlich schnell verdampfen dieser Substanz bei + 20 ° C. Nicht einatmen, verschlucken oder Hautkontakt. Verwenden Sie Atmung und Schutzbrille und Schutzhandschuhe. Verwenden Sie immer eine gut funktionierende chemische Dampfhaube. Kann bei + 4 ° c gelagert werden
   Kritische: Verwenden Sie eine geeignete Thermometer (-150 ° C) 2-Methylbutane Temperaturen während der "Sprung-Freeze" Sitzung überwachen. Die 2-Methylbutane muss in einer flüssigen Phase kühl gehalten werden. Übertragung von Cryofixed Proben auf der Umgebungsatmosphäre verursachen Zellschäden durch Temperaturerhöhung oder Wasserdampf kondensiert auf der Probenoberfläche. Dementsprechend sollte die Überweisung so schnell wie möglich (30 s)
   Pause Punkt: Nach Hochdruckgefrierfixierung können Proben für mehrere Tage in sterilen und trockenen Bedingungen (geschützt vor Staub und Feuchtigkeit) bei Raumtemperatur gelagert werden. Vorsichtig behandeln Sie die Proben mit feinen Zangen und legen Sie sie in eine sterile 12-Well-Platte mit Parafilm versiegelt. Trockenmittel kann verwendet werden, um die Atmosphäre zu trocknen.

(6) nukleare Mikrosonde Analysen

Hinweis: Nukleare Mikrosonde Analysen der Microbeam Linie der AIFIRA (Anwendungen Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions de Région Aquitaine) mit den ergänzenden Ionen-Strahl analytische Techniken Partikel induzierte Röntgenemission (µ-erfolgte zu PIXE) und Übertragung Ion Rasterelektronenmikroskopie (µ-STIM). Die Anlage basiert auf einer 3,5 MV Teilchenbeschleuniger leichte Ionenstrahlen im Bereich MeV Energie zu liefern. ^{22 , 23}

Pause Punkt: AIFIRA ist ein Ion Beam veranstaltet von der Universität von Bordeaux, die einen Zugang zu nationalen und internationalen Teams nach wissenschaftliche Bewertung des vorgeschlagenen Versuchs bietet.

1. Befestigen Sie die PEEK-Probenhalter auf eine gelochte Platte mit doppelseitigem Klebeband.
2. Platzieren Sie die Platte, die Probe in einer vertikalen Ebene senkrecht zur Strahlrichtung zu unterstützen.
3. Schließen Sie die Analyse-Kammer und die Analyse Kammer Vakuum.
4. Übertragung Ion Rasterelektronenmikroskopie (µ-STIM)
   Hinweis: STIM dient zum Aufzeichnen Flächendichte Karten von Zellen nach der Umwandlung der Energieverlust in Zellmasse, unter Ausnutzung der Tatsache, dass die Energieverluste proportional zu der Probe Flächendichte (ausgedrückt in µg.cm^-2).
   1. Verwenden Sie eine 2 MeV Helium (He⁺) Microbeam als eine Sonde mit einer Größe in der Brennebene des rund 300 nm im Durchmesser und niedriger Geläufigkeit (2000 ions.s^-1). Kennzahl der Energie der übertragenen Ionen mit einem planaren Silizium-Detektor (PIPS-Detektor, 25 mm², 11 keV Energieauflösung @ 5,4 MeV), angeordnet hinter der Probe in der Strahlachse.
5. Teilchen induzierte Röntgenemission (µ-PIXE) und Rutherford Backscattering Spectrometry (µ-RBS).
   Hinweis: µ-Pixe und µ-RBS-Analysen bieten die räumliche Verteilung und Quantifizierung der chemischen Elemente mit einer Sub-Mikrometer-Auflösung.
   1. Verwenden Sie einen 1,5 MeV Protonen (H⁺) Microbeam (50-150 pA), konzentrierte sich bis zu einem Durchmesser von 1 µm und Scan über die gleichen Zellen des Interesses von STIM von 4 bis 8 Stunden und rund 100 x 100 µm²entdeckt.
   2. Sammeln Sie induzierte Röntgen-Photonen von Atome in der Probe (schwerer als Na) von einem hochauflösenden Si(Li) Solid-State-Detektor (145 eV Energieauflösung, @Mn-Kα) bei 45 ° von eingehenden Strahlachse positioniert. Verwenden Sie die erkannten Photonenenergie um zu identifizieren, die Art der Strahler (z.B. Z des Elements) und Röntgen-Intensität die Element-Konzentration zu bestimmen.
   3. Gleichzeitig sammeln zurückgestreute Protonen bei-135 ° mit einem Silizium-Detektor (teilweise erschöpften Detektor, 25 mm², 11 keV FWHM @ 5,4 MeV), die Gesamtzahl der eingehenden Teilchen zu messen und Röntgen-Intensitäten zu normalisieren.
      Kritische: Eine Sammlung von zertifizierten Kalibrierstandards für atomare Konzentration Quantifizierung wird verwendet, um die x-ray Detektor Antwort zu kalibrieren. Referenzmaterialien sind eine Ansammlung von atomaren Dünnschichten auf 6,3 µm Dicke Mylar Folien abgeschieden. Emittiert Energien Röntgenbereich von 0,6 (Li, K-Linie), 20,2 keV (Rh, K-Linie).

7. die Datenanalyse

1. Chemische Elemente Karten mit dem IBA-J-Plugin für ImageJzu rekonstruieren. ²⁴
   Hinweis: Spezielle Software in Form eines Plugins für ImageJ wurde entwickelt, um rohe nuklearen Mikrosonde Analysedaten zu verarbeiten. RAW-Daten entsprechen, eine Liste der Ereignisse aus Teilchenstrahl Interaktion mit Zellen, die zusammen mit Strahllage als ein chronologischer Reihenfolge aufgezeichnet werden.
   1. Das IBA-J-Plugin verwenden, um Ereignisse nach Typ sortieren: Ionenenergie (STIM) übertragen, zurückgestreuten Ionenenergie (RBS) oder Röntgen-Photonen-Energie (PIXE). Dann verarbeiten Sie separat jede Art von Daten.
   2. STIM Lageplan Dichte zu berechnen
   3. Durchschnittliche x-ray Photon Energie Spektren zu berechnen und definieren für jedes chemische Element von Interesse ein Energie-Fenster, um die räumliche Verteilung von Element abzurufen.
   4. Regionen von Interesse (ROI) (z. B. einzelne Zellen, dichte Struktur, Aggregate, etc.) zu definieren und die entsprechenden x-ray Spektren zu berechnen.
2. Die entsprechenden RBS Spektren zu analysieren, um die Gesamtzahl der einfallenden Teilchen²⁵berechnen.
3. Passen Sie Röntgen-Spektren der Gupix Software²⁶ zur Bestimmung der Konzentration von Element für jede ROI.
   Hinweis: Typische Begrenzung der Nachweisgrenze (LOD) für die Methode ist in der Reihe 1 bis 10 µg.g^-1 in Trockenmasse je nach der Ordnungszahl der Elemente (LOD sinkt mit Z).

Ergebnisse

Zellkultur und Fluoreszenz-Bildgebung Eindringmittel beschrifteten tio ₂ NPs

Wir entwarfen ein Probenhalter für Zellkultur, Zelle Handhabung sowie multimodale Analyse angepasst. Insbesondere war es wichtig, dass der Inhaber als auch nuklearen Mikrosonde Analysen und Bildgebung routinemäßigen Lichtmikroskopie berechtigt. Dieser Probenhalter basiert auf 2 µm dicken Poly...

Diskussion

Wir beschreiben eine Methode, die nützliche Informationen über das hinaus, was mit anderen bildgebenden Verfahren, vor allem auf der subzellulären Ebene möglich. Nukleare Mikrosonde Analysen bietet neben seiner bildgebenden Fähigkeit Möglichkeiten der Quantifizierung der chemischen Elemente in der Zusammensetzung von einer biologischen Probe eingeben. In der vorliegenden Arbeit wir studierte menschliche Zell-Populationen und konzentrierte sich auf die Analyse von einer gewählten Region of Interest basierend auf einer ein...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkultur
U2OS	ATCC, LGC STANDARDS	ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A ohne L-Glutamin	Dominique DUTSCHER	L0211-500
FBS 500 mL	Dominique DUTSCHER	500105U
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	11548876
L-Glutamin 200 mM, 100 mL	Invitrogen	25030024
Geneticin,  20 mL	ThermoFisher Scientific	10092772
Trypsin-EDTA 0,25% (v/v)  500 mL	ThermoFisher Scientific	11570626
Viromer	Red Lipocalyx	VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid	AddGene	#49437
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H3570	Mit Vorsicht behandeln
NPs Vorbereitung
TiO2 P25 AEROXIDE	Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC)	SIGMA-ALDRICH	T3163	Oberflächenmodifikation von NPs
Probenvorbereitung
Polycarbonatfolie	Goodfellow	CT301020
Polyetherether Keton Träger (PEEK)	Matechplast	A-239-4047
Ethanol, ACS absolut	SIGMA-ALDRICH	02860-6x1L
Chlorform, wasserfrei, 99%	SIGMA-ALDRICH	372978-1L	Achtung giftig
Formvar 100 g	Agar Scientific	AGR1201	gesundheitsschädlich. Verwendung in einer Konzentration von 10 & Mikro; g pro ml Chloroform
NaOH	SIGMA-ALDRICH	S5881-500G
Probenfixierung
Pulver, 95% Paraformaldehyd	SIGMA-ALDRICH	158127-500G	Achtung giftig. Verwendung als 4%ige Lösung in PBS
PBS (pH 7,4, ohne Ca2+ und Mg2+)	ThermoFisher Scientific	11503387
Prolong Gold Antifade Reagenz	ThermoFisher Scientific	P36934
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	93443	Gesundheitsschädlich
Kryofixierung für Proben
Flüssiger Stickstoff	Luft Flüssigkeiten sante		Schädliches
Methylbutan >=99%	SIGMA-ALDRICH	M32631-1L	Achtung giftige
Aluminium-Transferplatte	Hausgemacht
Destilliertes und entionisiertes Wasser	Hausgemacht		Hergestellt im Labor mit dem Barnstead Smart2Pure System
Parafilm	VWR	52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure	ThermoFisher Scientific	50129870
Biosicherheitsbank, Klasse II	ThermoFisher Scientific	MSC-Advantage
TC20 automatisierter Zellzähler	Biorad	145-0102SP
Zählung von Objektträgern 2 Wells	Biorad	1450016 PIPS-Detektor
, 25 mm2, 12 keV Energieauflösung @5,5 MeV	Canberra	PD25-12-100AM
Hochauflösender Si (Li)-Festkörperdetektor, 145 eVEnergieauflösung, @Mn-Kα	Oxford Instruments
Everhart-Thornley-Sekundärelektronendetektor (SED)	Orsay Physics	1-SED
RFA-Kalibrierstandard Natrium oder Chlor als NaCl	Mikromaterie	34381
RFA-Kalibrierstandard Magnesium als MgF2	Mikromaterie	34382
RFA-Kalibrierstandard Aluminium als Al-Metall	Mikromaterie	34383
RFA-Kalibrierstandard Silizium als	SiO-Mikromaterie	34384
RFA-Kalibrierstandard Schwefel als CuSx	Mikromaterie	34385
RFA-Kalibrierstandard Calcium als	CaF2-Mikromaterie	34387
RFA-Kalibrierstandard Titan als Ti-Metall	Mikromaterie	34388
RFA-Kalibrierstandard Eisen als Fe-Metall	Mikromaterie	34389
Sonicator 750W	Sonics Materials	11743619
3MM Mikrosonde	Bioblock scientific	220-05
Lyophilisator im Vakuum	Elexience	EK3147
Optisches Mikroskop Zeiss AxioObserver Z1	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	431006-9901
Motorisierter Tisch xy	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0,50 Ph2 M27 Objektiv	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 Objektiv	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	420781-9910
Zeiss Filterset 02	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	488002-9901
Zeiss Filterset 38HE	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	489038-9901
Zeiss Filterset 31	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	000000-1031-350
Chemischer Abzug	Erlab	Captair SD321
Teilchenbeschleuniger	HVEE	singletron
Software
ImageJ Software	National Institutes of Health, USA	ImageJ 1.51
SimNRA Software	Max-Planck-Institut fü r Plasmaphysik, Deutschland	SIMNRA 6.06
Gupix Software	Guelph University, Kanada	GUPIXWIN 2.2.4