Zellfreie DNA-Integritätsanalyse in Urinproben

Zusammenfassung

Es wird eine Methode zur Analyse der DNA-Integrität in der zellfreien Überstandsfraktion von Urinproben vorgeschlagen. Die Methode eignet sich zur Früherkennung urologischer Malignome und hat sich für die Früherkennung von Blasenkrebs als genau erwiesen.

Zusammenfassung

Obwohl die Anwesenheit zellfreie DNA in Plasma oder Serum von Zirkulieren einer geeigneten Quelle von Biomarkern für viele Krebsarten haben nur wenige Studien konzentrierten sich auf die mögliche Verwendung von zellfreien Urin (UCF) DNA weithin erwiesen hat. Ausgehend von den Hypothesen, die normale apoptotische Zellen produzieren stark fragmentierten DNA und dass Krebszellen schütten mehr DNA, die mögliche Rolle der UCF DNA-Integrität wurde als eine frühe Diagnosemarker ausgewertet Lage, die Unterscheidung zwischen Patienten mit Prostata- oder Blasenkrebs und gesunden Personen.

C-MYC, BCAS1, HER2 und AR: A UCF DNA Integritätsanalyse wird auf der Grundlage von vier quantitative Echtzeit - PCR - Reaktionen von vier Sequenzen , die länger als 250 bp vorgeschlagen. Sequenzen, die häufig eine erhöhte DNA-Kopienzahl in der Blase und Prostata-Krebsarten wurden für die Analyse ausgewählt, aber das Verfahren ist flexibel, und diese Gene können mit anderen Genen von inte substituiert seinsich ausruhen. Die potentielle Nützlichkeit von UCF DNA als Quelle von Biomarkern bereits für urologische Malignitäten nachgewiesen und damit den Weg geebnet für weitere Untersuchungen auf UCF DNA Charakterisierung. Die UCF DNA-Integritätstest hat den Vorteil, dass sie nicht-invasive, schnelle und einfach durchzuführen, mit nur wenigen Milliliter Urin benötigt, um die Analyse durchzuführen.

Einleitung

Zellfreie DNA kann in Blut und Urin aufgrund von Zelltod durch apoptotische oder nekrotische Mechanismen nachgewiesen werden. Zellfreie DNA in Blut wurde für diagnostische und prognostische Zwecke in verschiedenen Krankheiten intensiv untersucht, insbesondere Krebs ^1. Jedoch weniger ist über die Rolle der Harn- zellfreien (UCF) DNA bekannt. UCF DNA kann aus dem Blut , das durch die glomeruläre Filtrationssystems oder aus Zellen stammen , die mit diesem Körperflüssigkeit ² (beispielsweise Urothelzellen oder Prostatazellen) direkt in Kontakt kommen. Die Verwendung von UCF DNA als Quelle von Biomarkern ist für die Frühdiagnose von Nieren-, Blasen- und Prostatakrebs durch den hohen Anteil der UCF DNA , das direkt von der Harnwege Zellen untersucht ^3,4 hauptsächlich worden.

Wenig ist bekannt über UCF-DNA und die besten Methoden zur Isolierung und Charakterisierung von ihm. Angesichts der Hypothese, dass die Tumorzellen freizusetzen längere DNA-Fragmente als normale Zellen, die Auswertungsder zellfreien DNA - Integrität wurde in einem Versuch untersucht, ⁵ den Ursprung der DNA in den Blutkreislauf zu erläutern. Einige Studien haben gezeigt , daß zellfreie DNA Integrität im Blut einen guten diagnostischen Test für viele Krebsarten darstellt ^6, und die gleiche Hypothese in bezug auf Urin ^7-9 vorgeschlagen.

Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren zur UCF DNA Integritätsanalyse mit einer potentiellen Anwendung auf Blasen- und Prostatakrebserkennung. Insbesondere wurde die Integrität der UCF DNA - Fragmente mehr als 250 bp in 4 Regionen getestet bekannt , eine erhöhte DNA - Kopienzahl in soliden Tumoren, einschließlich Prostata- und Blasenkrebs: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) und AR (Xq12) ^14.10. Spezifische Onkogene, anstatt Zufallssequenzen wurden gewählt, um die Wahrscheinlichkeit, sie in der zellfreie Fraktion von Krebspatienten zu erhöhen. Einer der wichtigsten Vorteile derdieses Verfahren ist, dass es flexibel ist und dass andere Bereiche können auch auf der Grundlage der Tumorart und Eigenschaften gewählt werden.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Richtlinien des IRST Human Research Ethics Committee.

HINWEIS: In diesem Protokoll isolierten wir DNA aus Urinproben eine Integritätsanalyse UCF DNA durchzuführen. LNCaP und MRC-Zelllinien wurden verwendet Standards zu konstruieren. Techniken wie DNA - Extraktion, DNA - Quantifizierung (Spektralphotometer und real-time PCR für das Kontroll - Gen, STOX1) und Echtzeit - PCR für spezifische Onkogene wurden durchgeführt (Abbildung 1).

1. Urin Erhebung und Verarbeitung

1. Besorgen Sie sich eine saubere Beifang ersten Morgenurinprobe in einem sauberen, trockenen, Plastikbecher. Sammeln mindestens 50 ml der Urinprobe.
2. Aufrechterhaltung des Urins bei 4 ° C für maximal 3 Stunden und an das Labor bei der gleichen Temperatur zu senden.
3. Mischen Sie jede Probe zweimal unmittelbar nach der Ankunft im Labor und den Transfer in zwei 50-ml konischen Boden Polypropylen-Röhrchen zu invertieren.
4. Zentrifugieren Sie die Röhrchenbei 850 xg für 10 min bei 4 ° C oder bei Raumtemperatur.
5. Vorsichtig 10 mL übertragen des oberen Teils des Urins Überstand in zwei 5-ml-Röhrchen, mit mindestens 2 ml des Überstandes über dem Zellpellet zu verlassen.
   HINWEIS: Übertragen des oberen Teils des Überstands verringert das Risiko einer Kontamination durch Zellen oder Zelltrümmer. Es gibt keine klare Abgrenzung zwischen den oberen und unteren Teil.
6. Entsorgen Sie das Pellet und gefrieren sofort den Überstand bei -80 ° C bis zur Verwendung.

2. DNA-Isolierung aus dem Urin Überstand und Zelllinien

HINWEIS: Trennen Sie die DNA aus einer Zelllinie (zB LNCap für Prostatakrebs oder MRC für Blasenkrebs) unter Verwendung eines kommerziellen Kits und nach den Anweisungen des Herstellers. Isolierung von DNA aus dem Urin Überstand sollte mit dem kommerziellen Protokoll durchgeführt werden, wie folgt geändert:

1. Auftauen ein Aliquot des Urins Überstand bei Raumtemperatur.
2. Vortex und mischen Sie die Urinprobe und 1 ml des Urins Überstand in eine klare 5-ml-Röhrchen. Frieren Sie den Restharn bei -80 ° C.
3. Füge 100 & mgr; l Proteinase K direkt auf die Probe.
4. 1 ml AL-Puffer auf die Probe und mischen Sie gut durch Pipettieren.
5. Schließen die Röhrchen und Inkubation der Proben bei 56 ° C für 15 min.
6. Während der Inkubation vorbereiten eine Spalte für jede Probe und bereiten die Waschpuffer, AW1 und AW2, gemäß den Anweisungen des Herstellers (fügen Sie die angegebene Menge von 100% Ethanol).
7. Bringen Sie die Proben wieder auf Raumtemperatur und 1 mL absolutem Ethanol. Mischen Sie vollständig durch Pipettieren.
8. Hinzufügen 650 & mgr; l der Mischung in Schritt erhaltenen 2,7 auf die Säule und Zentrifugieren es bei 6.000 × g für 1 min.
9. Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses und legen Sie die Spalte auf eine neue, saubere Sammelröhrchen enthält. Wiederholen Sie die Schritte 2.8 und 2.9 bis sich das gesamte Probenmischung verwendet wurde (5-mal).
10. In 500 &# 181; l Puffer AW1 ohne den oberen Rand der Säule zu benetzen. Zentrifugieren es bei 6000 × g für 1 min.
11. Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses enthält, und ersetzen sie durch eine neue, saubere Sammelröhrchen.
12. Hinzufügen 500 ul Puffer AW2 ohne den oberen Rand der Säule zu benetzen. Zentrifuge bei voller Geschwindigkeit (20.000 × g) für 3 min.
13. Entsorgen Sie das Rohr des Durchflusses enthält, und ersetzen sie durch eine neue, saubere Sammelröhrchen.
14. Wiederholen Sie Schritt 2.12 restliche Waschpuffer zu entfernen.
15. Die Säule in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen. Zugabe von 50 & mgr; l Elutionspuffer AE und warten 7 min, um sicherzustellen, dass der Puffer benetzt die Säule.
16. Zentrifugieren es bei 8000 × g für 1 min.
17. Pipettieren Eluent aus Schritt 2.15 in die Mini-Säule zentrifugieren und es bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute die maximale Rückgewinnung von DNA zu gewährleisten.

3. DNA-Quantifizierung und Verdünnung

1. Mit einem Spektralphotometer, führen Sie die Quantifizierung von DNA aus Both die Zelllinie und die Urinproben Überstand. Verwenden Sie 2 ul der Probe auf einem Benchtop-Spektrometer, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Verdünne die Proben UCF DNA mit einer Konzentration von 1 ng / & mgr; l zu erhalten und speichern die DNA bei -20 ° C, bis die DNA Integritätsanalyse.
   HINWEIS: Wenn die DNA-Menge nicht ausreicht, um mit Echtzeit-PCR (mindestens 100 ng), um fortzufahren, führen Sie eine neue DNA-Isolierungsverfahren.
3. Verdünne die DNA aus der Zelllinie Proben zu erhalten sechs Standards mit unterschiedlichen Konzentrationen: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 und 2 ng / & mgr; l, jeweils mit einem Volumen von 100 ul (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5 und ST6). Bewahren Sie die Zelllinie DNA-Standards bei -20 ° C, bis die DNA-Integritätsanalyse.

4. DNA-Integritätstest - PCR

1. Auftauen die Primer (die Konzentration ist abhängig von der Art des Assays), Grün supermix, Zelllinie DNA-Standards und UCF DNA verdünnten Proben auf Eis.
2. Bereiten Streifen Rohre in der Platte foder der 72-Well-Rotorscheibe. Aliquot 10 ul in zweifacher Ausfertigung für jeden Standard und verdünnte Probe und 10 & mgr; l RNase-freies Wasser für die negative Kontrolle.
3. Bereiten einer Mischung aus 1 & mgr; l jedes Primers (die Konzentrationen sind in Tabelle 1 angegeben), 12,5 & mgr; l des grünen supermix und 6,5 & mgr; l RNase-freiem Wasser für jede Probe. Wenn die Mischung vorbereitet, verwenden Sie die folgende Anzahl der Proben: 6-Normen für 2 Wiederholungen, Anzahl der Proben für 2 Wiederholungen, negative Kontrolle für 2 Wiederholungen und 2 zusätzliche Proben.
4. Aliquot 15 ul der Mischung in jede Vertiefung. Sie nicht die Rohre Pipette oder drehen.
5. Starten Sie das Protokoll mit den Bedingungen PCR in Tabelle 1 angegeben.
   HINWEIS: Für die UCF-DNA-Wert, 29 DNA-Proben für jede Echtzeit-Experiment verarbeitet wurden unter Verwendung des 72-Well-Rotorscheibe: 29 x 2 Proben + 6 x 2 Standards + negative Kontrolle x 2 = 72 (UCF DNA-Wert).
   HINWEIS: Das Protokoll für die Integritätsanalyse UCF DNA kann auchdurchgeführt andere Echtzeit-PCR Instrument (wenn ein anderes Gerät verwenden, können hinzugefügt werden müssen, ROX-Farbstoff).

5. DNA-Integritätstest - Datenanalyse und Interpretation

HINWEIS: Die DNA UCF - Wert für jede Probe wurde durch eine Echtzeit - Gerät-Erfassungssystem - Software unter Verwendung einer Standardkurve Konstruktion für jede einzelne PCR - Gen Auswerte- und unter Verwendung von Standardkurve Interpolation erhalten, wie zuvor beschrieben , ^7-9 (Abbildung 2).

1. Bewerten Sie die Replikate; Probe repliziert mit einem Unterschied ≥1 Ct verworfen werden müssen, und in einem zweiten Versuch erneut ausgewertet.
2. Berechnen Sie die mittlere Ct für jede Probe und prüfen Proben mit einem Ct-Wert ≤ 36.
3. Bewerten Sie die Spezifität der PCR-Produkte Schmelzanalyse.
4. Bewerten Sie die Konzentration jedes Amplikon durch Interpolation mit der Standardkurve; einen Konzentrationswert (ng / ul) für jedes Amplifikat erhalten.

Ergebnisse

Die gesamte freie DNA-Konzentration war quantifizierbare spektrophotometrisch für alle Proben analysiert, wobei eine Reihe von zwischen 1,51 und 138 ng / & mgr; l zeigt. Fünf Kontrollproben wurden für die Reproduzierbarkeit der Daten verwendet: zwei unabhängige Echtzeit - Experimente durchgeführt wurden , für c-MYC, HER2, BCAS1, AR, und STOX1. Die Variationskoeffizienten (CV) wurden dann für jedes Gen (Tabelle 2) berechnet...

Diskussion

UCF DNA Integritätsanalyse ist eine neue, nicht-invasive Methode zur Beurteilung DNA Integrität im Urin. Es wurde für die Frühdiagnose von Blasen ⁹ und Prostatakrebs ^7,8 kürzlich vorgeschlagen. Eine Reihe von Vor- und Nachteilen der UCF DNA-Integritätstest werden hier diskutiert, zusammen mit Zukunftsperspektiven.

Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist, daß es eine kostengünstige, nicht-invasive Methode bietet und ein einfaches Protokoll Urin als potentielle Quelle von Bi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304
iQ SYBR  Grün Supermix, 100 x 50 & Mikro; L rxns, 2,5 mL (2 x 1,25 mL)	Biorad	1708880
IDT benutzerdefinierte DNA-Oligos	IDT		HPLC-Aufreinigung, 100 nMol DNA-Oligo
NanoDrop 1000 Spektralphotometer	Thermo Scientific		Andere spektrophotometrische Methoden könnten ebenfalls zur Quantifizierung von DNA verwendet werden
Rotor-Gen 6000	Corbett		Ein weiteres Real-Time-PCR-Gerät könnte ebenfalls verwendet werden
Mikrozentrifuge
eine Zentrifuge für 50-ml-Röhrchen
Inkubator-80
° C Gefrierschrank-20
&Grad; C Gefrierschrank
10 μ L Pipette
20 μ L Pipette
200 μ L Pipette
1.000 μ L Pipettenspitzen
(10; 20; 200; 1.000)
1,5 mL Röhrchen
50 mL Röhrchen
15 mL Röhrchen
Rotor-Disc 72 Rotor	Corbett	9018899
Strip Tubes and Caps, 0,1 mL (250)	Qiagen	981103
Entnahmeröhrchen (2 mL)	Qiagen	19201
Puffer AL (264 mL)	Qiagen	19075
Proteinase K (10 mL)	Qiagen	19133